扶桑绵粉蚧虫生真菌FE-1菌株的鉴定及其毒力测定.pdf

收稿日期：2023-04-05 基金项目：广东省林业科技计划项目（2018KJCX054）作者简介：毕可可（1981），男，硕士，高级工程师，研究方向为古树名木保护与复壮、林业园林植物保护和生物防治，E-mail：广东农业科学 2023，50（6）：107-115Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.06.013毕可可，邓嘉茹，张劲蔼，孙龙华.扶桑绵粉蚧虫生真菌 FE-1 菌株的鉴定及其毒力测定J.广东农业科学，2023，50（6）：107-115.扶桑绵粉蚧虫生真菌 FE-1 菌株的鉴定及其毒力测定毕可可，邓嘉茹，张劲蔼，孙龙华（广州市林业和园林科学研究院/广州市生态园林科技协同创新中心，广东 广州 510405）摘 要：【目的】评价从扶桑绵粉蚧（Phenacoccus solenoposis）僵虫中分离的虫生真菌在害虫生物防治中的应用潜力，为开发其作为生物防治制剂提供基础。【方法】采用组织分离法，从扶桑绵粉蚧僵虫中分离纯化虫生真菌菌株，综合培养性状、形态学特性和系统发育树分析，明确其分类学地位；利用扫描电镜技术，探究菌株对扶桑绵粉蚧的侵染方式，明确其对扶桑绵粉蚧的侵染力；采用浸虫法，室内测定分离菌株对扶桑绵粉蚧雌成虫的致病力。【结果】从扶桑绵粉蚧僵虫中分离纯化获得一株真菌菌株 FE-1，形态学结果发现菌株 FE-1在 PDA 培养基培养 5 d 后菌落直径为 5060 mm，菌落正面为橙白色，分生孢子形态呈两种类型，小型孢子为长柱形，大型孢子为镰刀型；综合培养性状、形态学特征和系统发育树分析结果鉴定菌株 FE-1 为木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）；扫描电镜结果表明菌株 FE-1 侵染扶桑绵粉蚧的方式主要为分生孢子在表皮处萌发形成芽管，然后水平生长，并在特定接触表皮处形成膨大的附着孢进入昆虫体腔，明确了菌株 FE-1 对扶桑绵粉蚧侵染力；室内毒力测定结果表明，菌株 FE-1 对扶桑绵粉蚧雌成虫的致病力随着分生孢子浓度的增大逐渐增强；孢子浓度为 1108 CFU/mL 时，LT50为 3.32 d，接种 7 d 后，扶桑绵粉蚧雌成虫的校正死亡率为 87.50（1.79）%，LC50为 1.8105 CFU/mL。【结论】从扶桑绵粉蚧僵虫中分离纯化获得的木贼镰刀菌菌株 FE-1，其在扶桑绵粉蚧体壁能形成膨大的附着孢进行侵染，对扶桑绵粉蚧具有一定的侵染力。同时，该菌株在室内对扶桑绵粉蚧雌成虫有较好的致死效果，极具生防潜力，可为扶桑绵粉蚧的生物防治研究提供优质的原材料。关键词：扶桑绵粉蚧；虫生真菌；分离；鉴定；木贼镰刀菌；致病力中图分类号：S476.15 文献标志码：A 文章编号：1004-874X（20 23）06-0107-09Identification and Virulence Assay of the Entomogenous Fungus FE-1 Strain Isolated from Phenacoccus solenoposis BI Keke,DENG Jiaru,ZHANG Jinai,SUN Longhua（Guangzhou Institute of Forestry and Landscape Architecture/Guangzhou Collaborative Innovation Center on Science-tech of Ecology and Landscape,Guangzhou 510405,China）Abstract:【Objective】This study aimed to evaluate the biocontrol potential of an entomogenous fungus strain isolated from Phenacoccus solenoposis,for providing the basis of its development as a biocontrol agent.