水杨酸调控乙烯反应因子提高雏菊切花保鲜效果_陈星星.pdf

乙烯反应因子是植物特有的转录因子，在乙烯释放、胁迫防御等生理生化反应中发挥重要作用。然而关于雏菊（）基因家族的组成特征及其在切花过程中的功能作用知之甚少。结果表明，在雏菊共鉴定出 个乙烯反应因子（），其蛋白质长度 ，相对分子量 ，等电点 。系统发育和蛋白质序列比对结果表明，这 个 可分为 个亚家族（、和 ）并具有 保守结构域和、等保守序列。基因结构和启动子分析表明，的启动子中含有许多细胞分化和植物激素相关的顺式元件，其中 亚家族的 同时含有衰亡顺式作用元件和水杨酸响应元件，表明 在切花保鲜中可能响应水杨酸（）的施用。转录组分析（）表明，在 处理下转录水平明显降低，结果与 结果高度一致；此外，处理下，在花序中的表达模式与乙烯排放速率呈显著（）线性正相关关系，表明 是 调控雏菊乙烯合成的指示基因，且施用 显著增加了雏菊切花的瓶插寿命。综上，水杨酸可通过抑制雏菊切花过程中乙烯反应因子（）的转录表达，从而降低乙烯排放速率以延长雏菊切花的瓶插寿命。关键词：雏菊；瓶插寿命；水杨酸；乙烯反应因子；全基因组；基因表达水平 中图分类号：文献标志码：文章编号：（）收稿日期：基金课题：河南省高等职业学校青年骨干教师培养计划（编号：）；河南省高等教育教学改革研究与实践项目（编号：）；河南农业职业学院科技创新人才支持计划（编号：）。作者简介：陈星星（），女，河南南阳人，硕士，副教授，主要从事花卉栽培、花卉采后处理与养护的教学及科学研究。：。雏菊（）是世界花卉贸易中最具商业价值的观赏花卉之一，由于其花色艳丽、花姿优美、花型洋溢大方而广受市场追捧。然而，雏菊品种因花朵面积较宽，蒸腾失水量大造成花瓣散乱等现象而不耐插切花，且当其浸在花瓶溶液时，茎端处易被微生物附生污染，使得瓶插寿命进一步缩短。采后导致衰老进程加快是影响切花适销性的关键因素，引起采后衰老的关键因素包括碳水化合物消耗严重、呼吸速率升高、茎部微生物附生积水、花序失水、活性氧累积、抗氧化系统活性降低及乙烯（）产量增加，其中花朵的衰老与乙烯释放速率、单位产量密切相关，衰老速率对乙烯合成高度敏感并受乙烯转导通路调控。在植物体中，乙烯的生物学功能通过乙烯信号转导途径实现，乙烯反应因子（）作为乙烯信号转导通路中最重要的元件，在乙烯的生物合成及功能表达中起着至关重要的作用。位于乙烯信号通路下游，是典型的植物特异性转录因子，同时也是植物 超家族的重要成员，参与植物生理生化和非生物胁迫反应。家族成员的特征是存在一个 结合域，该结构域可与下游启动子区域的 盒、或 重复序列的顺式元件相互作用从而直接或间接作用于靶向基因，根据 结合域的数量和基序相似性，家族可分为 个亚家族。近几十年来，从植物中分离和克隆了许多 基因，这些基因参与调控生物体生理发育、细胞增殖、胁迫反应和激素合成，但有研究表明，并不是所有的 皆作用于乙烯的生物合成，有些 可能对植物相关生理途径无任何功能，目前关于菊花 的组成及功能鲜有研究涉及。水杨酸（）是一种广泛存在于植物中的酚类化合物，是被广泛使用的植物生长调节剂。在高等植物中，通过莽草酸循环的苯丙氨酸途径和异分支酸途径合成，苯丙氨酸途径在细胞质中起作用，而异分支酸途径在叶绿体中表达。可介导植江苏农业科学 年第 卷第 期物的防御反应并调节多种生理过程，如种子发芽、激活免疫系统、开花和衰老。