合作猪StAR基因克隆、组织表达及生物信息学分析.pdf

华北农学报():收稿日期:基金项目:甘肃省教育科技创新项目()鲁甘科技协作项目()年现代丝路寒旱农业科技支撑项目()作者简介:闫尊强()男甘肃天水人讲师博士主要从事猪育种理论与技术研究通信作者:滚双宝()男甘肃张掖人教授博士博士生导师主要从事猪育种理论与技术研究合作猪 基因克隆、组织表达及生物信息学分析闫尊强计亚楠王鹏飞张 博石海霞滚双宝(.甘肃农业大学 动物科学技术学院甘肃 兰州.甘肃省现代养猪工程技术研究中心甘肃 兰州)摘要:旨在对合作猪 基因 区进行克隆及生物信息学分析采用 方法检测 基因在不同组织中的表达量以揭示其功能 结果发现合作猪 基因 区长 编码 个氨基酸与猪参考序列相比第 位点处的 突变为 导致第 位的赖氨酸突变成精氨酸为错义突变第 位点处插入 个碱基 后续的 个氨基酸发生改变导致移码突变蛋白分子量.理论等电点.消光系数 不稳定系数.含 个 糖基化位点二级结构主要由 螺旋和无规则卷曲构成二级结构与三级结构基本一致合作猪与猪、绵羊和黄牛 基因核苷酸序列相似性分别为.进化树结果显示合作猪与猪亲缘关系最近表明 基因编码序列具有种属特异性 蛋白是不稳定的亲水性蛋白无信号肽和跨膜区 基因在脾、肾、肺等组织中均有表达睾丸表达量较高表明可能与合作猪睾丸发育有关关键词:合作猪 基因生物信息学组织表达中图分类号:文献标识码:文章编号:():./.(.):.()().:类固醇激素合成急性调节基因()在睾丸、卵巢、肝脏等组织中表达编码的 蛋白是类固醇激素急性调节蛋白相关的脂质转移域家族的重要成员之一在类固 期闫尊强等:合作猪 基因克隆、组织表达及生物信息学分析 醇激素合成过程中起重要作用 蛋白主要由 螺旋和 折叠组成属于转运蛋白前体蛋白有 个氨基酸逐步加工为成熟蛋白活性部位为羧基端称为 相关脂质转运结构域()蛋白是类固醇激素合成过程中重要的限速酶能结合线粒体外膜中的胆固醇转运至内膜(羧基端协助胆固醇从含量多的线粒体外膜转运至含量低的线粒体内膜上氨基端引导其定位到线粒体上)进入内膜中的胆固醇被细胞色素 支链裂解酶催化生成孕烯醇酮孕烯醇酮离开线粒体后在机体不同组织中合成孕酮、睾酮、雌激素、醛固酮等类固醇激素 有研究表明 基因突变后胆固醇很难转化成孕烯醇酮导致先天性肾上腺增生 睾丸间质细胞 基因表达量降低引起间质细胞线粒体内膜的胆固醇供应减少睾酮生成不足造成不育 /小鼠卵巢中的脂质大量积累雌激素水平降低乳房发育不良说明 基因在动物生殖活动中有重要功能合作猪(又称山猪、蕨麻猪)适应极端恶劣气候环境主要分布于甘肃省甘南藏族自治州的合作、夏河、迭部等县(市)的高海拔牧区是我国独有的小型高原型猪种 基因与畜禽繁殖性能密切相关但未见合作猪 基因研究的报道 因此本试验通过克隆合作猪 基因并进行生物信息学分析利用实时荧光定量 技术检测不同组织中 基因表达量为深入研究该基因在合作公猪性成熟过程中的作用提供参考 材料和方法.样品采集选择甘肃省甘南藏族自治州农户放牧饲养的 月龄合作公猪屠宰后采集睾丸、心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、空肠和回肠组织液氮速冻带回实验室 保存.主要试剂 试剂购自北京全式金公司 反转录试剂盒、荧光定量试剂盒、载体购自 公司琼脂糖凝胶 回收试剂盒、感受态细胞和质粒提取试剂盒均购自天根公司其他试剂购自 公司.总 提取及反转录用 提取睾丸、心等组织总 用反转录试剂盒合成 反转录体系 :(./)反应 上一步骤的 反应液加 反应 反应 反应结束后 保存备用.引物设计及合成根据 收录的猪 基因序列(.)及内参 基因序列(.)引物使用.软件设计引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成(表)表 引物信息.基因名 转录本号.引物序列()()长度/用途.:扩增:定量:.:定量:.表达量检测以 为模板用 检测 基因在睾丸、心等组织中的表达量 反应体系 其中 上、下游引物各.(./).反应条件为 个循环 基因为内参用 法计算相对表达量用平均值 标准差()表示用 .软件中单因素方差 程序进行显著性检验.