【Method】The strain was isolated and purified from the diseased P.solenoposis using tissue isolation method.Based on the cultural traits,morphological traits and phylogenetic tree analysis,its taxonomic ststus was clarified.The infection mode of strain on P.solenoposis was explored by scanning electron microscope，which clarified its ability to infect P.solenoposis.The pathogenicity of the strain to P.solenoposis was measured by leaf dipping and insect dipping method.【Result】A strain FE-1 was isolated and purified from the diseased P.solenoposis,the morphological traits results showed that the colony diameter of strain FE-1 ranged from 50 to 60 mm at 5 days on PDA medium,and the colony was orange-white in front.The 108【研 究 意 义】扶 桑 绵 粉 蚧(Phenacoccus solenoposis)起源于北美洲，是一种扩繁速度快、寄主范围广、适应能力强的世界性入侵昆虫1。截至 2021 年，它已蔓延至除南极洲外其他各大洲超过 43 个国家和地区2，并且还在不断扩张。我国自 2008 年3首次发现扶桑绵粉蚧至 2022 年07 月，已有 14 个省的 125 个县（区、市）记录了扶桑绵粉蚧的出现4，共有 166 种寄主植物被报道5，对我国棉花产业、蔬菜和园林植物种植均带来较大的经济损失6-8。目前，针对扶桑绵粉蚧的防治，仍以化学防治为主，常用的化学药剂主要有毒死蜱、吡虫啉、啶虫脒、呋虫胺和螺虫乙酯等9-12。由于扶桑绵粉蚧具有繁殖力强、世代重叠、抗药性强及体背具有蜡壳等特点13，使其生态优势明显，在化学防治上难以取得突破，甚至引起的环境问题也日益凸显。虫生真菌是一类可以主动穿透昆虫蜡泌层和角质层进入昆虫体腔的真菌14，其具有生产成本较低、产孢量大且对环境友好等特点，是具有较好应用前景的生物防治手段之一15。因此，挖掘具有应用前景的扶桑绵粉蚧虫生真菌资源，对扶桑绵粉蚧绿色防治发展具有重要意义。【前人研究进展】目前世界上记载的虫生真菌约 100 属 1 000 多种，我国已发现的虫生真菌涉及 40 多属 400 多种16。国内外针对扶桑绵粉蚧虫生真菌的研究仍较少，主要集中在早期开发真菌的致病力测定及资源挖掘等。Ujjan17 测定了从野外采集和机构购买的共 36 个菌株对扶桑绵粉蚧不同虫龄的致病力，筛选出 7 个毒力较强的菌株，种类分别有金龟子绿僵菌（Metarrhizium anisopliae）、淡紫紫孢霉（Purpureocillium lilacinum）、玫烟棒束孢（Isaria farinosa）、球孢白僵菌（Beauvaria bassiana）和蜡蚧轮枝菌（Lecanicillium lecani）；Ujjan 等18 在室内筛选出对扶桑绵粉蚧致病力最强的金龟子绿僵菌菌株 PDRL526，且发现其与化学农药吡虫啉联合杀虫时的兼容效果最好。Khanzada 等19 在室内对比评估了 5 种常见虫生真菌对扶桑绵粉蚧的致病效果，发现玫烟棒束孢的致病效果最好。Nawaz 等 20在室内测定了球孢白僵菌（Bb-01、Bb-08）、金龟子绿僵菌（Ma-11.1、Ma-2.1）和玫烟棒束孢（If-2.3、If-02）对扶桑绵粉蚧 2 龄若虫的致病力，发现球孢白僵菌 Bb-08 的毒力最强。王震杰等21从扶桑绵粉蚧中分离得到了 5种真菌，回接后的最高侵染率为 66.7%，其中 4 种属于子囊菌门（Ascomycota）真菌，它们与扶桑绵粉蚧的关系可能为寄生或共生关系，而另外一种是担子菌门（Basidiomycota）真菌。袁盛勇等22-23在室内分别测定了球孢白僵菌 Bb1287 和蜡蚧轮枝菌 MZ041024 对扶桑绵粉蚧不同虫龄的致病力，发现该两种菌株对扶桑绵粉蚧若虫和成长均有较强的毒力。昆虫表皮是虫生真菌侵染过程的第一道屏障，由于虫生真菌接触至寄主昆虫体表后，需要在一定的温度和湿度下，经过一定的时间才能侵入，因此，虫生真菌是否侵染成功，与分生孢子在宿主体表的侵染过程密切相关24。虫生真菌侵染过程包含孢子附着在宿主体表、孢子萌发形成芽管、形成膨大附着胞穿透体壁和菌丝在宿主体内增殖 4 个阶段25。利用扫描电镜技术可以清晰地观察到分生孢子的侵染方式，是判断虫生真菌侵染能力的常用手段26-27。【本研究切入点】目前，可用于防控扶桑绵粉蚧的虫生真菌资源较少，具有生防潜力的菌株不足。