近年来，由于 在水果和蔬菜采后质量保持方面表现出良好效果，受到了越来越多的关注。据报道，可通过抑制乙烯前体物的转化以介导乙烯的生物合成，从而影响花卉采后的衰老代谢进程。以上研究为水杨酸应用植物保鲜提供了一定的理论依据，然而关于水杨酸如何介导乙烯合成的机制尚不清楚，且关于水杨酸如何作用于菊花的采后保鲜更是鲜有涉及。基于此，本研究挖掘了对雏菊 的组成与特征，并探索了水杨酸对雏菊靶向 的影响。研究结果可为揭示水杨酸应用切花保鲜提供分子理论依据。材料与方法 试验材料和试验方法试验于 年 月在河南农业职业学院园艺培养室中进行。供试雏菊品种为塔索，来自河南省洛阳千卉谷农业有限公司。选择发育相近、舌状花完全开放、花朵健壮、花茎硬挺的雏菊作为试材，将雏菊根茎于水中剪切成斜口型，保留花梗长度约 ，将切花插入装有 常规培养液（无水杨酸）的三角锥形瓶（），雏菊花茎切口悬于培养液中，每瓶 株，插瓶深度约，瓶口采用透气薄膜封住，每 更换 次营养液，并在、取样保存于 环境。水杨酸处理即更换培养液时喷施 的 水杨酸溶液，该水杨酸质量浓度已被证明是菊花切花保鲜的最佳浓度，对照加入相同体积蒸馏水。基因家族成员的鉴定及理化性质分析从菊科基因组库（：）中下载菊花全基因组数据，基于（）平台检索菊花 家族成员，将搜索结果提交到 保 守 域 搜 索 平 台（：）。手动筛选含 结构域序列，初步筛选得到 条序列，分别依次命名为 。去除残缺及未定义序列，共得到 条完整序列，分别命名为 ，将 提 交 至 蛋 白 质 理 化 性 质 程 序（：）以预测全长氨基酸序列的理化性质，同时 蛋白质序列提交 （：）预测亚细胞定位。系统发育、基因结构、保守基序和顺式作用元件分析通过拟南芥数据库（：）获取拟南芥的 基因家族的氨基酸序列。将 与同 源 拟 南 芥 氨 基 酸 序 列（）数据共同整合为特定的 文件，并借助 在线软件（：）采用邻接法构建系统发育树，设置为，其余参数为默认值。基因结构文件取自菊花基因组数据库 文件，利用 在线工具（：）对保守基序进行预测，简介模体（）设置为，其余参数默认。基于 线上工具（：）以 预 测 的启动子顺式调控作用元件。转录组数据的获取与分析通过基因组数据库下载的 个 转录组数据和 的序列读取数据库（）下载雏菊的转录组数据（），将下载的 默认格式文件转换为 文件，再导入 软件获取质控报告。文件利用 、软件指令去除低质量数据并进行序列对比，以获取 表达量，通过 在线工具对提取的 家族成员表达量数据构建热图。染色体定位和同线性分析使用 的 方法定位 个 的染色体位置。使用的预序列从 在线平台获取（：）。采 用 的 工具链接多组连锁群（）之间的关系进行共线性可视化，使用默认参数的 并设置为 。、验证表达数据及乙烯排放速率测定利用气相色谱仪同步测定雏菊花瓣的乙烯释放速率，具体步骤参考史国安等的方法。测序用于交叉验证 的基因表达数据。每次处理完成后，分别从 株植株中收获茎、叶和花序组织，立即冷冻在液氮中，并储存在 环境用于 分离和 分析，提取、纯化雏菊，将纯化基因分为 个部分，一部分用于 分析，其看家基因、反应程序及条件参照李菲等的江苏农业科学 年第 卷第 期研究，目标基因序列相关引物采用 软件设计（：、：），其相对表达水平采用 断层扫描方法算法表示。