耐高光琼枝突变体XY-01的选育及生产性能评价.pdf

第 38 卷第 3 期大大 连连 海海 洋洋 大大 学学 学学 报报Vol.38 No.32 0 2 3 年 6 月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITYJune 2 0 2 3DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2022-285文章编号:2095-1388(2023)03-0438-07耐高光琼枝突变体 XY-01 的选育及生产性能评价李欣宇1,2,朱军2,3,4,李青楠2,邹潇潇2,3,4,鲍时翔2,3,4,安鑫龙1(1.河北农业大学 海洋学院,河北 秦皇岛 066003;2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南热带农业资源研究院海南省热带农业资源保护与利用重点实验室,海南 海口 571101;3.中国热带农业科学院湛江实验站,广东 湛江 524013;4.海南省海洋生物功能性成分研究与利用重点实验室,海南 海口 571101)摘要:为改善琼枝(Betaphycus gelatinus)养殖时受高光胁迫导致产量及品质下降的状况,对海区内初步筛选的潜在耐高光藻株进行高光筛选及分离纯化,经继代培养获得一株性状稳定的耐高光突变株琼枝XY-01,并对其进行生产性能评价。结果表明:与野生型琼枝(WT)相比,XY-01 藻体呈绿色,藻枝饱满、舒展,高光胁迫表型不明显;在水温为 26、光量子通量密度为 60 mol/(m2s)条件下,XY-01的叶绿素 a、类胡萝卜素和藻蓝蛋白含量均高于 WT,但藻红蛋白含量极显著低于 WT(P0.01);XY-01的最适生长光量子通量密度为 250 mol/(m2s),在此条件下,XY-01 与 WT 光系统(photo-system,PS)的最大光化学转换效率分别为(0.6350.019)、(0.4840.055)且二者有极显著性差异(P0.01),XY-01 与 WT 的增重率分别为 57.00%3.50%、39.00%4.28%(P0.05),特定生长率分别为(1.610.09)、(1.180.06)%/d(P0.05)。研究表明,通过高光选育首次获得一株性状稳定的耐高光琼枝 XY-01,为耐高光琼枝种质资源开发提供了科学参考。关键词:琼枝;突变体;高光选育;光系统最大光化学转换效率中图分类号:S 917.3 文献标志码:A 琼枝(Betaphycus gelatinus)广泛分布于中国、日本、菲律宾和其他东南亚国家1,在中国主要分布于海南省及台湾地区。琼枝隶属于红藻门(Rhodophyta)红翎菜科(Solieriaceae)琼枝藻属(Betaphycus),是中国主要栽培的大型经济红藻。琼枝藻体颜色为紫红色或黄绿色,直径为 11 21 cm,腹面有圆锥状突起,枝条为扁平或圆柱状,平卧生长,有圆盘状固着器,附着于大潮低潮线下13 m 的死珊瑚或礁石上。琼枝含有卡拉胶、多种微量元素及丰富的生物活性物质,具有抗病毒2、抗氧化3、抗菌4、调节免疫5和抗高脂血症6等功效,在功能食品和药品的研发等方面具有较大潜力。随着卡拉胶在世界范围的广泛应用,琼枝需求量不断增加7,而过度采捞导致琼枝自然生存环境遭到破坏,野生资源急剧降低8,因此,人工栽培琼枝成为主要来源9。为便于琼枝栽培期间的采收与管理,生产中常将琼枝从深水区迁移至水位较浅的潮下带,并绑于水泥网框的网片上10。与自然生长的环境相比,栽培琼枝易受到光照胁迫,表现出明显的光抑制或不可逆的光损伤,导致藻体有明显的背腹之分,背部藻体老化严重,枝条粗大且质地较硬,表面分布有白斑,生长速率降低,严重影响了琼枝品质和产量,因此,亟待选育一种能快速生长且耐高光强的琼枝新品系。近年来,国内外学者对琼枝生物学特性11-12、遗传多样性13和营养成分14等方面的研究较多,但在筛选抗逆琼枝突变体方面尚未见报道。本研究中,通过自然突变与高光筛选相结合的方法,获得一株耐高光琼枝突变体并进行生产性能评价,以期为琼枝的优良品系选育提供一条新途径,为耐高光琼枝新种质资源开发提供科学参考。收稿日期:2022-09-21 基金项 目:海 南省自 然科 学基金(321RC1093);海 南 省 科 技 专 项(ZDYF2021SHFZ106);农 业 农 村 部 财 政 专 项(NFZX2021,NHYYSWZZZYKZX2020);中央级公益性科研院所基金(1630052019010,1630052022014)作者简介:李欣宇(1998),男,硕士研究生。E-mail:lixinyu066000 通信作者:鲍时翔(1966),男,博士,研究员。