全基因组重测序筛选弓背青鳉三亚群体性别遗传标记.pdf

广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第 43 卷第 4 期2023 年 7 月Vol.43 No.4Jul.2023王中铎，何传猛，姚泽彬，等.全基因组重测序筛选弓背青鳉三亚群体性别遗传标记J.广东海洋大学学报,2023,43(4):69-75.收稿日期：2023-03-31基金项目：国家自然科学基金（41806195；31972794）；粤桂联合基金-面上项目（2020A1515410009）第一作者：王中铎(1980)，男，博导，教授，研究方向为遗传与进化。E-mail:何传猛(1997)，男，硕士研究生，研究方向为遗传与进化。E-mail:全基因组重测序筛选弓背青鳉三亚群体性别遗传标记王中铎1,2，何传猛1，姚泽彬1，李金蓬1，陈子阳1，邓爱萍1，赖卓欣1，李银芳1，董忠典1，郭昱嵩1（1.广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2.广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室，广东 湛江 524088）摘要：【目的】开发弓背青鳉（Oryzias curvinotus）三亚群体（下称“三亚青鳉”）遗传性别鉴定分子标记，为进一步挖掘其性别决定基因奠定基础。【方法】用染色体商（Chromosome quotient，CQ）法比较雌雄两性个体的全基因组重测序覆盖度，筛选潜在的性别特异性序列区域（CQ0.1）并设计引物，通过PCR扩增验证引物区分三亚青鳉群体及其子代性别的适用性。【结果】经CQ分析筛选，CQ0.1的特异性区域279个，设计引物279对。随机挑选的60对引物中，29对标记引物在三亚青鳉群体雄鱼中扩增得一个DNA条带，雌鱼无条带，均可鉴定三亚青鳉遗传性别。从29对引物中随机挑选2对引物（命名为Marker1和Marker2）进一步验证，引物Marker1、Marker2在雄鱼中扩增产物分别为791、556 bp，两对引物对三亚青鳉子代群体的扩增结果与亲本一致。用两对性别特异性标记对三亚群体的F2代全同胞家系94个个体进行扩增，结果发现F2群体自然性别比约1 1。【结论】性别特异性引物Marker1和Marker2均可对三亚青鳉群体进行遗传性别鉴定，在三亚青鳉野生亲本及其子代中均有稳定性和通用性，可用于弓背青鳉三亚群体遗传性别鉴定。关键词：弓背青鳉；三亚群体；性别特异性标记；重测序；染色体商区域；自然性别比中图分类号：S917；Q953+.3文献标志码：A文章编号：1673-9159（2023）04-0069-07doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2023.04.009Screening of Sex Genetic Markers in the Sanya Population ofOryzias curvinotus by Whole-Genome ResequencingWANG Zhong-duo1,2,HE Chuan-meng1,YAO Ze-bin1,LI Jin-peng1,CHEN Zi-yang1,DENG Ai-ping1,LAI Zuo-xin1,LI Yin-fang1,DONG Zhong-dian1,GUO Yu-song1(1.Fisheries College,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China;2.Guangdong ProvincialKey Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture,Zhanjiang 524088,China）Abstract:【Objective】This study aimed to develop molecular markers for genetic sex identificationin a Sanya population of Oryzias curvinotus(named SY-medaka),and provide a foundation forexploring its sex-determining genes.【Method】We used chromosome quotient(CQ)to compare thewhole-genome resequencing coverage of male and female individuals.Potential sex-specific sequenceregions(CQ 0.1)were screened to design primers.The applicability of the primers to distinguish thesex of the wild Sanya population and its offspring was verified by PCR amplification.