高盐干预对人主动脉血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响.pdf

基金项目国家自然科学基金项目（81860084；82260076）收稿日期2022-11-11修回日期2023-01-20第一作者简介邓文斌，硕士研究生，主要从事动脉硬化研究。*通信作者：李利华，教授，博士，E-mail：。动脉粥样硬化是多种心血管疾病的发病基础，其发病受遗传、环境和不良生活方式等多种因素共同控制。在众多影响因素中，高盐摄入是常见但尚未被重视的因素之一1。限盐是心血管疾病防治的重要基础，同时限盐也是防治动脉粥样硬化的重要环节2-3。正常的血管平滑肌细胞呈非增殖性的收缩表型4，调节血管壁张力，维持组织血流量。血管损伤后，平滑肌细胞可进行表型转化，转变为增殖性的合成表型，合成和分泌多种血管活性物质及生长因子，并发生细胞增殖和迁移能力增强，导致血管壁增厚、管腔狭窄、血管顺应性降低和血管重构5-6。血管平滑肌细胞由收缩表型转变为合成表型的过程称之为表型转化7。血管平滑肌细胞的表型转化由多种因素和复杂的调控网络调控，其中高盐诱导就是一种重要因素。目前尚不十分明确限盐水平对动脉粥样硬化的防治有帮助，有必要进行进一步基础研究。盐处理对人主动脉血管平滑肌细胞（humanaorticvascularsmoothmusclecell，HAVSMC）增殖和迁移的影响仅有少量报道8。因此，研究高盐诱导对 HAVSMC 的增殖和迁移的影响，可以为限盐防治动脉粥样硬化提供科学依据。1材料与仪器1.1材料HAVSMC（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：CP-H081）；CCK-8 试剂盒（Proteintech 公司，批号：PF00004）；DMEM 高糖培养基（Gibco 公司，批号：C11995500BT）；胰蛋白酶（BI 公司，批号：03-050-1A）；胎牛血清（Gibco 公司，批号：10091148）；青霉素-链霉素（BI 公司，批号：03-031-1B）；实时荧光定量 PCR 试剂（Vazyme 公司，批号：Q711）；琢-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，琢-SMA）单克隆抗体（Abcam，批号：AB7817）；DAPI（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C1002）。1.2仪器多功能酶标仪（Bio-Rad 公司）；荧光显微镜（Olympus 公司）；细胞培养箱（Thermo Scientific公司）；荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad 公司）。2方法2.1HAVSMC 原代培养及鉴定在无菌条件下，使用 DMEM 高糖完全培养基（DMEM 高糖培养基+15%胎牛血清+1%青霉素-链霉素）进行 HAVSMC高盐干预对人主动脉血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响邓文斌，黄仕琼，王雪，李利华*（大理大学第一附属医院老年病科，云南大理671000）摘要目的：研究不同浓度 Na+干预对人主动脉血管平滑肌细胞（HAVSMC）增殖和迁移的影响。方法：原代培养 HAVSMC，传代至第 5 代后用不同浓度的 Na+（132、137、142、147、152、157、162、167 mmol/L）干预，培养 24、48、72、96 h 后进行细胞增殖和迁移实验。CCK-8 法检测 HAVSMC 的增殖活性；实时荧光定量聚合酶链反应检测增殖细胞核抗原（PCNA）表达，分析 HAVSMC的增殖能力；划痕实验评估 HAVSMC 的迁移能力。结果：与 132 mmol/L Na+对照组相比，培养 72 h 后，137耀167 mmol/L Na+干预均可促进 HAVSMC 的增殖能力（P0.05），Na+浓度为 152 mmol/L 时具有显著的促增殖作用（P0.05），且可促进 HAVSMC 的迁移。结论：高盐干预可促进 HAVSMC 增殖和迁移。关键词盐；人主动脉血管平滑肌细胞；增殖；迁移中图分类号R544.1文献标志码A文章编号2096-2266（2023）08-0054-05DOI10.3969/j.issn.2096-2266.2023.08.011大理大学学报JOURNAL OF DALI UNIVERSITY第8卷第8期2023年8月Vol.8No.8Aug.20232.6统计分析采用 GraphPad Prism 8.0.2 软件进行数据分析，计量资料用（x依s）表示，组间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P约0.05 为差异有统计学意义。3结果与分析3.1HAVSMC 的培养及鉴定HAVSMC 在 DMEM高糖完全培养基中培养，细胞生长交织成网状结构，当细胞融合度达到 80%以上时，于倒置显微镜下观察，在皿底排列呈峰谷样结构。见图 1A。通过琢-SMA 单克隆抗体进行细胞鉴定，结果显示细胞胞浆染色呈绿色，表明 琢-SMA 呈阳性；DAPI 染核结果清晰可见呈蓝色，具备 HAVSMC 的特异性。见图 1B。3.2高盐对 HAVSMC 增殖活性的影响用 CCK-8法检测细胞增殖活性，结果表明，与对照组相比，培养 72 h 后，实验组中 HAVSMC 细胞增殖活性增高，差异有统计学意义（P0.05）；培养 96 h 后，Na+浓度为 147、152、157 mmol/L 时，HAVSMC 增殖活性显著增高，差异有统计学意义（P0.05）。