因conidia morphology had two types,which small type was long column shape and large spore was sickle shape.The strain FE-1 was identified as Fusarium equiseti based on cultural traits,morphological traits and phglogenetic tree analysis.The strain FE-1 infected into the insect body cavity of P.solenoposis mainly by conidia germination forming germ tubes at the epidermis for growing horizontally,and the formation of expanded appressorium at the specific contact epidermis,which clarified its ability to infect P.solenoposis.The results of indoor toxicity measuremerts showed that the pathogenicity of strain FE-1 against female adults of P.solenoposis was gradually increased with the concentration of conidial suspension.At the spore concentration of 1108 CFU/mL,LT50 was 3.32 days,while at 7 days after inoculation,the adjusted mortality of P.solenoposis female adults was 87.501.79%,LC50 was 1.8105 CFU/mL.【Conclusion】A strain FE-1 isolated and purified from the diseased P.solenoposis can form expanded appressorium at the specific contact epidermis for infection,which clarifies its ability to infect P.solenoposis.Meanwhile,the strain FE-1 is highly pathogenic against P.solenoposis,which has great potential for biocontrol and provide original material for the biocontrol research of P.solenoposis.Key words:Phenacoccus solenoposis;entomogenous fungus;isolation;identification;Fusarium equiseti;pathogenicity109此，从扶桑绵粉蚧中挖掘致病力强病的虫生真菌资源，可为扶桑绵粉蚧的生物防控提供指导。【拟解决的关键问题】本研究于 2018 年 9 月，在上海普陀区采集到扶桑绵粉蚧僵虫，分离到一株虫生真菌菌株，结合形态学和分子系统学分析明确该菌株的分类地位。利用扫描电镜技术，观察菌株对扶桑绵粉蚧的侵染方式，明确其侵染能力。通过毒力测定，研究该菌株的生防潜力和应用前景，为挖掘更加安全、有效、持久控制的生物防治方法提供研究材料。1 材料与方法1.1 试验材料供试材料为 2018 年 9 月采集自上海普陀区扶桑树枝上的扶桑绵粉蚧僵虫。供试虫源：毒力测定所需健康的扶桑绵粉蚧来自广州市林业和园林科学研究院植物保护研究所，在温室大棚马铃薯叶片上常年继代饲养。供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基购自环凯微生物科技有限公司，按照使用说明配制，置于高压灭菌锅121灭菌15 min，备用。主要试剂：dNTP、Phanta Max Super-Fidelity DNA 聚合酶等 PCR 反应相关试剂购自南京诺唯赞生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。