蜜蜂残翅病毒基因组全长克隆及其克隆不稳定性.pdf

利用长片段 技术以单一病蜂的 为模板扩增出完整蜜蜂残翅病毒基因组并构建感染性克隆 结果表明该基因组在某些大肠杆菌内难以稳定克隆说明蜜蜂残翅病毒分离株具有克隆不稳定性克隆不稳定性可能仅存在于部分蜜蜂残翅病毒分离株和亚型 国内的蜜蜂残翅病毒分离株在亲缘关系上非常接近国外的蜜蜂残翅病毒分离株也可开放科学(资源服务)标识码()能存在克隆不稳定性关键词:残翅病毒 克隆不稳定性 病毒基因组全长克隆中图分类号:.文献标识码:文章编号:():./.(.).():().:残翅病毒()是一种在全球广泛分布的节肢动物病毒 据报道 除了能感染膜翅目的意大利蜜蜂()、胡蜂()、熊蜂()还能感染膜翅目的阿根廷蚂蚁()、革翅目的德国小蠊()和蛷螋()的感染使新羽化工蜂翅畸形无飞行能力 感染蜜蜂大脑可能影响其采集行为和导航严重影响蜂群发展和生产能力 研究表明 可能是蜂群崩溃综合症()发生的潜在原因 是蜜蜂科学乃至昆虫生态学的研究热点因此研究 对于全球农业和生态系统具有重要价值 与蜜蜂的另一种主要病毒 囊状幼虫病毒()同属软腐病毒科软腐病毒属()都是正二十面体的正义单链 病毒其基因组约 由 个编码多聚蛋白的开放阅读框()和两侧的非翻译区组成 目前对 的寄主、传播等方面已有较多研究由于蜂群常有多种病毒同时感染难以分离纯化 病毒与寄主互作机制方面的研究进展缓慢 年 采用反向遗传学手段利用 启动子、载体和 大肠杆菌实现了 的感染性克隆为蜜蜂病毒研究提供了重要范例 本试验初步探讨了 克隆不稳定性的原因同时介绍了一种基于无缝克隆、长片段 和 载体快速进行 全长克隆的稳定方法为 以及相关病毒研究提供依据福建农林大学学报(自然科学版)第 卷 第 期 ()年 月 材料与方法.材料.残翅蜜蜂 残翅意大利蜜蜂()工蜂样本由云南西双版纳热带植物研究所汪正威老师惠赠.主要试剂 载体(湖南优宝生物科技有限公司)载体(北京华越洋生物科技有限公司)载体()感受态大肠杆菌、购自上海唯地生物无缝克隆试剂盒()、反转录试剂盒()、试剂盒()、高保真 酶()均购自南京诺唯赞 载体和 ()购自北京全式金生物技术有限公司 磁珠全 提取试剂盒().主要仪器包括 仪()、仪()、高速离心机()、自动核酸提取仪()、酶标仪()等.感染性克隆的构建.残翅工蜂 提取与反转录 将残翅意大利蜜蜂工蜂逐只磨碎利用自动核酸提取仪和 提取试剂盒()提取病蜂 依照反转录试剂盒()说明书对病蜂 进行反转录得到病蜂.设计引物 依据 公布的 病毒株序列(:.)设计引物 其中依据最新的 所得的奥地利 基因组序列(:.)设计 端引物 用于扩增载体的引物均在 端添加 基因组序列修饰(锚定)以利于 基因组与载体通过重叠序列进行无缝克隆 除 和 引自文献外其余引物利用 .软件自主设计(表)表 试验中所用引物)引物名称引物序列()小写字母的序列为引物 端修饰以添加序列和用于无缝克隆下标数字为无缝克隆引物在 中的位置下划线序列为人工添加的()区段().基因组片段的扩增 利用 高保真 酶以巢式 方法扩增覆盖 基因组的 个片段:先用 和 扩增 基因组(缺少 端 )再以此为模板分别用引物 和/扩增 基因组 端 片段和 端 片段以提高 产量方便后续质粒组装并提高效率 此法也可避免将不同病毒分离株嵌合到同一基因组中.