缺血性脑损伤对SD大鼠肠道菌群的影响.pdf

缺血性脑损伤对 大鼠肠道菌群的影响盛 雪张慧明马光宇仲昭泓陈珏晓 (.佳木斯大学基础医学院黑龙江 佳木斯.黑龙江省微生态 免疫调节网络与相关疾病重点实验室黑龙江 佳木斯.暨南大学附属第一医院妇产科 广东 广州)摘要:目的:探讨正常大鼠与缺血型脑损伤大鼠之间粪便菌群的差异性及规律为临床缺血性脑损伤患者的治疗提供理论和实验依据 方法:将采购于佳木斯大学动物实验中心的成年雄性 大鼠随机选取 只分为模型组与标准组每组 只 标准组随机分配每组 只编号为 组模型组进行术后脑损伤病理的评估与分级根据不同脑损伤程度分为 组编号为 组 模型组采用双侧颈动脉结扎法构建脑缺血大鼠模型将 大鼠左右两侧颈总动脉永久结扎术后并对大鼠进行病理评估 一段时间后分别采取标准组和模型组大鼠粪便对样本粪便中细菌的 核糖体 进行基因测序并对结果进行统计学分析 结果:实验组大鼠粪便标本中厚壁菌门数量明显低于标准大鼠而拟杆菌门、变形菌门、放线菌门数量明显增加差异有统计学意义(.)结论:脑损伤大鼠紊乱的肠道菌群加重脑缺血倾向和脑损伤程度 在脑缺血损伤状态下实验大鼠粪便标本中有益菌数量减少机会致病菌增加 且伴随着损伤程度的增加有益菌数量的减少呈正比关系关键词:肠道菌群缺血性脑损伤菌群分析中图分类号:文献标识码:文章编号:()肠道菌群在机体代谢、免疫防御以及维持宿主细胞正常生命活动中发挥着重要作用 作为机体的基因库和第二大脑肠道菌群是哺乳动物系统中规模最为庞大、成分最为复杂的微生物系统 机体肠道中孕育着最复杂的微生物群落它与宿主共生并参与调节宿主的肠道稳态平衡是一套复杂的共生体系 一般认为肠道内含有有益菌和致病菌两类菌群二者相互制约、相互影响共同维持肠道内环境稳定 研究证实肠道菌群参与并影响机体消化、内分泌等重要的生命机制肠道微生物与多个器官都有直接或间接的联系特别是与肾脏、脑的功能相联系肠道微生物群可以通过代谢、体循环以及神经传导通路与炎症、心血管和脑相互作用 目前对肠道中的微生物进行形态分析和功能划分是研究领域的一大热点 多项研究证实肠道菌群失调与缺血性脑损伤致病危险因素息息相关 因此我们有依据推测肠道菌群在缺血性脑损伤的发展中发挥着必然的作用 因此本实验通过分析实验动物粪便标本中微生物形态、种类以及数量的变化探索肠道菌群与缺血性脑损伤发病的潜在联系与相互作用机制为临床诊疗缺血性脑损伤提供新手段 材料和方法.材料本实验选用成年雄性 大鼠 周龄体质量 清洁级均采购于佳木斯大学动物实验中心 饲养环境清洁、消毒、适宜温度 与湿度 、光照充足 标准组大鼠自由饮水与进食实验组大鼠术前禁食禁水 术后逐渐恢复饮水与进食.实验方法.动物模型制备将 只成年雄性 大鼠随机分配每组 只分为两组即模型组与标准组 标准组又以每组 只随机分为 组标记为 组模型组的 只大鼠术后进行分组依据术后脑损伤程度的评估与分级将造模成功的大鼠以每组 只分为 组标记为 组其中 组损伤程度逐渐增加向随机分配的 只模型组 大鼠腹腔注射水合氯醛观察大鼠的肌张力变化待大鼠麻醉充分后将大鼠平卧位固定在无菌手术操作台上术前进行常规灭菌消毒将固定好的 大鼠沿颈前正中线做大约长为 的纵行切口使血管与神经充分暴露 后用玻璃分针小心剥离出大鼠的双侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉切勿伤及迷走神经然后分别将左右颈总动脉永久性结扎 手术后局部皮肤用碘伏涂抹每日每只大鼠注射青霉素抗感染连续 术后观察大鼠行为状态与表现待大鼠清醒后对大鼠神经受损程度行为评分并按照损伤等级程度分为 组.