【Result】CQanalysis screened 279 specific regions with CQ 0.1.Among the 60 pairs of randomly selected primers,29 pairs of marker primers were screened because a DNA amplification band was obtained in the male第43卷广东海洋大学学报fish of the wild SY-medaka population,and no band was obtained in the female fish.The primersMarker1 and Marker2 were randomly selected from 29 pairs of primers for further validation.Theamplification product of primer Marker1,Marker2 in males were 791,556 bp,respectively.The twopairs of primers were amplified to the offspring population of Sanya medaka and the results wereconsistent with the parents.In addition,a natural sex ratio of approximately 1:1 was observed by sex-specific markers in 94 individuals of a sub-F2 generation of a full sibling family from the Sanyapopulation.【Conclusion】Both sex-specific primers Marker1 and Marker2 can be used for the geneticidentification of the Sanya population of O.curvinotus.They are stable and universal in both wildparent and its offspring.Key words:Oryzias curvinotus;Sanya population;sex-specific markers;resequencing;chromosome quotient region;natural sex ratio在脊椎动物中，性别决定和分化有高度可塑性，受遗传和环境共同影响1-3。硬骨鱼类的性别决定主要有遗传性别决定（如XX/XY和ZZ/ZW性别决定系统4）、环境性别决定两种机制。青鳉属（Oryzias）鱼类为最早确定有雄性决定基因的鱼类，例 如，有 XX/XY 系 统 的 日 本 青 鳉（Oryziaslatipes）5、弓背青鳉（Oryzias curvinotus）、吕宋青鳉（Oryzias luzonensis）、湄公河青鳉（Oryzias mekongensis）和恒河青鳉（Oryzias dancena），赫氏青鳉（Oryzias hubbsi）有ZZ/ZW系统6-8，均为遗传性别决定的典型代表。寻找可快速鉴定鱼类性别遗传组成的性别分子标记对于鱼类性别控制育种十分重要。筛选鱼类性别相关分子标记可在鱼类生长发育早期鉴定性别，达到鉴定伪雄鱼和伪雌鱼的效果9，对鱼类性别控制有重要意义。青鳉有体型小、繁殖力强且周期短，对水质和环境变化敏感等优势，是研究环境毒理学、发育生物学等的重要模式生物，如周运迪等14通过CRISPR/Cas9 技术建立了日本青鳉 foxl2-/-突变体，表明foxl2对维持卵巢功能有重要作用；董忠典等10-11基于肝脏转录组分析弓背青鳉对盐度的适应机制，并研究低浓度炔诺酮短期暴露对海洋青鳉（Oryziasmelastigma）仔鱼的毒性。海洋青鳉也是研究海洋酸化的模式物种之一12，对微塑料以及重金属的监测有重要作用13。在进行上述性腺发育研究、环境监测时需要确定青鳉的遗传性别。弓背青鳉又名海南青鳉，主要分布在我国南方海域，盐度适应范围广15,16，有生长速度快、性成熟早的特点17。青鳉属中大多数鱼类雄性性别决定基因是dmy18，目前与弓背青鳉相关的研究19,20均选用有dmy的群体。本课题组从海南三亚沿岸水域采集青鳉个体，并鉴定为弓背青鳉，称为弓背青鳉三亚群体，下称三亚青鳉（SY-medaka）。通过遗传性别鉴定、基因组重测序和性腺转录组分析，初步证实三亚青鳉不含雄性性别决定基因 dmy21,22，目前尚缺乏快速鉴定三亚青鳉遗传性别的分子标记。本研究基于全基因组重测序对三亚青鳉的雄鱼和雌鱼 进 行 混 池 测 序，参 考 染 色 体 商（Chromosomequotient，CQ）方法筛选雄性特异性序列区域，在特异性序列区域设计多对引物，通过PCR扩增验证引物标记在三亚青鳉群体及其子代的性别特异性，成功开发三亚青鳉的雄性特异性标记，为进一步挖掘其性别决定基因奠定基础。