罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠抗氧化能力及炎症反应的影响.pdf

动物营养学报，（）：罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠抗氧化能力及炎症反应的影响李浩雨 徐兴军，李雪涵 张伟伟，邵淑丽，（齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，齐齐哈尔；抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室，齐齐哈尔）摘 要：本试验旨在探究罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺（）小鼠抗氧化能力及炎症反应的影响。将 只 周龄无特定病原体（）级雄性 小鼠按体质量随机分为 组，每组 只，组间体质量差异不显著（）。空白对照组不进行慢性睡眠剥夺，其他 组使用改良多水平台睡眠剥夺法进行为期 的慢性睡眠剥夺，以构建 模型。造模成功后灌胃 周，其中低、中、高浓度罗汉果总黄酮组（分别简称低、中、高酮组）分别灌胃、（）的罗汉果总黄酮（溶于 的 溶液），空白对照组与模型对照组灌胃 的生理盐水，阳性对照组灌胃 （）的褪黑素（溶于 的 溶液），二甲基亚砜（）对照组灌胃 的 溶液。利用相应试剂盒测定 小鼠血清和大脑中总抗氧化能力（）、丙二醛（）含量、血红素氧合酶（）活性、核因子（）和肿瘤坏死因子（）含量，利用实时荧光定量 测定血清和大脑中核因子 相关因子（）、相对表达量。结果显示：）低、中、高酮组 小鼠大脑中 显著高于模型对照组（），中、高酮组 小鼠大脑中 活性显著高于模型对照组和 对照组（）。低、中、高酮组 小鼠血清中、活性显著高于模型对照组和 对照组（），大脑和血清中、含量显著低于模型对照组和 对照组（）。）低、中、高酮组 小鼠大脑和血清中 相对表达量显著高于模型对照组及 对照组（）；中、高酮组 小鼠大脑和血清中 相对表达量显著高于模型对照组及 对照组（）；低、中、高酮组 小鼠大脑和血清中、相对表达量显著低于模型对照组及 对照组（）。综上所述，罗汉果总黄酮可提高 小鼠大脑、血清中抗氧化酶活性及相关基因 相对表达量，降低大脑、血清中 与炎症因子含量及相关基因 相对表达量，改善 小鼠的氧化应激及炎症反应。关键词：罗汉果总黄酮；慢性睡眠剥夺；抗氧化；炎症因子中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：黑龙江省省属本科高校基本科研业务费面上项目（）作者简介：李浩雨（），女，黑龙江齐齐哈尔人，硕士研究生，从事动物生理生态学研究。：通信作者：徐兴军，教授，硕士生导师，：人约有 的时间是在睡眠中度过的，在睡眠期间，身体的生理功能会发生许多变化，如细胞修复、激素分泌及免疫防御功能调节等，因此，保持充足的睡眠至关重要。而在现代社会，由于压力、睡前使用电子设备等因素导致褪黑激素分泌的变化，从而导致睡眠不足，即睡眠剥夺。睡 期李浩雨等：罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠抗氧化能力及炎症反应的影响眠剥夺分为短期的急性睡眠剥夺（，）和 长 期 的 慢 性 睡 眠 剥 夺（，），急性睡眠剥夺一般持续几小时至几十小时不等，而慢性睡眠剥夺则是指持续数天乃至数个月的连续剥夺。慢性睡眠剥夺会导致氧化应激损伤以及一系列炎症反应的产生，最终引发各种疾病。等研究表明，慢性睡眠剥夺会使小胶质细胞处于持续激活的状态，促进其吞噬活动，可能使大脑受到进一步伤害。等研究表明，慢性睡眠剥夺激活神经胶质细胞，促进促炎细胞因子释放，抑制抗炎细胞因子释放。张晓宁研究表明，慢性睡眠剥夺可诱导小鼠体内氧化应激反应产生，最终导致慢性炎症。以上研究表明，慢性睡眠剥夺严重影响动物生命健康。