粪便采集待大鼠饲养 后按照、时间点采集粪便 采用医用无菌粪便盒取样用灭菌的镊子夹取大鼠的粪便使用后用酒精棉球反复擦拭镊子进行消毒灭菌 将采集好的大鼠粪便放入准备好的无菌 管 每只大鼠粪便标本量应控制为在 左右且不少于 将采集好的粪便样本立刻放入冰箱进行封存 黑龙江医药科学 年 月第 卷第 期基金项目:.黑龙江省大学生创新创业训练计划创新训练项目编号:.黑龙江省卫生健康委科研课题编号:.北药与功能食品特色学科建设项目(年)作者简介:盛雪()女山东聊城人在读硕士研究生通信作者:陈珏晓()女河南洛阳人硕士讲师 :.粪便细菌 提取与检测选用传统的 基因检测技术对粪便样本中微生物进行检测 基因是细菌编码核糖体 相对应的 序列它包含 个高变区()和 个保守区()高变区反映种间差异关系保守区反映种间亲缘关系 存在于原核生物的基因组 中 具有高度的特异性、保守性和稳定性 突变发生率低是适用于微生物系统发育和鉴定的指标 的编码序列为 但是在实验中 的提取相对较难而 提取相对容易些所以本实验对 进行测序分析 测序的基本原理是 扩增 选择一段通用引物对环境中样本微生物进行扩增然后进行高通量测序并于已有数据库进行对比分析从而对环境中样本微生物群落多样性进行研究 基因检测技术现已成为微生物检测和鉴定的一种强有力工具结果.稀释性曲线 稀释性曲线以个体数和物种数来构建 稀释性曲线可以用来比较不同样本丰富度的差异也可代表样本量的合理性与数据的可信性 本实验构建稀释性曲线用于检测样本数据是否合理 当曲线趋于平坦时说明实验数据量合理 如图 所示样本 曲线均趋于平坦说明 组数据均合理有统计学意义图 稀释性曲线注:横坐标:随机抽取的序列条数纵坐标:观测到的 数量.物种累积曲线 以样品量为横坐标抽样后 数量为纵坐标构建物种累积曲线图结果代表反映了连续随机抽样下新生 出现的速率 随着样品量的逐渐增加当群落中有大量新生物种被发现时曲线呈急剧上升趋势而当曲线趋于平稳时则表明此样本中新生物种不会随样本量增加而显著增加 如图 所示 组曲线陡峭 组曲线趋于平稳 说明在开始给予大鼠脑损伤时大鼠肠道内微生物数量和多样性发生急剧改变而伴随着脑损伤的进行这种改变趋于稳定和平衡图 物种累积曲线注:横坐标:样品量纵坐标:抽样后 数目.群落结构组成如图 所示门水平上大鼠各组肠道细菌菌门中 厚 壁 菌 门()、拟 杆 菌 门()、变形菌门()、放线菌门()是优势菌群含量比较少的菌门只在个别个体中出现 并且可以看出随着脑缺血损伤程度的改变厚壁菌门呈递减趋势在缺血组中厚壁菌门的比例下降而拟杆菌门、变形菌门、放线菌门数量明显增多其中、组样本中变形菌门数量显著增多可以推测拟杆菌门、变形菌门、放线菌门的增多可能与大鼠脑损伤有关图 门水平物种分布柱状图注:图中包含 的信息并且将每个物种在各样本中的丰度和小于.的合并为 讨论缺血性脑损伤发生后 大多伴有肠道并发症 在肠道微生物群与脑缺血作用的实验研究中发现老年宿主转移的微生物群可能导致局灶性脑缺血小鼠模型中功能性长期结果的恶化然而涉及的过程确切机制尚不清楚 最近的一项研究表明严重脑缺血后的微生物群特征发生了变化并伴有中风后生态失调诱导了促炎症免疫反应脑缺血后平衡微生物群的移植可改善卒中预后但是未具 .