培养时间超过 24 h，当 Na+浓度为 152 mmol/L 时，促进细胞增殖作用最为显著。见表 2。的培养和鉴定。于 37 益、5%CO2、21%O2细胞培养箱中进行细胞传代和细胞培养，使用倒置显微镜检查细胞生长情况。利用 琢-SMA 单克隆抗体进行细胞鉴定。2.2实验分组取第 5 代 HAVSMC 进行实验，将其分为对照组和实验组。对照组为 DMEM 高糖完全培养基（Na+浓度为 132 mmol/L）中培养的 HAVSMC；实验组中 HAVSMC 分别在 Na+浓度为 137、142、147、152、157、162、167 mmol/L 的培养基中培养 24、48、72、96 h，筛选出促进细胞增殖的最佳 Na+浓度进行后续实验。2.3CCK-8 法检测细胞增殖活性HAVSMC 按4 000 个/孔的密度接种于 96 孔板中，每孔设 5 个复孔。在 37益、5%CO2培养箱中进行预培养，待细胞贴壁后，以低血清培养基（DMEM 高糖培养基+1%胎牛血清+1%青霉素-链霉素）同步化培养 24 h。分别在对照组和实验组中加入 10 滋L 的 CCK-8 溶液，37 益避光孵育 1 h，用酶标仪测定 450 nm 处的吸光度（OD）值，计算细胞增殖活性。细胞增殖活性=（实验组 OD 值-空白组 OD 值）/（对照组 OD 值-空白组 OD 值）伊100%。（空白组仅含 DMEM 高糖完全培养基）2.4划 痕 实 验 分 析 HAVSMC 迁 移 能 力152mmol/L Na+处理 HAVSMC 96 h，用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，以 1伊105个/孔接种至 12 孔培养板中，在低血清培养基中进行贴壁培养 12 h。使用200 滋L 移液器吸头制造相同宽度的划痕，用无菌PBS 冲洗 2 遍，继续用低血清培养基培养。每组细胞选取 5 个观察点，在 0 h 和 6 h 拍摄选择的观察点的照片，实验重复 3 次。使用 Image J 软件分析划痕宽度，计算细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h 划痕宽度-培养 6 h 后划痕宽度）/0 h 划痕宽度 伊100%。2.5实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chainreaction，PCR）检测高盐对 HAVSMC 增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达的影响收集 152 mmol/L Na+处理并培养 96 h 的HAVSMC 到 1.5 mL EP 管中，1 300 r/min 离心 5 min并弃上清液。按照 RNA 提取试剂盒说明提取 RNA，使用微量紫外分光光度计测定 RNA 的浓度和OD260/OD280比值。OD260/OD280范围在 1.8耀2.0 之间符合 RNA 纯度要求，在 20 滋L 逆转录反应体系中进行逆转录后进行 PCR。PCNA 基因引物序列见表 1。表 1PCR 引物序列基因名称引物序列（5寅3）产物长度/bpPCNA正向引物：CTCAAGAAGGTGTTGGAGGCA155反向引物：TCGCAGCGGTAGGTGTCGgapdh正向引物：TCGGAGTCAACGGATTTGGT118反向引物：TTCCCTTCTCAGCCTTGAC嗓嗓邓文斌，黄仕琼，王雪，等高盐干预对人主动脉血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响总第 92 期第 8 卷3.3152 mmol/L Na+干预对 HAVSMC 迁移能力的影响通过划痕实验观察，相较于对照组，Na+浓度为 152 mmol/L 时，划痕愈合能力呈现增强趋势。见封三图 2。与对照组比较，Na+浓度为 152 mmol/L 实验组的细胞迁移率升高，差异有统计学意义（P0.05）。见表 3。表 3152 mmol/L Na+对 HAVSMC 迁移能力及PCNA mRNA 相对表达量的影响（x依s，n=3）注：与对照组比较*P0.05，*P0.01。3.4152 mmol/L Na+干 预 对 HAVSMC 中 PCNAmRNA 表达的影响PCR 检测结果表明，相较于对照组，Na+浓度为 152 mmol/L 时，PCNA mRNA 表达显著增加，差异有统计学意义（P0.01）。见表 3。4讨论本研究结果表明，高盐干预对 HAVSMC 增殖和迁移有促进作用，Na+浓度为 152 mmol/L 时影响最为显著，这为后续的高盐相关机制和生物学行为研究提供了基础。高盐培养可使细胞外液中的 晕a+浓度升高9。本研究通过向培养基中加入适量的 NaCl 来模拟不同浓度的细胞外 Na+环境。研究结果显示，较高浓度的 Na+干预时间延长后反而不利于 HAVSMC 增殖，并可能导致部分细胞坏死。这可能是因为干预时间延长及 Na+浓度增高导致细胞内渗透压的改变所注：A 为细胞贴壁状态，B 为 琢-SMA 免疫荧光鉴定结果。