1 材料与方法1.1 实验用鱼青鳉个体（三亚青鳉）采自我国海南三亚沿岸水域（18.25N、109.50E）。三亚青鳉F1代和F2代由本实验室驯养繁育。1.2 三亚青鳉性别鉴定三亚青鳉生理性别通过鱼体表型和性腺解剖形态23初步判断，再由性腺组织学切片鉴定。将丁香酚与无水乙醇按体积比1 9混合，对弓背青鳉进行麻醉后立即剖取性腺，于40 g/L多聚甲醛固定液中固定24 h，脱水，浸蜡，包埋，切片厚度7 m，苏木精-伊红染色，倒置荧光显微镜拍照，鉴定三亚青鳉表型性别。1.3 全基因组重测序将三亚青鳉分为雌鱼（SYF）和雄鱼（SYM）2 组，每组取10尾鱼肌肉用苯酚-氯仿法提取基因组70第4期王中铎等：全基因组重测序筛选弓背青鳉三亚群体性别遗传标记ABCHiSeq Xten 测序平台进行双末端测序，每个样品的测序深度为 30。对测序后的原始数据进行严格过滤，以获得高质量的纯净数据（clean data），使用 BWA 软件将测序结果比对到弓背青鳉的参考基因组24，生成 bam 文件用于后续分析。1.4 基因组性别特异性区域筛选及可视化 用 CQ 方法筛选。结合重测序数据在原 CQ 方法上进行改动：用 BWA 软件将测序数据比对到参考基因组，通过滑窗法（步长 500 bp，窗口 1000 bp）统计每组青鳉窗口内的 reads 数量，同时参考 RNA-seq数据处理中的 TPM 标准化方法对测序深度进行标准化，计算每个窗口的 CQ。CQ=Hf/Hm，其中，Hf、Hm分别为窗口内雌、雄性样品比对上的 reads 数。以 CQ 30 的筛选标准对窗口进行筛选，并合并重叠窗口。用可视化工具 IGV（Integrative Genomics Viewer）对三亚青鳉雌鱼和雄鱼的 bam 文件进行可视化，导出筛选到的性别特异性序列，与参考基因组的对应区域作比对。1.5 三亚青鳉性别特异性标记引物的开发及验证 在 CQ 0.1 的特异性序列区域使用 primer3 软件批量设计引物，从中随机选取 60 对引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。扩增三亚青鳉基因组 DNA，分析雌、雄扩增差异。随机选取三亚青鳉雌鱼和雄鱼各 3 尾，对 60 对引物进行初筛，将筛出的性别特异性引物对三亚青鳉 60 尾性成熟个体（野生雌、雄各 12 尾；F1 代雌、雄各 10 尾；F2 代雌、雄各 8 尾）进行大样本扩增验证，并用来鉴定三亚青鳉 F2 代全同胞家系 94 个个体的雌雄性别比。PCR 扩增体系（20.0 L）：2PCR Mix Buffer 10.0 L，上下游引物各 0.3 L，模板 DNA 0.3 L，ddH2O 9.1 L。反应程序：94 3 min；94 30 s、57 30 s、72 50 s，30 个循环；72 5 min，4 条件下保存。通过琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。用董忠典等23开发的性别特异性引物（Ocsex-F/Ocsex-R）对三亚青鳉进行 PCR 扩增作为阳性对照（三亚青鳉群体无 dmy 基因，雌、雄鱼均只扩出一条 DNA 条带）。2 结果 2.1 三亚青鳉性别鉴定 三亚青鳉生理性别由臀鳍形状、性腺解剖形态及性腺组织学切片鉴定（图 1），鉴定后的三亚青鳉雌、雄鱼用于全基因组重测序及 PCR 扩增验证。A A.鱼体表型，方框为臀鳍形状；B-C.性腺组织学切片，左为卵巢，右为精巢，“”所指为性腺。A.Fish phenotype,with the anal fin shape in the box;B-C.Histological sections of the gonads,ovary on the left,spermathecae on the right,and the“”refers to the gonads.图 1 三亚青鳉生理性别鉴定 Fig.1 SY-medaka physiological sex determination 2.2 三亚青鳉全基因组重测序 经过滤，获得127.6 G的高质量全基因组重测序数据，将其比对到参考基因组上，平均比对率为95.18%，Q20平均值为 96.91%，Q30平均值为 92.02%，说明测序数据质量良好，可用于后续分析（表 1）。表 1 数据产出和比对情况 Table 1 Data output and mapping 组别 Groups 干净数据读数 Clean reads 干净碱基 Clean bases Q20/%Q30/%平均测序深度 Average sequencing depth 比对率 Comparison rate/%SYF 200 823 264 30 123 489 600 96.81 91.76 35.78 94.15 SYM 181 760 774 27 264 116 100 97.01 92.27 32.38 96.21 2.3 性别特异性区域及可视化 CQ 分析筛选得到三亚青鳉雄鱼的 279 个特异性区域（CQ 0.1）。