pEASY-T1 载体，购自北京全式金生物技术有限公司；所用引物由擎科新业生物技术有限公司（北京）合成。1.2 菌株分离纯化将扶桑绵粉蚧僵虫置于75%乙醇中浸泡30 s，再经 0.02%次氯酸钠浸泡 1 min 后，用无菌水冲洗 3 次，无菌滤纸吸干虫体表面水分，置于 PDA平板上 28培养。待长出菌丝或菌落后，挑取具有真菌菌落特征的单菌落进行 PDA 平板续代培养获得真菌纯培养物。然后进行单胞分离得到纯化菌株，记为FE-1，并接种于斜面试管，4保存备用。1.3 菌株鉴定1.3.1 形态鉴定 从纯化 FE-1 菌株的单菌落中取直径为 5 mm 的菌饼接在 PDA 平板中央，同时将灭菌后的盖玻片平放于菌饼，28 培养 7 d，每日观察菌落生长情况，记录菌落颜色和形态；待菌丝覆盖 1/2 盖玻片面积后，取盖玻片置于光学显微镜下观察菌丝和孢子形态。参照真菌鉴定手册28进行形态学鉴定。1.3.2 分子鉴定 利用 SDS 法提取菌株基因组 DNA，参照 White 等28设计的通用引物 ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）和 ITS5（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）进行 rDNA ITS序列的扩增与测定。50 L PCR 反应体系，dNTP 混 合 物 1 L、Phanta Max Super-Fidelity DNA 聚 合酶 1 L、上下游引物各 1 L，2Phanta Max Buffer 25 L 和 DNA 模板 1 L，ddH2O 补足至 50 L。PCR 扩增条件：95 预变性 3 min；95 下变性15 s，55退火 30 s，72 延伸 1 min；34 个循环，最后 72 延伸 5 min。扩增产物用 2%的琼脂凝胶电泳检测 DNA 片段。用胶回收试剂盒对PCR 产物进行回收，并将 PCR 产物连接克隆在pEASY-T1 载体上，将阳性克隆产物送至擎科新业生物技术有限公司测序。利用 NCBI BLAST 对所测序列进行比对分析，用 Mega 7.0 软件 Clustal X 方法进行多序列比对，以邻接法（Neighbor joining method）构建分子系统发育树。1.4 菌株侵染方式1.4.1 菌株前处理 采用浸虫法30，将含 0.02%吐 温-80 的 孢 子 悬 浮 液（浓 度 为 1107 CFU/mL）接种到扶桑绵粉蚧雌成虫，共接种 5 头，晾干后，置于 1%水琼脂板上，用无菌蒸馏水处理扶桑绵粉蚧作为对照。样品培养 23 d 后可见清晰的菌丝侵染虫体表面即可用 2.5%戊二醛 4 过夜固定，待脱水干燥。1.4.2 SEM 扫描电镜观察 将已过夜固定的扶桑绵粉蚧按以下方式进行脱水干燥：0.1 mol/L 的磷酸缓冲液冲洗 3 次，每次 10 min，蒸馏水冲洗 3次后，再依次用 70%、80%、90%、100%乙醇脱水（每次 5 min），然后用液态二氧化碳代替乙醇，利用 EMS 850 临界点干燥仪（美国 Electron Microscopy Sciences 公司）将样品干燥。最后将样品安装在短柱上，喷金后，即可在 SEM（S-3000N扫描电子显微镜，日本日立公司）上观察。1.5 毒力测定采用邓嘉茹等30浸虫法进行回接试验和生物学测定。将供试菌株接种于 PDA 平板上培养，待平板长满分生孢子后，用含 0.02%吐温-80 的无菌水洗脱分生孢子，摇匀后用双层纱布过滤，用血球计数板在生物显微镜下计数，统计初始浓度，再用含 0.05%吐温-80 的无菌水稀释至终浓 度 分 别 为 1104、1105、1106、1107、1101108 CFU/mL，待用。各取 30 头健康的扶桑绵粉蚧雌成虫置于直径 9 cm 的培养皿内，分别用小型喷雾器将上述提前配制的不同浓度的 1 mL 孢子悬浮液喷至虫体，浸泡 20 s，使孢子液与雌成虫充分接触，然后将其挑至扶桑叶片背面，晾干。带有扶桑叶片的枝条用浸水花泥保湿，置于 28 人工气候培养箱（RH 90%以上，12 L12 D）培养，以喷施 0.02%吐温-80 无菌水为空白对照。每组设 3 次重复，每个重复 30 头虫。在菌株接种后 2 d 开始观察并统计菌株对扶桑绵粉蚧雌成虫的侵染和致死情况，计算校正死亡率。校正死亡率=（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）100%。1.6 数据处理与分析试验所得数据采用 SPSS 22.0 软件进行 Probit 回归分析，得到回归方程，得出致死中浓度（LC50）和致死中时间（LT50）。