图 1HAVSMC 显微镜下观察结果（伊100）粤月组别细胞迁移率/%PCNA mRNA 相对表达量对照组8.0依0.01.0依0.0实验组11.5依0.7*1.9依0.0*大理大学学报总第 92 期自然科学组别Na+浓度/（mmol/L）培养时间/h24487296132100.0依0.0100.0依0.0100.0依0.0100.0依0.0137107.7依5.8105.6依4.7111.5依5.9*101.8依5.014298.4依5.7102.4依4.8116.2依3.4*103.2依2.2147118.6依3.4*104.7依5.4131.0依3.4*124.8依3.5*152110.0依8.4*113.0依6.0*140.4依3.4*138.0依2.4*157111.7依6.5*108.8依3.6125.7依0.8*110.7依6.9*162102.2依4.1102.1依4.5124.6依3.8*104.6依2.116792.2依0.297.7依3.7120.3依6.9*99.7依1.9对照组实验组注：与对照组比较*P0.05，*P0.01。表 2高盐干预对 HAVSMC 增殖活性的影响（%，x依s，n=4）扇墒设设设设设设设设设设设设设设缮设设设设设设设设设设设设设设致。与此同时，研究结果表明，Na+干预的促增殖作用可以通过观察 PCNA mRNA 的表达得到有效证明。作为增殖细胞核抗原，PCNA 在细胞增殖的过程中起着重要作用10，这一结果进一步表明高盐干预能够促进 HAVSMC 的增殖。本研究还利用划痕实验验证了高浓度 Na+的干预能够显著提高 HAVSMC的迁移能力。研究结果为高盐条件下研究细胞增殖和迁移等相关过程提供了有益的参考。HAVSMC 的增殖和迁移能力增加是动脉粥样硬化发生发展的重要原因。本研究结果表明，高盐干预能够有效促进 HAVSMC 的增殖和迁移，这可能是进一步加强了 HAVSMC 向血管内膜迁移，增加了动脉内膜增厚的风险11-12。大量增殖和迁移的HAVSMC 可直接导致动脉内膜及中膜增厚，致使动脉管腔缩小、壁腔比值增加，并发生肥厚性内向性动脉重构8，13。重构的动脉反过来促进高血压的发展，形成恶性循环，最终影响心、脑和肾等器官的血供而导致这些器官受损。因此，本研究的发现具有一定的临床意义，为限盐防治动脉粥样硬化相关疾病提供了科学依据。本研究虽然发现高盐干预可促进 HAVSMC 增殖和迁移，但未探讨相关机制。此前的研究表明，高盐可诱导肾髓质中的缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor，HIF-1）及其靶基因的表达14。由于HIF-1 是诱导血管生成的主要参与者，如诱导血管平滑肌细胞的增殖和迁移等15-17，因此高盐得以通过 HIF-1 发挥其诱导作用。此外，高盐摄入可通过增加血容量而激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统18，进而刺激血管紧张素域（angiotensin 域，Ang域）的分泌并加重由 Ang 域引起的血管损伤。Ang域可通过激活胞膜离子交换蛋白 Na+-H+交换泵 1（Na+-H+exchanger 1，NHE1）使细胞内 pH 升高，高钠可使Ang 域诱导的 pH 升高进一步加强，且高钠通过 NHE1和胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2 依赖的途径直接促进 Ang域诱导的血管平滑肌细胞增殖19。此外，Wu 等20研究发现较高的钠水平本身通过 JNK/ERK1/2/PCNA 途径直接促进血管平滑肌细胞的增殖。同时，通过激活 p38 MAPK 信号通路，高钠对血管平滑肌细胞增殖的诱导作用可以维持在低水平。后续研究将进一步探讨 HIF-1，Ang 域和 JNK/ERK1/2/PCNA等相关信号通路是否参与高盐诱导的 HAVSMC 增殖和迁移。参考文献1RICCARDI G，GIOSU魬 A，CALABRESE I，et al.DietaryRecommendations for Prevention of AtherosclerosisJ.Cardiovasc Res，2022，118（5）：1188-1204.2TAYLOR R S，ASHTON K E，MOXHAM T，et al.ReducedDietary Salt for the Prevention of Cardiovascular Disease：A Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials（Coch-rane Review）J.Am J Hypertens，2011，24（8）：843-853.3IDELSON P I，DELIA L，CAIRELLA G，et al.Salt andHealth：Survey on Knowledge and Salt Intake RelatedBehaviour in Italy J.Nutrients，2020，12（2）：279.4DAVIS-DUSENBERY B N，WU C，HATA A.Micromanag-ingVascular SmoothMuscleCellDifferentiationandPhenotypic Modulation J.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011，31（11）：2370-2377.5OWENS G K，KUMAR M S，WAMHOFF B R.MolecularRegulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiationin Development and Disease J.Physiol Rev，2004，84（3）：767-801.6ORR A W，HASTINGS N E，BLACKMAN B R，et al.Complex Regulation and Function of the InflammatorySmooth Muscle Cell Phenotype in Atherosclerosis J.JVasc Res，2010，47（2）：168-180.7LU B H，LIU H B，GUO S X，et al.Long Non-CodingRNAs：ModulatorsofPhenotypicTransformationinVascular Smooth Muscle Cells J.Front Cardiovasc Med，2022，9：959955.8范静，商黔惠，邹焰，等.