克隆及测序睾丸 基因 产物经 的琼脂糖凝胶电泳纯化目的片段与 载体连接并转入 细胞在不含 的液体培养基中振荡培养 取少许液体均匀涂抹于含有、和 的 固体培养基上 培养过夜 华 北 农 学 报 卷采集单个的白色菌落置入含有 的 液体培养基中摇菌 吸菌液做 提取大小与目的条带一致的菌液质粒进行 测序.生物信息学分析合作猪 基因生物信息学分析工具参见表 表 生物信息学分析工具.软件网址 功能用途 :/./.序列比对:/./蛋白质理化性质分析:/./蛋白质疏水性分析:/./.?./跨膜区分析.:/./信号肽分析:/./结构域分析:/./.亚细胞定位分析:/./.?.二级结构预测:/./三级结构预测.:/./糖基化位点预测:/./蛋白相互作用分析 结果与分析.基因克隆及测序 产物经 的琼脂糖凝胶电泳检测获得特异性条带与预期片段大小一致(图)测序后发现 区长 编码 个氨基酸其中第 位点处的 突变为 导致第 位点的赖氨酸突变成精氨酸为错义突变第 位点处插入 个碱基 导致随后 个氨基酸发生突变为移码突变(图)图 合作猪 基因 扩增.图 合作猪 基因测序结果分析.图 合作猪 蛋白氨基酸序列比对.期闫尊强等:合作猪 基因克隆、组织表达及生物信息学分析.基因同源性分析及系统进化树构建下载人(.)、绵羊(.)、狗(.)、黑猩猩(.)、家鼠(.)、马(.)、猕猴(.)、黄 牛(.)、猪(.)和鸡(.)的核苷酸序列使用 软件分析合作猪 基因的同源性(表)用 .软件构建 基因的进化树(图)结果发现合作猪与猪的亲缘关系最近其次为黄牛和绵羊与家鼠的亲缘关系最远表 合作猪 基因与其他物种序列比对.物种核苷酸序列相似性 氨基酸序列相似性 人 .绵羊 .狗 .黑猩猩 .家鼠 .马 .猕猴 .黄牛 .猪 .鸡 .图 基因系统进化树分析.蛋白理化性质分析使用 软件预测合作猪 蛋白的理化性质 结果显示分子式为 原子总数 分子量.理论等电点().消光系数()不稳定系数.理 论 半 衰 期 亲 水 性 平 均 值.氨基酸残基中亮氨酸(.)和精氨酸(.)比例较高带负电荷的天冬氨酸残基和谷氨酸残基 个带正电荷的精氨酸残基和赖氨酸残基 个(图)图 合作猪 蛋白的氨基酸组成及频率.蛋白二、三级结构预测运用在线软件 预测合作猪 蛋白二级结构发现二级结构由.的延伸链、.的转角、.的螺旋和.的无规则卷曲构成(图)采用在线软件 预测其三级结构发现三级结构主要由 螺旋、无规则卷曲构成(图)与二级结构预测基本一致.蛋白亲疏水性分析运用 在线软件 分析合作猪 蛋白的亲/疏水性氨基酸序列中第 位出.螺旋.转角.无规则卷曲.延伸链.图 合作猪 蛋白二级结构()及三级结构().()()华 北 农 学 报 卷现最小疏水值(.)第 位出现最大疏水值(.)疏水性氨基酸残基少于亲水性氨基酸残基推测为亲水性蛋白(图)图 合作猪 蛋白的疏水性分析.蛋白跨膜区域及信号肽分析采用 软件分析跨膜区域预测期望值为 无跨膜区域是非跨膜蛋白(图)使用 软件预测信号肽发现剪切位点分值()为.信号肽酶切位点分值()为.信号肽()的分值为.该蛋白不存在信号肽推测不是分泌蛋白(图).蛋白结构域预测使用 软件预测合作猪 蛋白结构域的位置和种类发现在 位氨基酸残基之间有一个 结构域属于 结构域蛋白超家族(图)图 合作猪 蛋白的跨膜区域()及信号肽().()()图 合作猪 蛋白保守结构域预测.蛋白糖基化修饰位点及亚细胞定位预测通过 .软件预测 蛋白糖基化修饰位点发现第 位氨基酸处存在 个 糖基修饰位点(图)采用 软件对合作猪 蛋白进行亚细胞定位发现分布在线粒体()、细胞质()、细胞核()和分泌系统的囊泡()推测是线粒体转运蛋白(图)图 合作猪 蛋白 糖基化位点及亚细胞定位.蛋白相互作用分析通过 .软件分析发现 蛋白可能与、等蛋白有相互作用(图)期闫尊强等:合作猪 基因克隆、组织表达及生物信息学分析 图 合作猪 蛋白网络互作分析图.基因在合作猪各组织中的表达量使用 检测 基因在合作猪不同组织中的表达水平发现所有组织均表达肺脏表达量最高其次睾丸且极显著高于脾脏、肾脏等组织(图)不同小写字母表示差异显著(.)不同大写字母表示差异极显著(.)(.)(.).图 基因在合作猪不同组织中的表达量.