2 结果与分析2.1 菌株 FE-1 的分离纯化从上海市普陀区一株扶桑枝条上采集获得扶桑绵粉蚧僵虫，置于体式显微镜观察（图 1A）。采用组织分离法，从扶桑绵粉蚧僵虫组织中分离出一个真菌菌落，经 PDA 平板传代培养，得到一株真菌纯培养物。进一步对真菌纯培养物进行单胞分离，纯化获得菌株 FE-1（图 1B）。菌株FE-1 菌落正面呈橙白色，菌丝棉絮状，菌落背面后期呈橙黄色。2.2 菌株 FE-1 的鉴定2.2.1 菌株 FE-1 的形态学特征 将菌株 FE-1置于 PDA 培养基 28 条件下，培养 5 d 后，菌落直径 5060 mm 之间。经光学显微镜观察发现孢子形态呈两种类型，小型孢子卵形或长圆形，12 个横隔（图 2A）；大型孢子长柱形或镰刀形，微弯，有较多横隔（图 2B）；分生孢子梗单生或丛生，菌丝无色有隔，细长分枝（图 2C）。结合上述菌落形态和孢子形状，发现其与镰刀菌属（Fusarium）形态特征一致。图1 扶桑绵粉蚧僵虫（A）和纯化的FE-1菌株菌落（B）形态Fig.1 The diseased P.solenoposis(A)and colony morphology of the purified strain FE-1(B)A：小型孢子；B：大型孢子；C：分生孢子梗A：Small spores；B：Large spores；C：Conidiophore图 2 菌株 FE-1 的形态学特征Fig.2 Morphological traits of strain FE-12.2.2 菌株 FE-1 的系统发育树分析 以 ITS4 和ITS5 为引物，FE-1 菌株基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，获得大小约 600 bp 的目的片段。将 PCR 产物克隆到 pEASY-T1 载体后送去测序，在 NCBI BLAST 对测序结果进行比对，发现其与镰刀菌属的木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）的 rDNA ITS 序列相似性达 99%；系统发育树显示，菌株 FE-1 的 rDNA ITS 序列与镰刀菌属的木贼镰刀菌（序列编号为 MH581383、MH581300、MH574897、MH567074等）聚在同一分枝上（图3）。因此，结合上述培养特征、形态特征以及 rDNA ITS序列分析结果，鉴定菌株FE-1为木贼镰刀菌。2.3 菌株 FE-1 的侵染方式通过 SEM 扫描电镜，探究菌株 FE-1 对扶桑111绵粉蚧的侵染方式，结果显示菌株 FE-1 的分生孢子先在扶桑绵粉蚧表皮处萌发形成芽管后水平生长，在适合的接触表皮处形成膨大的附着孢，进一步侵染进入昆虫体腔（图 4）。表明菌株FE-1 对扶桑绵粉蚧具有侵染能力。2.4 菌株 FE-1 的毒力测定2.4.1 菌株 FE-1 回接扶桑绵粉蚧 回接试验结果表明，扶桑绵粉蚧可被菌株 FE-1 侵染。在侵染初期，接种后 1 d，扶桑绵粉蚧的取食行为、虫体外部形态与健康扶桑绵粉蚧无差别。接种后 2 d，扶桑绵粉蚧爬行逐渐缓慢，足部各关节以及背板等处长出少量白色菌丝（图 5A）；接种后 3 d，扶桑绵粉蚧虫体表面出现大量菌丝，开始出现僵虫（图5B）；接种后 4 d，扶桑绵粉蚧被菌丝包裹死亡，虫体干瘪（图 5C），并产生大量分生孢子。以上结果表明菌株 FE-1 对扶桑绵粉蚧具有致死性。2.4.2 菌 株 FE-1 对 扶 桑 绵 粉 蚧 室 内 毒 力 测图 3 基于 rDNA ITS 序列构建的菌株 FE-1 系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain FE-1 constructed based on rDNA-ITS sequencesA：菌丝在扶桑绵粉蚧表皮处水平生长；B：菌株芽管在扶桑绵粉蚧体壁形成附着孢进入体腔A：Horizontal growth of the strain FE-1 on the epidermis of P.solenopsis；B：The expanded appressorium formation of the strain FE-1图 4 菌株 FE-1 在扶桑绵粉蚧表皮上的侵染模式Fig.4 Infection mode of strain FE-1 on the epidermis of P.solenoposisA：接种后 2 d，扶桑绵粉蚧表面出现少量菌丝；B：接种后 3 d，开始出现僵虫；C；接种后 4 d，扶桑绵粉蚧表面产生大量分生孢子A:A small amount mycelium appeared on the surface of the P.solenoposis two days after inoculation;B:The diseased P.solenoposis appeared three days after inoculation;C:The P.solenoposis produced a large numbers of conidia on the surface four days after inoculation.