高血压家族史与高盐对人脐动脉平滑肌细胞转化生长因子 茁1/Smads 及钙离子调控相关基因表达的析因分析 J.中华高血压杂志，2014，22（11）：1043-1050.9XU L L，ZHAO Y，XU M S，et al.Effects of SaltingTreatmentonthePhysicochemicalProperties，TexturalProperties，and Microstructures of Duck Eggs J.PLoSOne，2017，12（8）：e0182912.10KURKI P，VANDERLAAN M，DOLBEARE F，et al.Expression of Proliferating Cell Nuclear Antigen（PCNA）/邓文斌，黄仕琼，王雪，等高盐干预对人主动脉血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响总第 92 期第 8 卷Cyclin during the Cell Cycle J.Exp Cell Res，1986，166（1）：209-219.11HIGASHI Y，MUMMIDI S，SUKHANOV S，et al.Minocy-cline Inhibits PDGF-BB-Induced Human Aortic SmoothMuscle Cell Proliferation and Migration by ReversingmiR-221-And-222-Mediated RECK SuppressionJ.Cell Signal，2019，57：10-20.12LUAN P P，JIAN W X，XU X，et al.NLRC5 InhibitsNeointimaFormationFollowingVascularInjuryandDirectly Interacts with PPAR酌 J.Nat Commun，2019，10（1）：2882.13XU D，LI J，LI R Y，et al.PD-L1 Expression Is Regulatedby NF-资B during EMT Signaling in Gastric Carcinoma J.Onco Targets Ther，2019，12：10099-10105.14WANG Z C，ZHU Q，XIA M，et al.Hypoxia-InducibleFactor Prolyl-Hydroxylase 2 Senses High-Salt Intake toIncrease Hypoxia Inducible Factor 1琢 Levels in theRenal MedullaJ.Hypertension，2010，55（5）：1129-1136.15CHEN J X，CHEN J D，HUANG J X，et al.HIF-2琢Upregulation Mediated by Hypoxia Promotes NAFLD-HCC Progression by Activating Lipid Synthesis via thePI3K-AKT-mTOR Pathway J.Aging，2019，11（23）：10839-10860.16JOSHI S，SINGH A R，ZULCIC M，et al.A Macrophage-DominantPI3KIsoformControlsHypoxia-InducedHIF1琢andHIF2琢StabilityandTumorGrowth，Angiogenesis，and Metastasis J.Mol Cancer Res，2014，12（10）：1520-1531.17HARRISA L.Hypoxia：A Key Regulatory Factor inTumour Growth J.Nat Rev Cancer，2002，2（1）：38-47.18SHIMOSAWA T.Salt，the Renin-Angiotensin-Aldoste-rone System and Resistant Hypertension J.HypertensRes，2013，36（8）：657-660.19LIU G，HITOMI H，RAHMAN A，et al.High SodiumAugments Angiotensin 域-Induced Vascular SmoothMuscleCellProliferationthroughtheERK1/2-Dependent Pathway J.Hypertens Res，2014，37（1）：13-18.20WU Y，ZHOU J，WANG H，et al.The Activation of P38MAPK Limits the Abnormal Proliferation of VascularSmoothMuscleCellsInducedbyHighSodiumConcentrations J.Int J Mol Med，2016，37（1）：74-82.