另一部分运送至上海美吉生物医药科技有限公司，使用 进行 测序文库构建和数据分析，基因转录水平的结果以每百万读数（）的转录物水平表示。数据处理与分析借助 进行数据预处理，采用 进行单因素方差分析及 检验，进行相关图形绘制。结果与分析 基因家族理化性质特征分析将 基因序列与拟南芥数据库中的 蛋白序列进行 对比，结果表明，在雏菊的基因组 中 共 鉴 定 出 个 基 因，分 别 命 名 为、和（表）。由表 可知，家族蛋白质长度范围为 ，蛋白质相对分子量在 之间，等电点范围为 ，其中、为酸性蛋白，其他则为碱性蛋白。亚细胞定位预测显示，、位于细胞质中，、位于细胞核中，、位于线粒体中。表 基因家族理化性质特征分析基因名基因转录 蛋白质长度（）分子量（）等电点亚细胞定位细胞质细胞核细胞核细胞质线粒体细胞核线粒体 系统发育、保守基序和氨基酸序列比对分析采用邻接法分析 个 和 个拟南芥直系同源物之间的系统发育关系，对 全长蛋白质序列进行多重比，根据结构域分析，将 个 基因分为 个亚家族（、和 ），其中、属于 亚家族，属于 亚家族，、属于 亚家族。分析了 个 的非翻译区（）、编码序列（）和内含子的基因结构。结果表明，除 亚家族的、亚家族中的 均具有 个内含子外，其他同一亚家族的 基因内含子数目相同，且外显子 内含子结构相似（图 ）。预测的保守基序显示，在 个 蛋白中都表现出保守性（图 ）。此外，只存在于 亚家族成员中，而 只存在于 亚家族成员中，且 亚家族的 不具有 。结构域序列进行的多重比对表明，全长氨基酸序列相似的 在 结构域上存在高度相似性（图 ）。这些发现表明，转录因子的结构和功能具有相似性，尤其是属于同一亚家族的 转录因子。共线性分析本研究中，基于 基因序列特征共得到 个连锁群（），个 基因分别被定位在、中，且各 的分布无重合定位现象（图）。基于 对菊科和拟南芥包含的 基因进行了同线性分析，鉴定出 个菊科 基因与拟南芥 基因具有相似性；而在 个菊科 基因中发现 个 基因全基因组复制现象；在 个 基因中发现了 个共线基因（占比.），表明该 个 基因存在全基因组复制事件，它们主要分布在 个（、）上，且 隶属于这 个共线基因之一。此外，共线性分析显示雏菊中的、和 隶属于 个串联共线的 基因，表明、存在基因串联重复序列（图）。基因启动子的顺式作用元件分析基于 数据库分析了 个 基因的启动子的顺式作用元件。分析结果表明，包含 个顺式作用元件：响应元件、赤霉素响应元件、厌氧诱导元件、低温顺式作用元件、下降过程顺式元件、衰亡顺式作用元件、水杨酸江苏农业科学 年第 卷第 期响应元件、生长素响应元件、防御和应激反应元件、创伤胁迫响应元件；但不同的 在启动子顺式元件组成上存在差异。例如，仅 存在创伤 胁 迫 响 应 元 件，仅、特异性存在防御和应激反应元件，仅、含有衰亡顺式作用 元 件；、不含水杨酸响应元件。以上结果表明，、同时具有水杨酸响应原件和衰亡衰亡顺式作用元件，意味着这 个转录因子可能在切花保鲜中发挥作用。基于 分析切花中 的表达模式由图 可知，就 在不同组织的表达水平而言，以花序（）和侧芽（）中的表达量高于茎秆（）和叶片（），其中地上部组织中，各基因在花序中的表达水平相对较高，尤其是、和，而、和 在茎、叶中皆超低表达。就基因表达总量来看，和 较高。