IGV 可视化 bam 文件直观显示，雄鱼特异序列区域的重测序 reads 覆盖度远大于雌鱼（图 2）。提取性别特异性区域的组装序列比对核查，并设计引物（图 3）。方框为 SEQ30-3-ocF/R 引物对扩增片段区域 Amplification fragment regions with primers SEQ30-3-ocF/R was marked by box 图 2 性别特异性区域及引物扩增片段区域可视化 Fig.2 Visualization of some sex-specific region and primer-amplified fragment region C B 100 m 100 m 图1三亚青鳉生理性别鉴定Fig.1SY-medaka physiological sex determinationA.鱼体表型，方框为臀鳍形状；B-C.性腺组织学切片，左为卵巢，右为精巢，“”所指为性腺。A.Fish phenotype,with the anal fin shape in the box;B-C.Histologicalsections of the gonads,ovary on the left,spermathecae on the right,and the“”refers to the gonads.DNA。用NanoDrop2000分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检查基因组DNA质量。将三亚青鳉雌性和雄性DNA分别等量混合，构建雌、雄2个基因组DNA样品池，进行建库测序，测序文库的片段大小为350 bp，使用Illumina HiSeq Xten测序平台进行双末端测序，每个样品的测序深度为30。对测序后的原始数据进行严格过滤，以获得高质量的纯净数据（clean data），使用BWA软件将测序结果比对到弓背青鳉的参考基因组24，生成bam文件用于后续分析。1.4 基因组性别特异性区域筛选及可视化用CQ方法筛选。结合重测序数据在原CQ方法上进行改动：用BWA软件将测序数据比对到参考基因组，通过滑窗法（步长500 bp，窗口1 000 bp）统计每组青鳉窗口内的reads数量，同时参考RNA-seq数据处理中的TPM标准化方法对测序深度进行标准化，计算每个窗口的CQ。CQ=Hf/Hm，其中，Hf、Hm分别为窗口内雌、雄性样品比对上的 reads 数。以CQ 30的筛选标准对窗口进行筛选，并合并重叠窗口。用可视化工具 IGV（IntegrativeGenomics Viewer）对三亚青鳉雌鱼和雄鱼的bam文件进行可视化，导出筛选到的性别特异性序列，与参考基因组的对应区域作比对。1.5 三亚青鳉性别特异性标记引物的开发及验证在CQ 0.1的特异性序列区域使用primer3软件批量设计引物，从中随机选取 60对引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。扩增三亚青鳉基因组DNA，分析雌、雄扩增差异。随机选取三亚青鳉雌鱼和雄鱼各3尾，对60对引物进行初筛，将筛出的性别特异性引物对三亚青鳉60尾性成熟个体（野生雌、雄各 12 尾；F1 代雌、雄各 10 尾；F2代雌、雄各8尾）进行大样本扩增验证，并用来鉴定三亚青鳉 F2 代全同胞家系 94 个个体的雌雄性别比。PCR 扩增体系（20.0 L）：2PCR Mix Buffer10.0 L，上下游引物各 0.3 L，模板 DNA 0.3 L，ddH2O 9.1 L。反应程序：94 3 min；94 30 s、57 30 s、72 50 s，30个循环；72 5 min，4 条件下保存。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。用董忠典等23开发的性别特异性引物（Ocsex-F/Ocsex-R）对三亚青鳉进行 PCR扩增作为阳性对照（三亚青鳉群体无dmy基因，雌、雄鱼均只扩出一条DNA条带）。2 结果2.1 三亚青鳉性别鉴定三亚青鳉生理性别由臀鳍形状、性腺解剖形态及性腺组织学切片鉴定（图1），鉴定后的三亚青鳉雌、雄鱼用于全基因组重测序及PCR扩增验证。2.2 三亚青鳉全基因组重测序经过滤，获得 127.6 G 的高质量全基因组重测序数据，将其比对到参考基因组上，平均比对率为95.18%，Q20平均值为96.91%，Q30平均值为92.02%，说明测序数据质量良好，可用于后续分析（表1）。2.3 性别特异性区域及可视化CQ分析筛选得到三亚青鳉雄鱼的279个特异性区域（CQ 0.1）。IGV 可视化 bam 文件直观显示，雄鱼特异序列区域的重测序reads覆盖度远大于雌鱼（图2）。提取性别特异性区域的组装序列比对核查，并设计引物（图3）。