载体的线性化扩增与修饰分别用引物/、/、/、/(表)对、质粒进行扩增以产生线性化的载体并在两端加上 基因组首尾重叠序列()此外通过 引物在 载体的 终止子与 基因组间插入 个 碱基以保持转录后病毒 的感染性福建农林大学学报(自然科学版)第 卷.重组质粒的拼接与大肠杆菌的转化取.中扩增获得的 基因组片段(和 )以及.中获得的线性化载体按无缝克隆试剂盒()说明书的操作步骤进行无缝拼接取拼接产物 加入装有 感受态大肠杆菌的试管中混匀后于冰上放置 热激 加入 无抗生素的 培养基于 振荡培养 再以 转速离心 吸弃多余上清留 振荡混匀均匀涂布于含 氨苄青霉素的 平板上再置于 恒温箱中培养 挑取阳性菌落进行鉴定.阳性菌落和重组质粒的鉴定挑取阳性菌落用 和 引物进行 鉴定 阳性菌落进行测序确定与 基因组两端目标序列片段一致后接种于 液体培养基中 培养 提取质粒并通过.琼脂糖凝胶电泳后染色确认目标片段的长度与 克隆质粒一致(约 )重组质粒送福州博尚公司进行双向脱氧测序 利用 软件对测得序列与 上的 基因组进行比对确认序列完整性后进行序列拼接将完整的 基因组命名为.克隆不稳定性分析.细菌生长曲线的测定 在 、条件下对经过删减的 阳性菌落与、(实验室前期完成的 全长克隆)进行 液体培养(含 氨苄青霉素)并通过电泳和测序检测 每种类型的质粒选择 个样本进行试验从 开始吸取 培养液在 波长条件下每隔 测 次培养液的光密度 将数据导入 软件绘制生长曲线.的系统进化分析将测序得到的 基因组序列在 上进行比对(按 值排序)选取前 条序列(覆盖率大于)利用 软件进行 比对命名方式为 号、类群及分离地区的组合 以 方法运算 次选择 核酸替换模型(功能选出的最佳参数其他为默认参数)构建 进化树.原核启动子预测 黄病毒属的病毒 经过克隆转化细菌后常表现出遗传不稳定性因为病毒序列中含有原核启动子为了查找 克隆不稳定是否由此引起利用 在线软件对克隆序列 与 (:)进行原核启动子预测 结果与分析.基因组扩增及重组质粒的快速拼接.基因组扩增 利用引物 和 在 高保真酶的作用下从 中扩增出长度为 的片段(缺失 端 )通过 端修饰和巢式 获得较高产量且单一条带的端 序列和 端 序列(图)此方法和流程省去了传统病毒富集的步骤.载体的线性化 用.所述引物对、载体进行线性化扩增各线性化片段长度与相应的目标载体一致(图)说明载体成功线性化可用于下一步与 基因组的无缝克隆连接.无缝克隆 电泳检测结果表明不仅有载体(.)和 条 片段(、)还获得了.的 环形质粒()和线性质粒()的高亮条带环形质粒的泳动距离略远于线性质粒(图)片段长度无一致性的主要原因是成功的无缝克隆环形质粒无法在转染细菌后维持原来的大小说明在该株细菌中出现了克隆不稳定性.的克隆不稳定性.重组质粒的删减及稳定 克隆的获得 基于、载体的重组 克隆经转化大肠杆菌 菌株提取重组质粒再进行电泳和染色 结果表明基于 载体的重组质粒()为 的单一条带基于、载体的重组质粒主要是小于 的条带(无单一性)未发现与完整 重组质粒()相符的 条带(图)第 期李润琳等:蜜蜂残翅病毒基因组全长克隆及其克隆不稳定性:缺失 端 的 基因组:基因组 端 序列:基因组 端 序列图 基因组片段的扩增.:载体:载体:载体:载体图 载体的线性化.:质粒拼接图 质粒与 片段的无缝克隆拼接.(.).