就水杨酸处理（）和无水杨酸处理（）的表达量对比结果来看，各基因在茎秆中的表达量差异较小；在叶片中除 外，其他基因在 处理与 的 表 达 量 差 异 也 较 小；而 在 侧 芽 中，、和 的 处理与 间的差异 较 小；同 理，花 序 中 的、和 的 处理与 间的差异较小。总体来看，在任一组织中，仅 基因的 处理与 间差异较大，且均为 大于 处理，即 处理可诱导 基因发生下调表达，初步表明 基因可能是雏菊切花过程中调控植株衰老的潜在基因，应在后续研究中予以重视。基于 分析目标基因的表达模式对水杨酸处理的响应由图 可知，在各组织中的相对表达量表现为茎秆 叶片 花序 侧芽，而施用水杨酸处理总体上没有改变 在各组织中的江苏农业科学 年第 卷第 期表达模式，仅显著或极显著降低了各组织的相对表达量，尤其在花序中。由图 可知，在切花后的 中，在花序中的表达量呈先升高后降低的趋势，其表达峰值为切花后的，此后开始逐渐降低，但任一时间点中，水杨酸处理均显著或极显著降低了的表达水平，尤其在切花江苏农业科学 年第 卷第 期后的 。水杨酸处理对雏菊切花乙烯排放速率及瓶插寿命的影响由图 可知，切花后雏菊花序的乙烯排放速率与 在花序中的表达模式基于趋于一致，均呈先升高后降低模式，均在切花后的 达到峰值；而在水杨酸处理后期的排放速率与 相比在任一切花时间点均降低；同时水杨酸处理后雏菊的瓶插寿命为 （），为 （），瓶插寿命显著延长了 。对切花后雏菊花序的乙烯排放速率和 表达量进行线性分析（图）发现，两者存在显著（）的线性正相关关系，这进一步显示 可能是调控乙烯排放的靶基因。讨论与结论改变遗传生理、改善瓶插环境及将生物化学策略应用于切花保鲜，以延缓或抑制乙烯的生物合成是延缓切花衰老的主要策略。探索乙烯反应因子组成特征及响应机制，有望提高切花保鲜效果，从而 提 高 观 赏 性 及 经 济 效 益。本 研 究 中 基 于 检索和蛋白质 对比发现，在雏菊中共鉴定出 个乙烯反应因子（），和 预测表明，基因蛋白质长度为 ，相对分子量为 ，等电点为 ；其中、为酸性蛋白，其他则为碱性蛋白。亚细胞定位预测显示，在细胞质、细胞核、线粒体中均有分布。江苏农业科学 年第 卷第 期 基于全长蛋白质序列构建的系统发育关系分析表明，个 共归属于 个亚家族（、和 ），其中、属于 亚家族，属于 亚家族，、属于 亚家族。这与之前研究中得出的结论存在差异：一般而言，高等植物中 往往与、基因结构存在差异，所以不归属于同一亚家族中；造成差异的原因可能是菊科植物早期基因组发生变异分化的结果。此外，同源性分析表明，这 个基因中只有 个拟南芥同源直系物，雏菊基因数量的增加表明在雏菊进化史中经历了基因复制事件。在漫长的生物进化史中，全基因组复制事件和串联复制事件对菊科 转录因子基因的增加具有重要影响。同线性分析显示，存在全基因组重复，而、和 与基因串联重复相关（图）。本研究中，基因结构分析表明，同一亚家族的基因具有相对相似和保守的内含子 外显子结构和基序，本研究确定了 个 基因中的 个保守基序，结构域中的保守 存在于所有 个 基因中；而 和 分别在 和 亚家族中保守，这个结果支持了系统发育分析和亚科分类的可靠性。多重比对显示，这 个 蛋白具有 结构域和其他保守序列，例如 和 元件。大量研究表明，亚家族中的蛋白质含有一个保守的第 顺序列缬氨酸残基，结构域中的保守缬氨酸残基往往决定着 与 结构域元件的特异性。