E-mail:baoshixiang 安鑫龙(1976),男,博士,副教授。E-mail:axlqhd 1 材料与方法1.1 材料试验用琼枝野生型品系(WT)、潜在耐高光藻株均采自海南省昌江黎族自治县海尾镇琼枝栽培区(1959N,10847E)的养殖网框(图 1)。本图以自然资源部标准地图服务网站 GS(2017)1268 号标准地图为底图,底图边界无修改。The figure is based on the standard map GS(2017)1268 in the Standard Map Service website of Ministry of Natural Resources of the Peoples Republic of China,with no modifications of the boundaries in the standard map.图 1 采样海域Fig.1 Sampling sea area1.2 方法1.2.1 样品采集 潜在的耐高光藻株的采集标准:向光面的藻体表面老化不严重、无明显背腹之分,藻枝饱满多汁、舒展并向四周延伸,藻体生长旺盛健康。其中,采集到一株琼枝藻体颜色为红色与绿色相间的嵌合体,切除红色组织后于海区内扩培,用于后续耐高光筛选试验。1.2.2耐高光藻株选育试验在中国热带农业科学院热带生物技术研究所进行。取 5 g 潜在的耐高光藻株并以琼枝 WT 为对照,培养液由新鲜海水加入 PES 培养基(上海生工生物工程股份有限公司)制成。培养条件:光量子通量密度为 280 mol/(m2s),温度为 26,盐度为 32,pH 为 8.20,光周期 12 L 12 D。经 28 d 培养筛选出增重最高的藻体作为耐高光藻株,经 6 次继代培养验证其遗传性状稳定,并检测其生理生化指标及生产性能。1.2.3 主要光合色素含量测定将琼枝突变体与WT 暂养于光量子通量密度为 60 mol/(m2s)的光照条件下,每组设 3 个重复,其余条件同“1.2.2节”。暂养 7 d 后,从每个重复取 0.1 g 新鲜藻体测定脂溶性色素叶绿素 a、类胡萝卜素及水溶性色素藻胆蛋白含量,具体方法参照文献 15-16。1.2.4 光系统(PS)最大光化学转换效率测定 将琼枝突变体和 WT 切段,分别置于光量子通量密 度 为 55、110、180、250、280、370 mol/(m2s)条件下培养,每个试验设置 3 个重复,其余培养条件同“1.2.2 节”。培养 28 d 后,使用MINI-PAM(Walz,Effeltrich,Germany)测定最大光量子产量。暗适应 30 min 后,首先在 0.3 mol/(m2s)光量子通量密度下,测得最小荧光值(F0),然后在 4 000 mol/(m2s)的饱和脉冲下,测得最大荧光值(Fm)。PS最大光化学转换效率(Fv/Fm)计算公式17为Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm。(1)1.2.5 不同光照条件下琼枝突变体生长性能的测定将琼枝突变体和 WT 切段,初始质量均为(1.000.01)g,分别设置 55、110、180、250、280、370 mol/(m2s)6 个光量子通量密度,每个试验设置 6 个重复,其余培养条件同“1.2.2节”。每 3 d 更换一次海水,培养 28 d 后,测量藻体的 湿 质 量。增 重 率(GBW,%)、特 定 生 长 率(RSG,%/d)计算公式分别为 GBW=(Wt-W0)/W0100%,(2)RSG=(lnWt-lnW0)/t100%。(3)式中:W0为藻体初始鲜质量(g);Wt为试验结束时藻体鲜质量(g);t 为试验时间(d),称量前用吸水纸快速吸干藻体表面的水分。1.2.6 琼枝突变体海区养殖试验 2021 年 12 月2022 年 6 月中旬于海区进行生长性能试验。将琼枝突变体栽于水泥网框中,水泥网框上有两层尼龙网,底层网目数小,上层网目数大。使用轧带将质量为 1 g 的琼枝突变体系于底网,苗间距约为10 cm,共计 45 株,并将水泥网框迁移至水位较浅的养殖海域。以 WT 为对照组,分别于 2022 年 2、4、5、6 月每月退潮时各选取 6 株琼枝称重,计算其特定生长率,10 月时观察藻体长势并拍照。1.2.7 卡拉胶含量的测定将海区养殖 6 个月的琼枝突变体与 WT 置于 60 烘箱中烘干至恒重,每组设置 3 个重复,分别取(1.000.01)g 烘干后的藻体,参照文献 18 中的方法测定胶含量。1.3 数据处理试验结果以平均值标准差(meanS.D.)