2.4 性别特异性标记引物的开发及验证性别特异性引物（Ocsex-F/Ocsex-R）扩增结果71第43卷广东海洋大学学报SYM CoverageSYM.bam()SYF CoverageSYF.bam()Chr14:36 633 72736 636 90036 634 000 bp36 635 000 bp3175 bp36 636 000 bp雌鱼无reads覆盖图2性别特异性区域及引物扩增片段区域可视化Fig.2Visualization of some sex-specific region andprimer-amplified fragment region方框为SEQ30-3-ocF/R引物对扩增片段区域。Amplification fragment regions with primers SEQ30-3-ocF/R wasmarked by box.表明，三亚青鳉3雌3雄均扩增出一条959 bp的DNA条带（图4(A)），说明所提取DNA可用于后续实验。初筛结果显示，29对引物（表2）在雄性青鳉个体均扩增出单一DNA条带，雌性个体均无条带，达到鉴别雌雄的效果。部分标记引物扩增结果见图4(B)。从29对引物中随机选取两对引物SEQ30-3和SEQ32-2分别记为Marker1和Marker2，进行后续大样本三亚青鳉群体PCR扩增。结果显示，2对引物标记对雄性个体分别扩增出791、556 bp的条带（图5），鉴定的遗传性别与表型性别100%吻合，表明这2对标记引物在三亚青鳉及其子代中有稳定性和通用性，可广泛用于三亚青鳉遗传性别鉴定。性别特异性引物Marker1和Marker2用于估计三亚青鳉 F2 代全同胞家系 94 个个体的自然性别比，结果显示，两对标记引物鉴定的该F2代全同胞家系的遗传性别比（雌、雄鱼比）均为 45 49（1 1.09），约为1 1（图6）。图3性别特异性区域雌雄鱼序列比对及特异性引物位置Fig.3Sequence comparison of male and female fish in sex-specific region and specific primer position“.”表示缺失序列；“|”表示相同序列；阴影部分为引物位置。“.”means missing sequences;“|”indicates the same sequence;the shades are primer positions.“.”表示缺失序列；“|”表示相同序列；阴影部分为引物位置“.”means missing sequences;“|”indicates the same sequence;the shades are primer positions 图 3 性别特异性区域雌雄鱼序列比对及特异性引物位置 Fig.3 Sequence comparison of male and female fish in sex-specific region and specific primer position 2.4 性别特异性标记引物的开发及验证 性别特异性引物（Ocsex-F/Ocsex-R）扩增结果表明，三亚青鳉 3 雌 3 雄均扩增出一条 959 bp 的 DNA条带（图 4(A)），说明所提取 DNA 可用于后续实验。初筛结果显示，29 对引物（表 2）在雄性青鳉个体均扩增出单一 DNA 条带，雌性个体均无条带，达到鉴别雌雄的效果。部分标记引物扩增结果见图 4(B)。表 2 29 对特异性性别标记引物 Table 2 29 pairs of sex-specific primer 引物Primers 序列Sequences（53）引物Primers 序列Sequences（53）引物Primers 序列Sequences（53）SEQ19-3-ocF GGGATCGTCTTTAAAGATCACCT SEQ32-2-ocF AGTGACACTGGGCAAGATTATAG SEQ79-6-ocF GAGAACCAATCGGAGAACTAGTT SEQ19-3-ocR CACCATTATTTGAGAAGGACTGC SEQ32-2-ocR TCATAGGTGGGCATAGTTCATTC SEQ79-6-ocR AGTAAGCCTGAAGGGAAAGTTAG SEQ21-4-ocF CTGAGTCTGGATTGAGTTCTCAA SEQ33-2-ocF GGAATCATTTGATAGCAGCCAGA SEQ79-9-ocF AGGGAGTCATAATTGTCAGCTTC SEQ21-4-ocR GACACCAACAGCTGACATTAATG SEQ33-2-ocR CCATGATCTTCAGAAGGACTTCA SEQ79-9-ocR AAGACGTTTCCTCAAGGTAAGAG SEQ23-1-ocF TGACTCTGATCTGCATTTCTCTC SEQ35-3-ocF CCTTTAACCCTACATTTAGCCCT SEQ80-9-ocF GAGAACAGTTTATTGCAATGAGGG SEQ23-1-ocR GTACTACTGCGTTCATTAGGTGA SEQ35-3-ocR GATTGTGTACGTGTTAAGCTTGG SEQ80-9-ocR GATTAATGCTGCCATGCTTCAA SEQ23-3-ocF GCCTCATTAAATACAGGAGGTGA SEQ37-9-ocF