图 5 扶桑绵粉蚧感染菌株 FE-1 后的动态症状Fig.5 Dynamic symptom of P.solenopsis infected with strain FE-1定 不同浓度的菌株 FE-1 孢子悬浮液对扶桑绵粉蚧雌成虫的致病力如图 6 所示。随着浓度的增大，致病力逐渐增强，当孢子浓度为 1108 CFU/mL 时，接种 7 d 后扶桑绵粉蚧雌成虫的校正死亡率为 87.50（1.79）%。从菌株 FE-1 对扶桑绵粉蚧雌成虫的致死中时间 LT50的结果看，随着分生孢子浓度的增加，致死中时间逐渐递减（表 1）；当孢子浓度为 1108 CFU/mL 时，致死中时间 LT50最短、为 3.32 d。从菌株 FE-1 对扶桑绵粉蚧雌成虫的致死中浓度 LC50的结果看，随着接种时间的延长，菌株 FE-1 对扶桑绵粉蚧雌成虫的致死中浓度 LC50递减（表 2）；接种 7 d后的致死中浓度 LC50最低、为 1.8105 CFU/mL。以上结果表明菌株 FE-1 对扶桑绵粉蚧雌成虫具112有一定的室内毒力。3 讨论通常，来自原寄主的病原真菌比来自其他寄主的病原真菌对防治对象具有更高的毒力或更加专一的作用31，这对于挖掘扶桑绵粉蚧高致病力虫生真菌资源起到关键的作用。本研究从扶桑绵粉蚧僵虫中分离得到一株虫生真菌，综合培养形状、形态学和系统发育树分析，确定该真菌为木贼镰刀菌。镰刀菌属真菌多为植物病原、昆虫病原以及人类致病菌。近年来，学者们发现部分镰刀菌属真菌对昆虫具有强致病性，而对寄主植物不致病32；Sharma 等33讨论了昆虫与镰刀菌之间的致病与互惠关系，重点是在野外条件下证明昆虫自然致病的研究；Santos 等 34发现至少有 30 种 273 株镰刀菌为昆虫致病菌。因此，镰刀菌是虫生真菌的重要组成部分35，且寄主非常广泛，包括鞘翅目（Coleoptera）、双翅目（Diptera）、半翅目（Hemiptera）、膜翅目（Hymenoptera）和鳞翅目（Lepidoptera）36。而木贼镰刀菌是一种常见的镰刀菌类，目前国内外针对木贼镰刀菌作为虫生真菌对害虫的致病作用研究已有不少报道，如柳毒蛾（Leuccma cancliae）37、小麦茎叶蜂（Cephus cinctus）38、褐飞虱（Nilaparvata lugens）33、桃蚜（Myzus persicae）39，但未见对扶桑绵粉蚧致病性研究的报道。菌株在环境中的持久性是选择其作为候选菌株制备微生物制剂的重要因素40，而昆虫病原性镰刀菌类作为兼性病原体，在野外可能具有良好的生存潜力；此外，在自然中观察到镰刀菌类具高遗传变异的特点41-42，扩大了菌株使用范围，有利于挖掘更多毒力强的菌株；还有一些镰刀菌种类是菌株复合体，例如赤霉病菌-木贼种复合体（Fusarium incarnatum-equiseti）43、茄腐皮镰孢（F.solani）44、因其在昆虫致病相互作用中表现出高致病力，近年来也受到越来越多的关注。由此可见，镰刀菌因其生防潜力而备受青睐。昆虫表皮是抵御病原真菌侵染的第一道屏障，判断虫生真菌是否对宿主有侵染能力，需要观察其是否能够形成膨大的附着孢穿透寄主体壁25。本研究通过扫描电镜技术，观察菌株FE-1 对扶桑绵粉蚧的侵染方式，发现菌株 FE-1可以在扶桑绵粉蚧特定接触表皮处形成膨大的附着孢，进一步进入昆虫体腔。Leger 等45研究发现虫生真菌是依靠附着孢的膨压所产生的机械压力和所分泌的体壁降解酶的共同作用，进一步穿透扶桑绵粉蚧体壁，这与本研究观察到菌株 FE-1的侵染方式是相一致的。因此，本研究从微观上验证了菌株 FE-1 对扶桑绵粉蚧具有侵染能力。