表示,采用 SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析,采用 Duncan 法进行组间多重比较,显著性水平设为934第 3 期李欣宇,等:耐高光琼枝突变体 XY-01 的选育及生产性能评价0.05,极显著性水平设为 0.01。2 结果与分析2.1 耐高光琼枝突变体 XY-01 的选育经过 28 d 实验室培养筛选出一株生长速率最快的耐高光突变体,藻体呈绿色,偏肉质,背腹面区分不明显,向光面稍老化,藻枝舒展且饱满,藻株高光胁迫表型不明显,其余形态特征与 WT 相似。WT 在高光培养期间生长速度缓慢,枝段培养初期颜色呈紫红色,培养 15 d 时颜色变淡,枝段出现白化腐烂现象,培养 28 d 后枝段颜色变为黄绿色,分枝较小且数量增多;而琼枝突变体在培养期间藻体颜色稳定为绿色,高光条件下生长明显比WT 迅速,枝段未出现腐烂,枝条延伸生长(图 2)。图 2 琼枝 WT 与 XY-01 形态对比Fig.2Morphological comparison between Betaphycus gelatinus WT and XY-01由于该耐高光琼枝突变体是通过对嵌合体简单分离获得的,培养期间随着藻株生长偶见红色组织块。将该突变体分成若干 4 cm 的藻段,置于110 mol/(m2s)光量子通量密度下进行复筛,并及时切除红色组织块。培养6090 d 期间均未发现红色组织块的出现。随后将该绿色突变株置于低光照 55 mol/(m2s)下培养,28 d 后的藻株性状稳定,初步获得性状稳定的耐高光突变株。将颜色稳定的琼枝突变体送至养殖海区继代培养 6 次,藻体颜色均为绿色,无红色组织块出现,琼枝突变体生长旺盛且生长速率高于 WT,故获得的突变株为遗传稳定的耐高光琼枝,编号为 XY-01。2.2 XY-01 的光合色素含量从图 3 可见:在光量子通量密度为 60 mol/(m2s)下培养 7 d 后,XY-01 的叶绿素 a 和类胡萝卜素含量稍高于 WT,但组间无显著性差异(P0.05);XY-01 的藻红蛋白(PE)含量为(0.0180.001)mg/g,极 显 著 低 于 WT (0.210 0.025)mg/g(P0.01),而藻蓝蛋白(PC)含量则显著高于 WT(P0.05)。表示与对照组有显著性差异(P0.05);表示与对照组有极显著性差异(P0.01),下同。means significant difference compared with the control(P 0.05);means very significant difference compared with the control(P0.01),et sequemtia.图 3 琼枝 XY-01 和 WT 的光合色素含量Fig.3Photosynthetic pigment contents of Betaphycus gelatinus XY-01 and WT2.3 XY-01 的 PS最大光化学转换效率从图 4 可见:经过 28 d 培养后,XY-01 的Fv/Fm在光量子通量密度 250 mol/(m2s)下最大,为(0.6350.019),WT 的 Fv/Fm在光量子通量密度 180 mol/(m2s)下最大,为(0.5120.037);在 光 量 子 通 量 密 度 55 370 mol/(m2s)范围内,WT 的 Fv/Fm均显著低于 XY-01。这表明,WT 光化学转换效率较低,而 XY-01有更高效的光合作用能力。2.4 XY-01 在不同光量子通量密度下的生长性能从表 1 可见:在 55370 mol/(m2s)光量子通量密度下,经过28 d 培养后,XY-01 和 WT 的增重率和特定生长率均有显著性差异(P0.05);XY-01 于 250 mol/(m2s)光量子通量密度下,具 有 最 大 的 增 重 率 和 特 定 生 长 率,WT 于180 mol/(m2s)光量子通量密度下,具有最大的增重率和特定生长率,二者均在 55 mol/044大连海洋大学学报 第 38 卷(m2s)条件下具有最小的生长性能。这表明,XY-01 比 WT 具有更好的高光适应性。