目前治疗睡眠障碍及缓解其损伤的常用药物为褪黑素，但褪黑素是一种内源性激素，虽可调节生物昼夜节律、保障睡眠，但长期使用的安全性并不明确，因此寻找安全有效的药物缓解或治疗慢性睡眠剥夺带来的损伤十分重要。总 抗 氧 化 能 力（，）是人体内各种抗氧化物质和抗氧化酶等共同构成的总的抗氧化水平，通常用来评价生物活性物质的抗氧化能力，可一定程度上反映机体清除活性氧（，）的能力。积累过多会诱导脂质过氧化的产生，是脂质过氧化的终产物，可作为反映脂质过氧化程度的指标。核因子 相关因子（，）被视为氧化应激反应的内源性主要调节因子，可协调下游抗氧化因子和相解毒酶的表达来对抗环境伤害和内源性应激源，以适应不同应激条件。血红素氧合酶（，）是一种重要的内源性抗氧化剂，可以在 的调控下通过清除羟自由基、超氧阴离子或单线态氧来抑制脂质或蛋白质的过氧化反应，发挥其抗氧化作用。核因子（，）是一种多功能核转录因子，诱导细胞促炎因子如肿瘤坏死因子（，）等及一氧化氮合酶（，）、环氧合酶（，）等的表达，导致炎症反应和细胞损伤的产生。可通过多种机制负性调控 信号通路，如 诱导细胞活性增加降低细胞内 水平来抑制氧化应激介导的 激活。以上研究表明，及其所调控的下游抗氧化因子在机体对抗氧化应激损伤及炎症反应产生的过程中发挥关键作用，同时 可受到节律基因和 的双向调节，使生物节律发生改变，进而影响睡眠。因此，保证氧化还原系统内稳态对维持生物昼夜节律稳定及睡眠具有重要作用。罗汉果（）为葫芦科多年生藤本植物，主要产于我国广西壮族自治区，其果实是一种重要的药食两用材料，含多种营养元素及活性成分。邵佩等研究表明，罗汉果中提取的黄酮类物质具有良好的体外抗氧化作用。陈功等研究表明，罗汉果黄酮增加运动大鼠供血能力，并提高氧运输能力。但应用罗汉果黄酮治疗慢性睡眠剥夺造成的氧化损伤及炎症反应的研究尚未见报道。因此，本试验使用不同浓度的罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠进行灌胃，从基因及酶学等水平上探究罗汉果总黄酮能否通过调控慢性睡眠剥夺小鼠血清及大脑中、等抗氧化因子与、等炎症因子及其相关基因的表达，缓解慢性睡眠剥夺对机体造成的氧化应激损伤及炎症反应。材料与方法 试验材料 试验材料：罗汉果总黄酮（纯度为），购自成都某生物科技有限公司。试验动物：以购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司的 只 周龄无特定病原体（）级雄性 小鼠为研究对象，体质量（）。仪器设备：酶标仪（帝肯上海贸易有限公司）、恒温干燥箱（天津市南郊区东泥沽铁工厂）、（）超低温冰箱（北京天地精仪科技有限公司）、旋涡混合器（德国 公司）、电子天平（德国赛多利斯股份公司）、大功率磁力加热搅拌器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）、实时荧光定量 仪（美国应用生物系统公司）、高速台式冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、数显恒温水浴锅（上海三发科学仪器有限公司）、离心机（上海安亭科学仪器厂）、可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。主要试剂：蛋白定量试剂盒、检动 物 营 养 学 报 卷测试剂盒、检测试剂盒、酶联免疫吸附测定（）检测试剂盒、小鼠 检测试剂盒、小鼠 检测试剂盒、总 提取试剂盒、反转录试剂盒，以上试剂盒均购自百杰斯生物公司。试验设计 将适应性饲养 周后的 只 级 周龄雄性 小鼠按体质量随机分为 组，分别为空白对照组、模型对照组、二甲基亚砜（）对照组、阳性对照组以及低、中和高浓度罗汉果总黄酮组（分别简称为低、中和高酮组），每组 只，各组间体质量差异不显著（）。