GAATCAGACACACATGGAGTCTT SEQ83-3-ocF AAACACATGTGTCAGGGATATCC SEQ23-3-ocR GTTGGATCCTAGAGGTTCAAACA SEQ37-9-ocR GGAGACACCCACAATTAAGTCAT SEQ83-3-ocR CCTAGGAGGAGTTTGAACTTGTA SEQ24-2-ocF TTCTACTGTCCTATGGCGTATTG SEQ60-1-ocF ACCACATGTATGTACTAGGCAAG SEQ85-5-ocF GTCACCACTGTTAAGTTCCTACT SEQ24-2-ocR CACCTCCAAAGACAAATGACAAC SEQ60-1-ocR GCATTGTCTCATTTGGTAAGGTC SEQ85-5-ocR GCTAAACAGGAATGTCTTGAGTC SEQ25-2-ocF TAATCTTGGAAATCTCGCAAGGG SEQ60-5-ocF GATGACAACTTCCAACGGTAAAG SEQ86-6-ocF GCAAAGCAGATGACCTAACAATG SEQ25-2-ocR GGTAAGGCCTTATTGGATTGAGT SEQ60-5-ocR CTACCATAGCTCAACGAAACCAA SEQ86-6-ocR CTGACATACCCAGAGTAAGCAAA SEQ29-7-ocF CGGCACTCAATAGATATTAGCAC SEQ61-5-ocF TATAGCAGTCTTTAGGGTTGCAG SEQ92-8-ocF AGCCTAACCCTAACCCTATCTTT SEQ29-7-ocR GAAGCTGAAGGTTCTTAACGATG SEQ61-5-ocR CTGCCAGACACATTGGTATTAAC SEQ92-8-ocR GGTCTCAACTCATCAATGTGAAC SEQ30-3-ocF CTAAGTCTGGGTTGAGTTCTCAA SEQ67-3-ocF GATCTGTAGTGAGAGCAGAGAAC SEQ95-5-ocF ATGCTCAAGAATAGAGGAGAGGA SEQ30-3-ocR ACTAAGAGAAACGTTGAGAAGGG SEQ67-3-ocR CAGTGTGTCCAAATCATCTCAAC SEQ95-5-ocR GCTGATAGCTGATGATGAGATGA SEQ31-10-ocF TGTCTGGACATTTCCCATATGTG SEQ69-6-ocF ATTGGTTTGCTCTAGTAAGGCAG SEQ100-6-ocF CCATGGGTCACTGTTATTGAGTT SEQ31-10-ocR ATACCAGATCTCAGAGAATCCCA SEQ69-6-ocR TCACGGATGCCTTTACAGATTAG SEQ100-6-ocR GGGCTTCATTTATAAACGTACGC SEQ32-1-ocF ACCATGATTCCATCTGGTATGTC SEQ74-3-ocF GTCGTGACTGAATACTAGTCTCC SEQ32-1-ocR GATTCTCAGAGCTGTGGTTGATA SEQ74-3-ocR GTAGGATAATGTACCTGCATTCCA 1ACACCAATATGGAATTTTGAGGTATTTAAAATACTTATGTCATATATAAGGCACATCAAG|1ACACCAATATGGAATTTTGAGGTATTTAAAATACTTATGTCATATATAAGGCACATCAAG61CGATAAAGTGAGATAAAAGAGTCAGAGGAAAGTCAATCAAACTTTATTAACTCTGTT.|61CGATAAAGTGAGATAAAAGAGTCAGAGGAAAGTCAATCAAACTTTATTAACTCTGTTCAC118.661AAGATCTAAGTCTGGGTTGAGTTCTCAATGTTATAATGGTGAACTATTAATAAAAACTGT118.721AATGTTGCTTTAATTGAAATTTTACATATGTGAAACAACTTCTACAAATCTAGAATTCTC118.781TTTTACTGAATCTTAATCATTTCCAAATAGAACAACTACAAATGTTTTCAGATATATTTT118.841TTTTTTAGAAAGTGATTATCCACACGTGATTTTCTAAATACTTTTTCTGGGCCGCACCGA118.901CCAGGAAAAAAGTTTAAGGTTAGAATAAGGGTCACAGTTTGGATTAATGGTTCCTGACAC118.961ACACACACGCGCGCACACACACACACACACCCACCCCCAGAGGATGGATCAAATGCAAAG118.1021 AACACATTTCACGCGCCGAGGTTAATGACAATGAATGAAACCGGAGGCTAAAAACGATTA118.1081 AATCGGTTTCTGCAAAGTGGTGGGAGGTAAATTTGAAACTTGCCTCTGAGTTGTGGGCGT1141 