图 4 琼枝 XY-01 和 WT 的最大光化学转换效率Fig.4Maximum photochemical conversion efficiency of Betaphycus gelatinus XY-01 and WT表 1 琼枝 XY-01 和 WT 的生长性能Tab.1 Growth performance of Betaphycus gelatinus XY-01 and WT 光量子通量密度/(molm-2s-1)photosynthetic photon flux density增重率/%weight gain rate特定生长率/(%d-1)specific growth rateXY-01WTXY-01WT55 33.002.47a15.501.44b1.020.10a0.510.08b11042.003.52a32.004.55b1.250.09a0.990.04b18053.002.58a43.003.27b1.520.07a1.280.04b25057.003.50a39.004.28b1.610.09a1.180.06b28054.004.31a38.004.90b1.540.09a1.150.06b37043.004.38a36.004.22b1.280.06a1.100.09b注:同行中标有不同字母者表示同一指标下不同组间有显著性差异(P0.05)。Note:The means with different letters at same index within the same line are significantly different in different groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter within the same line are not significant differences.2.5 XY-01 在海区养殖期间的特定生长率从 2021 年12 月初2022 年6 月中旬,栽培在海区的 XY-01 生长旺盛,藻体颜色为绿色,无胁迫表型,同期栽培的 WT 生长较为缓慢(图 5)。从图 6 可见:2021 年 12 月初2022 年 2 月下旬时,XY-01 组和 WT 组均生长较慢,特定生长率分别为(1.610.10)、(1.680.14)%/d,且组间无显著性差异(P0.05);WT 组最高特定生长率出现在 2 月下旬4 月下旬,为(2.820.14)%/d,此时期 XY-01 组为(3.180.19)%/d,优于 WT组,但组间仍无显著性差异(P0.05);XY-01 组于 4 月下旬5 月下旬期间生长最为迅速,特定生长率达(3.630.07)%/d,此时期 WT 组的特定生长率仅为(2.630.36)%/d,且组间有极显著性差异(P0.05)。3 讨论3.1 高光突变体琼枝的选育目前,已有多种物理及化学诱变技术应用到藻144第 3 期李欣宇,等:耐高光琼枝突变体 XY-01 的选育及生产性能评价类的育种中,如严兴洪等19利用60Co-射线诱变条斑紫菜(Porphyra yezoensis)壳孢子萌发体获得色素突变体;孟琳等20利用 MNNG 化学诱变剂诱变龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)茎尖,获得耐高温龙须菜突变体。由于诱导琼枝产生四分孢子的技术还不成熟,琼枝的人工有性生殖繁育尚未实现;此外,诱导愈伤组织技术不成熟,通过茎尖切段的琼枝营养繁殖技术也不完善,切断后的藻株生长速率缓慢,导致通过人工杂交或物理、化学诱变等技术进行琼枝育种的工作难以开展。然而,自然突变是生物进化的强大推手,其为研究人员提供了一批具备优良性状的突变体,因此,选择育种也成为育种方法中的一种重要手段。世界各地的多项研究表明,红藻中存在大量自然突变体,如在日本发现的红藻(Pyropia kinosi-tae)绿色自然突变体21,在巴西发现的红藻(Gracilaria caudata)褐绿色自然突变体22,在印度发现的红藻(Gracilaria debilis、Gracilaria edulis)自然绿色突变体23等。优良性状自然突变体的产生与积累需要一定的种群规模与特定的选择压力。海南省昌江黎族自治县海尾镇自 1998 年开始栽培琼枝,至 2012 年栽培面积达到 320.2 hm2。琼枝栽培一直采取营养繁殖的方式,在长达 14 年的水泥网框式琼枝栽培过程中,为自然突变体的积累提供了条件。本研究中采用选择育种的方法,对耐高光琼枝进行了选育,通过对海区内的自然突变体进行初筛,进而在实验室高光强培养条件下进行定向筛选与鉴定,获得了耐高光琼枝突变体 XY-01。但由于目前尚未了解环境因子对琼枝生长的影响,人工培养条件下琼枝的生长速率低于海区,因而本研究中采用了室内定向筛选与海区培养相结合的方法以加快选育的进程,在较短的时间内获得了耐高光性状稳定的琼枝突变体 XY-01。3.2 琼枝 XY-01 的生长特性叶绿素 a、类胡萝卜素和藻胆蛋白是海洋红藻主要的光合色素,光合色素含量影响海藻的光合速率。其中,红藻中影响藻体颜色的色素主要是叶绿素和藻胆蛋白,藻体表现为绿色或红色,可能与叶绿素与藻胆蛋白含量的变化有关。Veeragurunathan等23对红藻(Gracilaria debilis)的研究表明,绿色突变体藻体的颜色稳定,且红色野生型藻红蛋白含量高于绿色突变体。