空白对照组不进行慢性睡眠剥夺，其他 组利用改良多水平台睡眠剥夺法对小鼠进行为期 的慢性睡眠剥夺以构建慢性睡眠剥夺模型，每日 （：至次日：）。慢性睡眠剥夺 后，各组每天定时灌胃，低、中、高酮组分别灌胃、（）的罗汉果总黄酮（溶于 溶液），空白对照组及模型对照组灌胃 的生理盐水，阳性对照组灌胃 （）的褪黑素（溶于 溶液），对照组灌胃 的 溶液，各组小鼠自由饮食和饮水，室温下连续灌胃 周。样品制备和检测指标 慢性睡眠剥夺小鼠大脑和血清样品制备 末次灌胃后禁食 ，采用摘除眼球法取血后将小鼠用断颈法处死，于冰上解剖后取出大脑。血液经离心处理后制备成血清，大脑用预冷过的生理盐水冲洗后滤纸吸干，置于 冰箱备用。慢性睡眠剥夺小鼠大脑和血清中抗氧化指标及炎症因子含量的测定采用试剂盒法 检 测 大 脑、血 清 中、活性以及、含量。慢性睡眠剥夺小鼠大脑和血清中抗氧化酶及炎症因子相关基因表达的测定 采用相关试剂盒提取大脑和血清中总，利用反转录试剂盒将总 反转录成。以 为模板，采用实时荧光定量 法检测目的基因 的 相 对 表 达 量。反 应 体 系 为，包 括 ，引物，。反应条件：预变性 ，变性 ，退火，延伸 ，循环 次。以甘油醛磷酸脱氢酶（）作内参基因，采用 法计算相关目的基因的 相对表达量。引物均由上海生物工程有限公司设计并合成，引物信息见表。表 引物信息 基因 引物序列 （）血红素氧合酶：核因子 相关因子：核因子：肿瘤坏死因子：甘油醛磷酸脱氢酶：数据统计与分析 采用 及 软件进行作图及统计学分析。试验结果进行单因素方差分析，采用 法进行组间多重比较，以平均值标准差（）表示。表示差异显著，表示差异不显著。结果与分析 罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠大脑中、活 性 及、含量的影响 由表 可知，低、中、高酮组大脑中 显著低于空白对照组（），显著高于模型对照 期李浩雨等：罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠抗氧化能力及炎症反应的影响组（）；中、高酮组大脑中 活性显著低于空白对照组和阳性对照组（），显著高于模型对照组和 对照组（）；低、中、高酮组大脑中、含量显著高于空白对照组和阳性对照组（），显著低于模型对照组和 对照组（）；低、中、高酮组大脑中 含量显著高于阳性对照组（），显著低于模型对照组和对照组（）。上述结果说明罗汉果总黄酮能显著提高慢性睡眠剥夺小鼠大脑中、活性，显著降低大脑中、含量。上述指标模型对照组与 对照组均差异不显著（），说明 对慢性睡眠剥夺小鼠无毒害作用，对其大脑中、活性及、含量无显著影响。表 罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠大脑中、活性及、含量的影响 ，组别总抗氧化能力（）血红素氧合酶（）丙二醛（）肿瘤坏死因子（）核因子（）空白对照组 模型对照组 阳性对照组 对照组 低酮组 中酮组 高酮组 同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（），相同或无字母表示差异不显著（）。下表同。，（），（）罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠血清中、活 性 及、含量的影响 由表 可知，低、中、高酮组及阳性对照组血清中、活性显著高于模型对照组和 对照组（），、含量显著低于 模 型 对 照 组 和 对 照 组（），说明罗汉果总黄酮能显著提高慢性睡眠剥夺小鼠血清中、活性，显著降低血清中、含 量。模 型 对 照 组 与 对照组除血 清 中 差 异 显 著（）外，血清 活性及、含量均差异不显著（），说明 对慢性睡眠剥夺小鼠无毒害作用。