TTTTCAACATTTTGTTGTCTGCTCCTGATTCACAACAATTTGAATAAAGAAATACTTGAA118.1201 ATAGATAAACATTTGAGCTCAACTTTCTTTATGTAAGAAAATGCTAAAAGCACCAAAACC118.1261 ACCATTAATGTCAGCTGTTGGTGTCAACCTAATTTATAAACCAAACACAGGGAAATTCAG118.1321 CAGAAATATATGTGTTCATACAGAAAGGCTGTTCATTAAATTCTGTCTGGACTTCTGAAA118.1381 AGAAGTTGGTTTTGCTTAAAAACTTTCTGTGTCTACAAAGCTGGGAAATCTTTCCCTTCT118.1441 CAACGTTTCTCTTAGTTCTGGCTCTGCATGAATTTATGAAACAGATTTACTTCCTCGGTC118.1501 GTTTTCATGTGGCTCACAACTTCATGATAGCAGCTGTCACCTCAAGTTCACTTTGAGATT118.GGAC|1561 CTGTGCAAATTTGAATTTGTGTGTTTTTTTTGTTTTTTTTGTTTTTTGGGGGGGGGGGAC122TGGTGCATATGAAACCAGGGTTCCATTCTCAGGGGGGGCCAATGAGCTTCATTCAGATTC|1621 TGGTGCATATGAAACCAGGGTTCCATTCTCAGGGGGGGCCAATGAGCTTCATTCAGATTC182TTCAGGCTACTTAAGCCTGAAACAGACTGAAAAACTTGCATAGCGACGCATAAACCCAAG|1681 TTCAGGCTACTTAAGCMMMMMMMMMMMMMMMMFMMMMFFFFFFFFFFFFFFFFFF A.bp 2000 1000 750 500 250 100 M 1 2 3 1 2 3 959 bp SEQ37-9 SEQ19-3 SEQ32-2 B.M 1 2 3 1 2 3 1 2 31 2 3 1 2 3 1 2 3 批注批注 A1:这个表内容较多，请缩小字符间距或缩放字符，我这里的字符间距是紧缩 0.1，缩放 85%，字体也小于小五号，字号为 8 图4部分特异性区域引物及Ocsex引物对三亚青鳉PCR扩增产物Fig.4PCR amplification products of some specific region primers and Ocsex primer for wild SY-medakaA.Ocsex引物PCR扩增产物；B.部分特异性引物PCR扩增产物；M，Trans2K DNA Marker。A.Ocsex primer PCR amplification product;B.Partial specific primer PCR amplification product;M,Trans2K DNA Marker.“.”表示缺失序列；“|”表示相同序列；阴影部分为引物位置“.”means missing sequences;“|”indicates the same sequence;the shades are primer positions图 3 性别特异性区域雌雄鱼序列比对及特异性引物位置 Fig.3 Sequence comparison of male and female fish in sex-specific region and specific primer position 2.4 性别特异性标记引物的开发及验证性别特异性引物（Ocsex-F/Ocsex-R）扩增结果表明，三亚青鳉 3 雌 3 雄均扩增出一条 959 bp 的 DNA条带（图 4(A)），说明所提取 DNA 可用于后续实验。初筛结果显示，29 对引物（表 2）在雄性青鳉个体均扩增出单一 DNA 条带，雌性个体均无条带，达到鉴别雌雄的效果。部分标记引物扩增结果见图 4(B)。表 2 29 对特异性性别标记引物 Table 229 pairs of sex-specific primer 引物Primers 序列Sequences（53）引物Primers 序列Sequences（53）引物Primers 序列Sequences（53）SEQ19-3-ocF GGGATCGTCTTTAAAGATCACCT SEQ32-2-ocF AGTGACACTGGGCAAGATTATAG SEQ79-6-ocF GAGAACCAATCGGAGAACTAGTT SEQ19-3-ocR CACCATTATTTGAGAAGGACTGC SEQ32-2-ocR TCATAGGTGGGCATAGTTCATTC SEQ79-6-ocR AGTAAGCCTGAAGGGAAAGTTAG SEQ21-4-ocF CTGAGTCTGGATTGAGTTCTCAA SEQ33-2-ocF GGAATCATTTGATAGCAGCCAGA SEQ79-9-ocF AGGGAGTCATAATTGTCAGCTTC SEQ21-4-ocR GACACCAACAGCTG