本研究中,XY-01 和 WT 也有类似表现,在相同的实验室培养条件下,XY-01的藻红蛋白含量极显著低于 WT,同时叶绿素 a 含量高于 WT,因此,XY-01 藻体表现为绿色,可能与其叶绿素与藻胆蛋白含量差异有关。有研究表明,红藻的藻胆蛋白是高效的捕光色素,对绿、黄、橙、红色光具有良好的吸收效果24。由于野生琼枝一般生长于较深的海域中,阳光经海水折射和散射后,仅较长波长的光能穿透更深海水被琼枝的藻胆蛋白捕获,并将光能传递给光合反应中心。因此,野生琼枝仅需较弱的光能就能满足生长需求。然而由于近海海域水位变浅、光强增加,人工栽培琼枝的藻胆蛋白可能因捕获到过多的光能从而带给藻体光损伤,但绿色琼枝突变体XY-01 则可能通过降低藻胆蛋白的合成并提高叶绿素 a 的合成来适应高光强的生长环境,因而表现出优于野生型的生长特性。3.3 琼枝 XY-01 的应用价值已有研究表明,红藻的绿色品系或突变体更能适应高光环境。赵素芬等25研究发现,长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)绿色品系最适光量子通量密度为 150 mol/(m2s),而红色品系最适光量子通量密度仅为 30 mol/(m2s)。徐燕等26研究了不同坛紫菜(Prophyra haitnensis)的色素突变体生长发育状况,发现翠绿色突变体后期生长速率最快。Faria 等27在较高的驯化下,红藻的绿色突变体能优化光能吸收,并于后期培养中表现出较高的生长率。Fv/Fm是衡量 PS功能的重要指标,反映了光合生物的 PS在光合作用中最大光化学转换效率。藻类的 Fv/Fm值约为 0.65,当受到外部环境胁迫时其数值显著下降,可直接反映藻类受胁迫的程度28。综合本研究中 PS最大光化学转换效率及生长试验结果,XY-01 在高光强下比WT 表现出较优的光合作用效率和明显的生长优势。因此,绿色琼枝突变体可能更有利于占据更高光强的生态位并在栽培种群中建立优势。卡拉胶是一种重要的工业和食用原料,是琼枝的重要成分。对于琼枝育种而言,卡拉胶含量是重要的产业相关性状,在筛选耐高光琼枝品系时须保证其经济性状不退化。目前,养殖琼枝的种苗多为营养繁殖获得,其遗传性状单一,本研究中获得的XY-01 丰富了栽培种质的遗传多样性,是潜在的育种材料。XY-01 具有优良生长速度的同时并未影响其卡拉胶含量,表明栽培 XY-01 将会带来更好的经济效益,具有推广应用潜力。4 结论1)XY-01 的最适光量子通量密度与 PS最大244大连海洋大学学报 第 38 卷光化学转换效率均高于 WT,表明 XY-01 更适宜于高光条件下生长,是琼枝的耐高光藻株。2)XY-01 在海区试验中表现出较高的生长速率,且其含胶量与 WT 无显著性差异,表明 XY-01具有良好的生产性能。参考文献:1 匡梅,曾呈奎,夏邦美.中国麒麟菜族的分类研究J.海洋科学集刊,1999(1):168-189,235.KUANG M,ZENG C K,XIA B M.Taxonomy of Eucheumatoidae in ChinaJ.Studia Marina Sinica,1999(1):168-189,235.(in Chinese)2 JIN F J,ZHUO C Q,HE Z,et al.Anti-Herpes simplex virus activity of polysaccharides from Eucheuma gelatinaeJ.World Journal of Microbiology and Biotechnology,2015,31(3):453-460.3 HA H T,CUONG D X,THUY L H,et al.Carrageenan of red algae Eucheuma gelatinae:extraction,antioxidant activity,rheology char-acteristics,and physicochemistry characterizationJ.Molecules,2022,27(4):1268.4 SAITO H,TAMRIN M L.Antimycotic activity of seaweed extracts(Caulerpa lentillifera and Eucheuma cottonii)against two genera of marine oomycetes,Lagenidium spp.and Haliphthoros spp.J.Biocontrol 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