克隆质粒删减检测 测序结果表明以、和 为载体的克隆均有删减删减片段长度为.删减片段的起始位置分别为 基因组的 端起始位点至基因组 使用 载体的 基因组结构蛋白区均被删除使用 菌株的 质粒无突变和删减情况克隆转化样本随机选取 株进行质粒提取和测序 测序结果(图)表明片段删减具有随机性同次克隆、不同单克隆的删减情况有差异甚至出现从 基因组 端的载体序列开始删减的情况 删减主要发生在 基因组 端端删减较少 质粒 在 种大肠杆菌中均未出现删减克隆后的序列与 一致 进一步试验表明质粒 在 大肠杆菌中传代 次后的序列仍无突变 利用 载体对质粒 分别进行 种感受态的重新亚克隆结果表明 质粒均出现随机的大片段删减.克隆的不稳定性.基因组可能抑制细菌的生长相比于序列删减的 和长度同为 的质粒 菌株中的 克隆导致细菌生长更慢生长平台期也较低(图)在 种克隆的液体培养中 为生长平台期 克隆的 显著低于 和 克隆 单因素方差分析表明(数据参考附录)转入 的菌株与其他菌株在平台期的 具有极显著差异(、.)说明完整的 基因组可能对细菌的生长有抑制作用 此外质粒中插入的外源片段越长细菌的生长可能越慢但在试验中对照组 克隆长度相差约 (小于)福建农林大学学报(自然科学版)第 卷左侧标示大肠杆菌菌株(、)和质粒(、)虚线部分表示删减区段实线部分表示不完整的 克隆重组序列图上方标示 基因组的功能分区图 重组克隆的核苷酸序列删减区域.图 不同质粒在大肠杆菌 菌株中的生长曲线.().的系统进化树 与 株 基因组的系统进化树可被分为 群(图)与亚洲的其他 株遗传距离最近与美洲及欧洲大陆的 分离株距离较远 其中与成功进行感染性克隆的 (:)具有一定的遗传距离说明这 株病毒在克隆稳定性方面存在差异.基因组原核启动子分析利用 软件分析 与 中的原核启动子序列结果表明 有 个原核启动子序列在基因组 位置比 多 个 而 基因组的起始密码子位于基因组序列 位置的启动子之后启动子的存在可能使 意外转录从而导致病毒序列的删减 讨论与结论.病毒的克隆不稳定性及克服方法在病毒感染性克隆试验中特别是 病毒感染性克隆有时会出现序列不稳定现象这种不稳定性阻碍了病毒感染性克隆的研究与应用 有研究表明黄病毒(乙型脑炎病毒和登革热病毒)基因组中原核启动子相似序列在大肠杆菌中启动转录后可产生毒性蛋白从而引发菌株对病毒序列的重组将乙型脑炎基因组的原核启动子序列进行点突变降低其启动子活性后病毒 克隆则能在大肠杆菌中稳定传代 本试验利用 载体克隆 基因组无法获得完整的 克隆而利用 载体可以获得稳定的 全长克隆 说明 具有克隆不稳定性而 载体可能抑制这种不稳定性 从 年 成功进行 的感染性克隆后重复此试验的研究较少 在 年已有学者利用人工合成的 基因组进行 感染性克隆研究(:.、.)但并未采用大肠杆菌克隆方法研究也表明 在基因组非翻译区()和非结构蛋白区域具有较高的突变率说明 克隆存在难度克服病毒克隆不稳定性的方法主要有:用低拷贝质粒、低温培养、更换菌株、农杆菌克隆及酵母菌克隆和插入内含子等 应对病毒克隆不稳定性更换质粒、宿主菌株和低温培养是较简便的操作但多数方法效果较差 插入内含子也是常见的克服克隆不稳定性的方法 转录的真核生物内含子在大肠杆菌中无法正常去除但转到寄主后能正常剪接不影响病毒序列感染性 然而这种方法需要有较充足的前期工作来确定病毒基因组中的克隆不稳定序列和原核启动子序列并确定应插入内含子的 第 期李润琳等:蜜蜂残翅病毒基因组全长克隆及其克隆不稳定性位置 试验进行的准备与后续的确认都存在较多的不确定性 目前还没有通用的解决方法来应对不同病毒的克隆不稳定性 另一种思路是避免进行克隆直接使用连接产物进行高保真的 扩增以获得含病毒全基因组的 本试验尝试通过低温培养和 扩增无缝拼接产物但 克隆不稳定性依然存在图 进化树.