大理大学学报总第 92 期自然科学Effects of High Salt Intervention on Proliferation and Migration of Human Aortic Vascular Smooth Muscle CellDeng Wenbin，Huang Shiqiong，Wang Xue，Li Lihua*（Department of Geriatrics，The First Affiliated Hospital of Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）AbstractObjective：To investigate the effects of different concentrations of Na+intervention on the proliferation and migration ofhuman aortic vascular smooth muscle cell（HAVSMC）.Methods：HAVSMC were cultured as primary cultures and were passaged tothe fifth generation.Cells were intervened with different concentrations of Na+（132，137，142，147，152，157，162，and 167 mmol/L），and cell proliferation and migration experiments were conducted at 24，48，72，and 96 hours after the intervention.Proliferationactivity of HAVSMC was detected by the CCK-8 method，and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）expression was analyzed byreal-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction in order to evaluate proliferation ability of HAVSMC.Additionally，scratch assay was employed to evaluate the migration ability of HAVSMC.Results：Compared with the 132 mmol/L Na+controlgroup，after 72 hours of cultivation，137-167 mmol/L Na+intervention promoted the proliferation ability of HAVSMC.Among allintervention groups（P0.05），Na+concentration of 152 mmol/L had a significant pro-proliferation effect（P0.05）and promoted themigration of HAVSMC.Conclusion：High salt intervention can promote the proliferation and migration of HAVSMC.Key wordssalt；human aortic vascular smooth muscle cell；proliferation；migration（责任编辑赵霞）近日，教育部公布第二批国家级一流本科课程名单，共有 5 750 门课程获认定，其中，线上课程 1 095 门，虚拟仿真实验教学课程 472 门，线上线下混合式课程 1 800门，线下课程 2 076 门，社会实践课程 307 门。根据教育部公布结果，大理大学外国语学院马丽亚老师负责的“基础泰语 2”和药学院张海珠老师负责的“药物分析”被认定为国家级一流本科课程。至此，大理大学共获批 2 门国家级一流本科课程、29 门省级一流本科课程。29 门省级一流本科课程包括 22 门线下一流课程：概率论与数理统计、护理学基础技能、金融学、外科护理学、微生物学、学前儿童游戏、循环系统疾病学、药理学、药物分析、组织学与胚胎学、基础泰语 2、病理学、医学微生物学、儿科护理学、生理学、中国当代文学、写意花鸟、环境工程学、音乐教育导论与教学法 1、播音学、生物化学、语言学概论；5 门线上线下混合式一流课程：程序设计基础、临床技能学、数据结构、系统解剖学、综合布线技术；2 门社会实践一流课程：行走的课堂“学生骨干宣讲法”为主的思政课实践教学、省内艺术实践。一流课程的建设和申报，使得“金课”的理念逐步深入人心，为大理大学推进一流本科专业建设，实现“一流大学、最美校园”的建设目标夯实基础。大理大学 2 门课程入选第二批国家级一流本科课程（教务处 供稿）注：AC 为 Con 组，DF 为 HG 组，GI 为 G HG 组；GSDMD 染色呈红色，细胞核 DAPI 染色呈蓝色。注：A、C 分别为对照组 0 h 和 6 h 的划痕，B、D 分别为实验组（Na+浓度为 152 mmol/L）0 h 和 6 h 的划痕。文 章 插 图GSDMDCon组HG组G HG组0 h6 h对照组实验组DAPI合并ADGBEHCFI图 1 GSDMD 在各组 AML-12 细胞中的荧光染色图（200）图 2 划痕实验结果图