表 罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠血清中、活性及、含量的影响 ，组别总抗氧化能力（）血红素氧合酶（）丙二醛（）肿瘤坏死因子（）核因子（）空白对照组 模型对照组 阳性对照组 对照组 低酮组 中酮组 高酮组 动 物 营 养 学 报 卷 罗 汉 果 总 黄 酮 对 慢 性 睡 眠 剥 夺 小 鼠 抗氧化酶及炎症因子相关基因表达的影响 罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠大脑中、相对表达量的影响 由图 可知，低、中、高酮组及阳性对照组大脑中 相对表达量显著高于模型对照组和 对 照 组（），、相对表达量显著低于模型对照组和 对照组（）；中、高酮组及阳性对照组大脑中 相对表达量显著高于模型对照组和 对照 组（），低 酮 组 大 脑 中 相对表达量与模型对照组和 对照组相比差异不显著（）。而模型对照组与 对照组之间上述指标均不存在显著差异（）。数据柱标注相同小写字母表示差异不显著（），不同小写字母表示差异显著（）。下图同。（），（）图 罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠大脑中、相对表达量的影响 ，罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠血清中、相对表达量的影响 由图 可知，低、中、高酮组及阳性对照组血清中、相对表达量显著高于模型对照组和 对照组（），、相对表达量显著低于模型对照组和 对照组（）。模型对照组与 对照组之间上述指标均差异不显著（）。讨 论 氧化应激是 与抗氧化反应的失衡，而睡眠则能够促进抗氧化，抵御氧化应激产生。等研究表明，睡眠剥夺会导致 的积累和极大的氧化压力，造成机体的氧化应激损伤。而植物中的一些活性成分，如黄酮类物质，具有良好的抗氧化作用和抗菌、抗炎等特性。等研究表明，甘草总黄酮可以通过缓解炎 期李浩雨等：罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠抗氧化能力及炎症反应的影响症、提高抗氧化酶的活性和减轻肝脏损伤缓解小鼠肝脏组织的氧化应激损伤。等研究表明，松香素通过 通路上调相关抗氧化酶活性，从而清除 并改善心脏功能恶化。本试验测定了慢性睡眠剥夺小鼠大脑和血清中、活性，结果表明罗汉果总黄酮能够显著 提 高 慢 性 睡 眠 剥 夺 小 鼠 大 脑 和 血 清 中、活性，与模型对照组及 对照组相比，阳性对照组效果最好，高酮组次之，与上述研究结果相符。作为限速保护酶，可催化血红素氧化形成一氧化碳（）、亚铁离子（）以及胆绿素，并将这些物质转化为胆红素，从而在抗氧化防御系统中发挥重要作用。代表机体抗氧化物质的总抗氧化水平，它的提高代表着机体清除 能力的增强，可有效减轻机体氧化应激损伤。罗汉果总黄酮通过提高相关抗氧化酶的活性，增强其抗氧化能力，从而减轻慢性睡眠剥夺小鼠的氧化应激损伤。图 罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠血清中、相对表达量的影响 ，慢性睡眠剥夺会导致体内抗氧化系统失衡，造成氧化应激损伤，而 信号通路则能够在受到氧化应激损伤刺激后被激活，增强 的核转位，促使其与抗氧化原件结合，上调相关位点的抗氧化 基 因 的 表 达，进 而 增 强 机 体 的 抗 氧 化 能力。也被认为是调节相解毒酶编码基因表达的细胞保护因子，能够调节解毒酶如相关谷氨酸半胱氨酸连接酶（）、硫氧还蛋白还原酶（）、（）苯二酚氧化还原酶（）和 等的表达，最终影响细胞的氧化状态，并针对氧化应激提供保护。植物中的黄酮类物质能够通过激活 信号通路发挥抗氧化作用。本试验结果显示，慢性睡眠剥夺小鼠大脑、血清中、相对表达量显著下调，使用不同浓度的罗汉果总黄酮灌胃后，慢性睡眠剥夺小鼠大脑、血清中、相对表达量显著上调，与模型对照组及 对照组相比，阳性对照组效果最好，高酮组次之。