在本试验中基于 载体和 菌株无法获得稳定的 全长克隆(不同于 的试验结果)预测分析表明 和 的原核启动子活性存在一定差异 克隆不稳定性可能类似于丙型肝炎病毒()一些品系的 病毒具有较高的原核启动子活性从而具有克隆不稳定性其他品系不具有这样的性质 基于 载体可以获得稳定 克隆的原因可能是 载体比 载体多 个 基因(与 相同序列为 )基因编码的阻遏蛋白可能通过结合 基因组中的 相似序列抑制上游原核启动子序列的转录避免引起质粒删减 后续在 基因组 位置找到了 个 高度相似序列与 序列()存在 的重叠这可能是抑制(在 位置)原核启动子活性的原因 但目前只是推测和假设且质粒样本数量较少因此还需要更多的试验对该结论进行验证有研究表明利用 载体(具有 基因)也可成功进行 的全长克隆 推测 基因能够抑制 克隆不稳定性在病毒序列同义突变后抑制病毒序列的转录和重组.基因功能的研究及应用本试验将 基因组拼接到 载体的 启动子与 终止子之间 根据 基因组直接扩增、载体和无缝克隆的方法快速在体外转录出 正义 链(比野生型 仅在 端多 个 碱基)以进行感染性试验 此方法促进了 分子病毒学的发展也加快了蜜蜂 载体的开发然而实验室周边环境的蜂群均检测出野生型 前期部分试验有野生型病毒污染的情况发现福建农林大学学报(自然科学版)第 卷野生型病毒严重干扰试验无法准确判断感染能力 为避免野生型 对样本造成污染未选择对现有蜂群进行感染试验使得该研究无法确认改造后的病毒质粒能否在蜜蜂体内形成有感染力的病毒颗粒 能严重感染蜜蜂脑组织基于 的病毒载体可用于蜜蜂脑部认知科学的研究 相比其他造成蜜蜂严重感染症状甚至死亡的蜜蜂病毒如、等 对蜜蜂均是隐性感染并不对蜜蜂的生命、外观与活动造成显著影响 此外由于 病毒的寄主广泛性 病毒载体可能具有广阔的应用前景参考文献 .(.).():.().():.().():.():.:./.(/):.:.():.:./.:.().():.:./.():.():.黄慧郑子峥赵敏等.戊型肝炎病毒 多聚蛋白的不同功能域在细胞内的定位.病毒学报():.沈克飞曹兰郑华等.重庆中华蜜蜂囊状幼虫病病毒多聚蛋白基因分子特性分析.昆虫学报():.:.():.()(.)().():.():.().():.:./.:.():.():.:./.().郑旭晨郑浩童武等.宿主菌株及培养温度对乙型脑炎病毒 克隆稳定性的影响.中国动物传染病学报():.():.().():.第 期李润琳等:蜜蜂残翅病毒基因组全长克隆及其克隆不稳定性 .():.:./.():.郑旭晨郑浩郭亦非等.乙型脑炎病毒基因组 克隆在宿主菌中不稳定因子的研究.中国动物传染病学报():.():.:.():.:./.().().():.():.():.().():.():.:./.:.:./.():.():.():.(.).():.().:.(责任编辑:吴显达)福建农林大学学报(自然科学版)第 卷