总之，以上结果表明，个 基因均高度保守，而 亚家族的成员可能在雏菊胁迫耐受与发育生理中发挥作用。基因的翻译、转录与表达受顺式作用元件和反式作用因子调节。本研究结果表明，不同 基因的启动子包含多种胁迫应激反应元件，如厌氧诱导元件、防御和应激反应元件及创伤胁迫响应元件（图）。一些 基因启动子包含下降过程顺式元件、衰亡顺式作用元件以及激素（、）响应元件，这表明 基因也可能通过调节激素分泌与凋亡代谢网络从而调控植物的表型衰老，。此外，启动子顺式作用元件分析发现，、同时含有衰亡顺式作用元件和水杨酸响应元件，意味着该 个转录因子可能在水杨酸应用于切花保鲜中发挥作用。基于 转录组的相关性热图分析表明，不同的 基因在不同组织中的表达模式存在差异，且对施用水杨酸的响应程度也不同。整体而言，不同组织中各 基因的转录水平表现为花序 侧芽 叶片 茎秆，施用水杨酸条件下，的转录水平显著或极显著下调，基因表达结果与 转录结果高度一致，表明该结果可靠。分析表明，的相对表达量呈先升高后降低的趋势，其表达峰值为切花后的 ，且乙烯排放速率与 表达模式趋于一致，线性相关分析表明，二者呈显著正相关关系（）。此外，外源施用水杨酸使得雏菊的瓶插寿命显著延长了 。本研究仅基于转录表达结果验证了雏菊花序中 的表达模式及表型生理，然而在不同组织中不同的 的功能租用可能存在差异，通过过表达和基因沉默技术检测这 个 的具体分子机制是下一步的研究方向。本研究通过全基因组综合分析结果表明，在雏江苏农业科学 年第 卷第 期菊中共鉴定得到 个乙烯反应因子（），和 预测表明，蛋白质长度为 ，相对分子量为 ，等电点为 ，且在细胞质、细胞核、线粒体中均有分布。系统发育树和蛋白质序列的多重比对表 明，这 个 可 归 属 于 个 亚 家 族（、和 ）并携带 保守结构域和、等保守序列，因此可能受植物激素调节。基因结构和启动子分析表明，不同 的启动子中存在许多与细胞分化反应和植物 激 素 相 关 的 顺 式 元 件，其 中、同时含有衰亡顺式作用元件和水杨酸响应元件，意味着这 个转录因子可能在水杨酸应用于切花保鲜中发挥作用。转录组分析（）表明，与不施用水杨酸处理（）相比，水杨酸处理后不同组织中 的转录水平均明显降低，初步表明 是 调控雏菊乙烯生物合成的潜在基因，结果与 结果高度一致。此外，施用水杨酸处理下，在花序中的表达模式与乙烯排放速率存在显著线性正相关关系，证实了 是调控雏菊乙烯合成的指示基因，且水杨酸显著延长了雏菊切花的瓶插寿命。研究结果为揭示乙烯反应因子在雏菊切花衰老过程中的功能提供了分子基础，也为水杨酸应用切花保鲜提供了理论依据。参考文献：，（），（）：赵 莉 茶多酚与海藻酸钠膜对鲜切雏菊保鲜的影响 北方园艺，（）：，（），（）：，（）：史国安，王 依，史 田，等 纳米银和乙烯利预处理调控伊藤牡丹巴茨拉切花瓶插品质 林业科学，（）：董亚茹，李茹霞，赵东晓，等 个桑树 转录因子的生物信息学及表达分析 山东农业科学，（）：许世达，耿兴敏，王露露 植物乙烯响应因子（）的结构、功能及表达调控研究进展 浙江农林大学学报，（）：悦曼芳，张 春，吴忠义 植物转录因子 家族蛋白结构和功能的研究进展 生物技术通报，（）：，（）：胡小京，赵 云，关元静 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