其原因可能是罗汉果总黄酮激活了 信号通路，使 通过磷酸化和 解离进入细胞核，与相关基因动 物 营 养 学 报 卷启动子结合并诱导下游抗氧化基因表达的调节，从而上调 的表达，进而提高 的活性，减轻慢性睡眠剥夺小鼠的氧化应激损伤。等研究表明，漆树黄酮通过抑制 介导的 和丝裂原活化蛋白激酶（，）信号通路减轻内毒素诱导的脓毒症小鼠肾脏炎症和细胞凋亡。等研究表明，金鱼草素通过阻断 信号通路和激活 和 信号通路发挥抗炎活性。是一种快速反应因子，通过与其抑制因子核因子 抑制蛋白（，）结合，使其处于静息状态。慢性睡眠剥夺使机体产生过量的，诱导脂质过氧化并产生氧化应激。的过量积累会触发 蛋白复合体的激活，并使 蛋白磷酸化、泛素化、降解，导致 二聚体转位到细胞核，促进靶基因如 等的表达，。而 与在炎症中起关键作用的 相互作用，可以阻止 蛋白复合体降解，并抑制 信号通路激活。以上研究表明，植物中的黄酮类物质可能通过激活 信号通路来抑制 信号通路发挥抗炎作用。本试验结果表明，慢性睡眠剥夺小鼠大脑、血清中、相对表达量显著上调，、含量也显著提高，使用不同浓度的罗汉果总黄酮灌胃后，慢性睡眠剥夺小鼠大脑、血清中、相对表达量显著下调，、含量也显著降低，其中高酮组效果最明显，与上述研究结果一致。其原因可能是慢性睡眠剥夺使机体产生过量的，导致脂质过氧化产生，使得慢性睡眠剥夺小鼠大脑和血清中 含量的提高；同时，的过量积累促进了 核转位，导致 及其下游炎症因子 相对表达量显著上调，进而提高、在慢性睡眠剥夺小鼠大脑和血清中的含量；而罗汉果总黄酮通过上调抗氧化酶相关基因表达提高抗氧化酶活性，从而提高机体抗氧化能力，降低 含量，减轻脂质过氧化程度，降低慢性睡眠剥夺小鼠大脑及血清中 含量；同时，含量降低抑制了 蛋白复合体降解，阻止了 核转位，导致慢性睡眠剥夺小鼠大脑和血清中、相对表达量显著下调，进而降低、在慢性睡眠剥夺小鼠大脑和血清中的含量。综上所述，罗汉果总黄酮能够通过提高慢性睡眠剥夺小鼠大脑和血清中、活性及相关基因表达，降低、含量及相关基因表达，缓解慢性睡眠剥夺小鼠的氧化应激损伤及炎症反应。结 论 罗汉果总黄酮可通过调控慢性睡眠剥夺小鼠血清及大脑中、等抗氧化因子以及 和炎症因子及其相关基因表达，缓解慢性睡眠剥夺造成的氧化应激损伤及炎症反应。参考文献：，：，（）：，（）：，：，（）：，：张晓宁叶酸补充改善睡眠剥夺导致的氧化应激反应和端粒损伤的研究博士学位论文天津：天津医科大学，：，（）期李浩雨等：罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠抗氧化能力及炎症反应的影响 ，（）：（）：，：，：，（）：，：，：，：，：，：黄超，陈海龙，宋波，等氧化还原内稳态与节律基因相互调控的研究进展及在航天医学应用展望航天医学与医学工程，（）：，（）：（）王苗苗，娄华勇，张妮，等罗汉果化学成分及药理研究进展贵州中医药大学学报，（）：，（）：（）邵佩，庄虎，蹇顺华，等罗汉果黄酮的提取、纯化及生物活性研究进展食品与机械，（）：，（）：（）陈功，莫伟彬，李国峰罗汉果黄酮干预运动大鼠骨骼肌 及 表达的影响中国中医基础医学杂志，（）：，（）：（）王若冲，戴宁，李儒婷，等平台水环境法构建人类疾病动物模型的应用与思考中国实验方剂学杂志，（）：，（）：（），（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，：，动 物 营 养 学 报 卷 ，（）：，（），：，：，：，（）：陈丽君，李冰心，曹楠，等白术多糖通过线粒体和死亡受体途径缓解脂多糖诱导的雏鹅胸腺细胞凋亡动物营养学报，（）：，（）：（），：，：，（，；，）：（）（），（），（，），（）（），（）（），（）（），（），期李浩雨等：罗汉果总黄酮对慢性睡眠剥夺小鼠抗氧化能力及炎症反应的影响（），（）（）（），：），（），（），（），（），（）；（）；，（），（）：；（责任编辑 菅景颖）