进一步通过室内毒力测定发现，菌株 FE-1对扶桑绵粉蚧雌成虫具有较高的致病力，随着分生孢子浓度的增大，致病力逐渐增强，孢子浓度为 1108 CFU/mL 时，接种后 7 d，扶桑绵粉蚧雌成虫的校正死亡率为 87.50（1.79）%，LC50表 1 菌株 FE-1 对扶桑绵粉蚧雌成虫的 LT50 和回归方程Table 1 LT50 and regression equations of P.solenopsis female adults infected with strain FE-1孢子浓度Spore concentration（CFU/mL）Probit 回归方程Probit regression equation致死中时间 LT50和95%置信区间LT50(d)and 95%confidence interval1108y=-2.17+4.16x3.32（3.013.61）1107y=-2.53+3.90 x4.80（4.445.18）1106y=-3.32+4.52x5.45（5.055.97）1105y=-4.45+5.45x6.55（6.067.31）1104y=-4.29+4.11x11.08（8.68121.26）表 2 菌株 FE-1 对扶桑绵粉蚧雌成虫的 LC50和回归方程Table 2 The LC50 and regression equations of P.solenopsis female adults infected with strain FE-1接种后天数Days after inoculation(d)Probit 回归方程Probit regression equation致死中浓度 LC50和 95%置信区间LC50(106 CFU/mL)and 95%confidence interval2y=-5.93+0.63x2243.35（389.883.27E+11.00）3y=-4.97+0.62x98.73（42.06362.16）4y=-3.46+0.45x26.79（10.9894.47）5y=-2.94+0.45x3.74（1.699.44）6y=-2.33+0.40 x0.73（0.291.78）7y=-3.34+0.64x0.18（0.080.32）图 6 不同浓度菌株 FE-1 孢子悬浮液对扶桑绵粉蚧雌成虫 的校正死亡率Fig.6 Corrected morality of P.solenopsis female adults infected with strain FE-1 under different concentrations of spore suspension113为 1.8105 CFU/mL，与赵雪怡等39利用木贼镰刀菌防治桃蚜（Myzus persicae）的致病力结果相近。表明在室内实验室条件下，菌株 FE-1 对扶桑绵粉蚧雌成虫具有一定的生防潜力，下一步还需对其野外防治效果进行相关研究，以明确其在自然环境下对扶桑绵粉蚧的防治效果。将镰刀菌类用于生物防治中也受到了一些因素的限制，如产生致癌的霉菌毒素、大量释放植物病原到自然环境中46。从某种程度上来说，镰刀菌属的应用仍存在很多争议，认为其存在应用真菌的安全性，对昆虫寄主植物或其他植物存在潜在的风险，并且真菌的特异性在不同属、属内甚至一个种的菌株之间差异很大35。因此，在考虑利用镰刀菌株防治昆虫之前，应对其宿主特异性进行研究，确定其对寄主植物或其他植物的安全性。本研究分离得到的木贼镰刀菌，对扶桑绵粉蚧具有较高的毒力，且对扶桑绵粉蚧的寄主植物扶桑没有致病能力，但对其他寄主植物是否有致病力还需要进一步研究。4 结论本研究从扶桑绵粉蚧僵虫中分离得到菌株FE-1，经纯化及鉴定确定其为木贼镰刀菌。扫描电镜观察发现菌株 FE-1 可在扶桑绵粉蚧体壁产生膨胀的附着孢来进入昆虫体腔，表明该菌株对扶桑绵粉蚧具有侵染能力。回接结果也表明菌株 FE-1 可逐步侵染扶桑绵粉蚧致死。室内毒力测定发现，分生孢子浓度、接种后时间与校正死亡率呈正相关；孢子浓度为 1108 CFU/mL 时，LT50为 3.32 d，在接种后 7 d，扶桑绵粉蚧雌成虫的校正死亡率为 87.50（1.79）%；接种后 7d，LC50为 1.8105 CFU/mL。综上所述，木贼镰刀菌FE-1 对扶桑绵粉蚧雌成虫有较好的致病效果，极具生防潜力。参考文献（References）：1 TINSLEY J D.An ants-nest coccid from New MexicoJ.The Canadian Entomologist,1898,30(2):47-48.DOI:10.4039/Ent3047-2.2 WAQAS M S,SHI Z H,YI T C,RONG X,SHOAIB A A Z,ELABASY A S S,JIN D C.Biology,ecology,and management of cotton mealybug Phenacoccus solenopsis Tinsley(Hemiptera:Pseudococcidae)J.Pest Management 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