体说明何种菌群变化 多项研究表明肠道菌群的改善对干预与治疗缺血性脑损伤意义重大 随着生物与科学的进步研究人员对肠道菌群与脑 肠轴关系得到更加深入的研究 未来关于脑肠关系的科学研究将会有新的突破肠道菌群与脑损伤的联系作用机制得到进一步阐明这将对脑损伤的诊断和治疗提供新的方法和新的思路为缺血性脑损伤的临床治疗带来新的改变此实验研究发现缺血导致的脑损伤大鼠肠道菌群发生明显紊乱其肠道内优势菌较正常大鼠数量减少特别是乳杆菌属()、小球藻属()等含量降低明显 随着脑缺血时间的延长菌群结构发生更加明显的改变差异更加显著 大鼠优势菌门后壁菌门()降低明显而拟杆菌门()、变形菌门()、放线菌门()含量升高特别是变形菌门差异显著 此外在实验大鼠中某些新生菌群被发现且伴随着脑损伤程度的增加呈递增趋势说明在脑损伤大鼠肠道中微生物多样性发生急剧改变推测这可能与脑损伤的发展过程有关综上所述我们的实验研究表明脑损伤大鼠紊乱的肠道菌群加重脑缺血倾向和脑损伤程度 缺血性脑损伤大鼠肠道内存在着不同程度的菌群失衡失衡的菌群物种的丰富度和多样性降低 通过菌群粪便移植并进行 测序系统测序证实了肠道菌群紊乱程度与脑缺血程度呈正相关即脑实质损伤越严重肠内菌群紊乱程度越高 需提出的是我们的实验尚未对脑损伤与肠道菌群之间的作用机制作出阐明对脑缺血过程中肠道菌群的变化作用基础的研究仍需后续实验的进一步研究参考文献:.:.():.于淼曾宪章.肠道菌群对脑卒中后免疫功能影响的研究进展.中风与神经疾病杂志():.袁康顾津瑜许鹏飞等.氧化三甲胺与缺血性脑血管病关系的研究进展.中国脑血管病杂志():.夏耿红.肠菌紊乱促进卒中脑损伤:临床关联分析及动物实验研究.南方医科大学.姜明照.灯盏花素对脑缺血再灌注损伤大鼠肠道菌群、/信号通路及肠 的影响.大理大学.:.许海英颜玉姜威等.益生菌联合美沙拉嗪对大鼠溃疡性结肠炎 及 的影响.黑龙江医药科学():.苏晓曼张义李慧玲.肠杆菌科细菌的分布与耐药性的分析.黑龙江医药科学():.(收稿日期:)(上接第 页)降低和/通路激活 为观察 与/通路激活的相关性 本研究分别转染 和 结果显示转染 的高糖培养 细胞、在 和蛋白相对表达水平降低细胞培养液中 和 水平降低从而抑制/通路激活而转染 则可促进/通路激活 本研究结果提示与动脉粥样硬化、炎症性肠病和脑膜炎等研究中类似 可调控高糖培养 细胞/细胞通路可能在 的发生发展中发挥保护作用综上所述高糖处理 后可引起 降低上调 表达可通过抑制/通路激活减轻细胞的炎症反应本研究结果初步阐述了 在 发展中的作用丰富了 发病的分子机制为 治疗提供了新的线索参考文献:郑金凤王亚波周庆云.引发糖尿病视网膜病变的主要护理因素分析及对策.黑龙江医药科学():.崔翠齐艳秀宿星杰等.糖尿病性视网膜病变的病因与治疗的研究进展.黑龙江医药科学():.刘湘乔丽菲刘垚君等.芍药苷对脑缺血再灌注损伤大鼠 炎症体信号通路相关因子表达的影响.中国中医药信息杂志():.李奕萍王红琴王健等.阿托伐他汀抑制动脉粥样硬化患者 炎性体途径的研究.浙江医学():.吴伟滨汪睿武日东等.下调 炎性体表达抑制人血管平滑肌细胞分泌高迁移率族蛋白.第三军医大学学报():.():.朱成义伊琼马金力.银杏叶提取物对糖尿病视网膜病变的临床疗效评价.国际眼科杂志():.柴广睿刘姝陈晓隆.核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白()炎症体在眼科疾病中的研究进展.眼科新进展():.肖兰兰冯霞./通路在增殖性糖尿病视网膜病变中的作用机制.国际眼科杂志():.():.():.():.():.:.():.():.(收稿日期:)黑龙江医药科学 年 月第 卷第 期