结论与讨论类固醇激素合成能力是影响畜禽繁殖力的重要因素之一 基因编码的蛋白产物是类固醇激素合成过程中的重要限速酶表达于肾上腺、卵巢睾丸、胎盘等组织对畜禽繁殖性状(如性别分化、精子发生、卵泡发育)有重要功能 /小鼠卵巢有早衰症状具体表现为脂质沉积基质细胞黄素化、卵泡不完全成熟等胚胎期 基因在动物睾丸间质细胞前体的胞间隙中表达随后在间质细胞中大量表达在支持细胞中微量表达最终影响生殖活动 研究发现人 基因序列的突变可引起肾上腺和性腺类固醇激素合成受阻表现为脂样肾功能增生综合征鸡 基因序列的突变影响胆固醇转运蛋白(如、)的表达量引起胆固醇激素合成受阻导致生殖机能异常 以上研究表明 基因对动物繁殖性状上有重要功能其核酸序列突变可引起蛋白质功能的改变影响动物繁殖目前关于合作猪 基因相关研究未见报道为获取合作猪 基因相关信息本试验以合作公猪睾丸组织 为模板克隆该基因发现 全长 编码 个氨基酸 刘宇等发现牦牛 基因 全长 编码 个氨基酸与本研究得到的结果一致 基因的突变会引起类固醇激素含量的改变影响睾丸功能 本研究发现与猪参考序列相比合作猪 基因共有 处突变第 位点处的 突变成 导致第 位的赖氨酸突变成精氨酸为错义突变第 位点处插入一个碱基 引起 端的 个氨基酸改变为移码突变 推测合作猪 蛋白中 个氨基酸的改变可提高蛋白活性高效转运更多胆固醇进入内膜生成睾酮等类固醇激素保证生活在高寒低氧环境中合作公猪正常的繁殖性能 为证实这种推测今后将在细胞(如睾丸间质细胞)水平过表达正常 基因(对应野生型蛋白)及 基因突变(对应突变型蛋白)检测细胞合成类固醇激素的速率及含量 基因与猪同源性最高遗传距离最近亲缘关系最近与黄牛绵羊具有较高的同源性在进化上是比较保守的 等对鱼类、哺乳动物等 蛋白氨基酸序列做了比较也发现该蛋白质在不同种类动物中具有很强的保守性与本研究结果一致 蛋白羧基端有一个 结构域各物种间十分保守在胆固醇运输过程中有重要功能本研究也发现 蛋白在 位氨基酸处有一个 保守结构域 合作猪 蛋白是不稳定的亲水性蛋白定位在线粒体这与杨沛方等在单、多羔黔北麻羊母羊性腺组织中 基因的研究结果一致 蛋白互作网络图显示其与(电压依赖性阴离子通道)等蛋白相互作用 属于线粒体孔道蛋白参与多种细胞代谢物/离子的跨膜转运 等研究发现肾上腺细胞中磷酸化 蛋白能与线粒体外膜上的 蛋白相互作用能促进 磷酸化 蛋白到 中间体的加工 采用 检测该基因在合作猪不同组织中的表达丰度结果发现睾丸表达量较高与 蛋白的功能及睾丸是类固醇激素主要来源的内分泌特性相吻合 华 北 农 学 报 卷本研究克隆了合作猪 基因 区长 编码 个氨基酸 是亲水性 蛋 白 有 典 型 的 结构域物种间十分保守睾丸表达量较高表明 基因在合作猪睾丸发育及性成熟过程中发挥了重要功能此研究为进一步解析合作猪 基因发挥功能的分子调控机制提供了参考参考文献:乌日罕 哈斯高娃 陈小辛 张睿 娜哈雅 娜仁花.类固醇激素合成急性调节蛋白()的研究进展.当代畜禽养殖业():.:./.().():.李娟 栾新红.类固醇合成急性调节蛋白的生物学特性及作用研究概况.动物医学进展():.:./.():.王草叶 王玉邦.类固醇激素合成急性调节蛋白研究进展.中华男科学杂志():.:./.():.():.:./.刘宇 邬建飞 李恒 荆天 卢建远 字向东.牦牛 基因克隆及其生物信息学与组织表达特性的研究.畜牧兽医学报():.:./.():.():.:.:./.:.():.:./().().():.:./.():.:./.():.:./.():.():.:./().:.:./.().():.:./.刘孟洲 王玉涛.合作猪种质特性的研究.中国畜牧杂志():.:./.():.陈国顺 滚双宝.合作猪种质资源调查研究.猪业科学 ():.:./.():.:.:./.():.:./.():.:./.():.:./.().():.:./.().:.:./.张育辉 李霞.类固醇激素合成急性调节蛋白的研究进展.陕西师范大学学报(自然科学版)():.:./.()():.:.:./.().(/):.:./().杨沛方 周志楠 敖叶 陈祥.黔北麻羊 基因的克隆、生物信息学分析及在单、多羔黔北麻羊不同性腺组织中的表达.中国畜牧杂志():.:./.():.():.:./.