分离、筛选絮凝剂产生菌Bacillus sp.CX15及絮凝条件优化研究.pdf

第 卷第期东 北 师 大 学 报(自 然 科 学 版)V o l N o 年月J o u r n a l o fN o r t h e a s tN o r m a lU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c eE d i t i o n)J u n e 文章编号 ()D O I /j c n k i d s l k x b 收稿日期 基金项目吉林省农业科技创新工程项目(C X G C D X ,C X G C T D ,C X G C D X );吉林省科技发展计划项目(N C,S F)作者简介高星爱(),女,博士,副研究员,主要从事环境微生物学研究;通信作者:张淑莹(),女,副研究员,主要从事动物疫病防治研究;李忠和(),男,博士,研究员,主要从事农村废弃物处理与利用研究分离、筛选絮凝剂产生菌B a c i l l u ss p C X 及絮凝条件优化研究高星爱,杨超,闫海洋,于博洋,张頔,李明,吴磊,闫秋良,李忠和,张淑莹(吉林省农业科学院,吉林 长春 ;吉林省农业机械化管理中心,吉林 长春 ;吉林建筑大学市政与环境工程学院,松辽流域水环境教育部重点实验室,吉林 长春 ;吉林省动物疫病预防控制中心,吉林 长春 )摘要为有效提升猪场污水处理效果,从污水处理厂附近土壤中,分离和筛选出对污水具有较好絮凝作用的絮凝菌,并对絮凝菌培养条件进行了优化实验结果表明:絮凝菌最优产絮时间为d,最优培养温度为,菌液接种量为,絮凝菌在 条件下能维持较高的热稳定性紫外、红外光谱结构表征实验证明,絮凝菌主要由酸性多糖组成扫描电镜及革兰氏阳性实验结果显示,絮凝菌呈杆状结合生化特征及分类学鉴定,判定絮凝菌C X 为B a c i l l u ss p C X 关键词絮凝菌;条件优化;生化特征;絮凝率 中图分类号X 文献标志码A随着我国畜牧业的规模化发展,畜禽养殖场排出的污水已成为严重的环境污染问题研究 表明,絮凝方法是去除污水中普遍存在的有机高分子物质和颗粒物的有效手段生物絮凝剂作为絮凝剂中天然、高效、无毒且成本较低的絮凝剂,相较于无机、有机絮凝剂更具优势,广泛用于生态环境污染治理等方面,包括处理黑臭水体、农田灌溉及盐碱地改良废水、农产品深加工及轻工发酵工厂污水、生活污水、工业废水、畜禽养殖粪污和城市公共污物等 生物絮凝剂来源于微生物代谢,是一种能够在污水处理过程中,将难降解固体悬浮颗粒污染物进行絮凝沉淀的高分子代谢产物 但是单一菌种的微生物絮凝剂处理效果存在一定的局限性,在不同生化反应条件下,絮凝率不稳定,而复合型生物絮凝剂既可以将单个菌株的特殊降解功能进行整合和集中,又能够耦合多种菌株进行协同反应,从而整体提高絮凝效率,是目前有效的处理手段 絮凝剂的絮凝效果与菌株培养条件有密切的联系在适宜的条件下,菌株可从外界获取营养物质进行代谢活动,进而获取合成菌体所需要的养分,本文以污水处理厂附近得到的土壤作为目标水体,分离和筛选出具有絮凝效果的絮凝菌,通过分析微生物菌株形态特征、活性物质成分、生化特性、理化指标以及高通量测序对菌株的种属进行了鉴别,并对发酵培养时间、温度、添加量、热稳定性等影响因素进行了最佳培养条件优化实验,以为生物絮凝剂在养殖场污水处理中的应用提供理论基础和科学依据第期高星爱,等:分离、筛选絮凝剂产生菌B a c i l l u ss p C X 及絮凝条件优化研究研究方法 材料从污水处理厂附近的土壤中分离筛选实验所用的絮凝菌 方法 菌株的筛选从污水池不同位置取m L污水样品,加入到 m L液体培养基中配制成 m L混合液,在,r/m i n摇床条件下培养d 用纯水将培养液稀释至 后,取 m L分别涂布于功能培养皿上,经过 h的培养后观察所形成菌落的形态选择表面光滑且带有黏性的单菌落,采用平板划线法对其进行分离 絮凝菌的初筛以高岭土悬浮液模拟养猪场污水先将 g高岭土与 gC a C l于纯水中定容至L,于量筒中加入m L发酵液并加入悬浮液至 m L,反复颠倒混匀后静置,倒出上清液获得菌株发酵液的沉淀颗粒 絮凝菌的复筛在 m L的标准发酵培养基中接入初筛所获得的菌株,在相应的筛选温度 r/m i n摇床震荡培养 h,得到菌液以菌液对猪场污水处理后的絮凝率作为指标,筛选出效果明显且效率高的絮凝菌株 絮凝率的测定将m L的C a C l作为助凝剂加入到 m L的猪场污水中,再加入m L发酵菌液,在常温状态下 r/m i n摇床震荡反应 m i n后,静置 m i n,取上清液,使用分光光度计测量D()计算絮凝率,公式如下:絮凝率(BA)/B ()式中:A为反应后的污水D(),B为原污水的D()絮凝菌形态观察()菌体形态的观察 恒温培养 d后,进行三区划线,用显微镜对单菌落进行观察()镜检观察采用革兰氏染色,显色呈蓝紫色为革兰氏阳性菌(G),显色呈红色为革兰阴性菌(G)絮凝菌絮凝条件优化()生长曲线的测定将发酵完的培养液于 n m波长下测定D()超出浓度范围的数据,用蒸馏水稀释,使D()空白对照为蒸馏水()温度对絮凝率的影响分别设置温度条件为,将配置的混合培养基进行恒温培养,静置 m i n后,检测菌株絮凝活性()发酵菌液接种量对絮凝率的影响分别称取,和m L的发酵菌液添加到 m L猪场污水中,在C a C l为助凝剂的条件下,测定污水絮凝率受絮凝菌添加量的影响情况()絮凝菌的热稳定性分析在 温度条件下,絮凝菌与猪场污水反应 m i n,测定每个热稳定温度下的絮凝效果 絮凝菌理化表征分析()红外光谱分析采用傅里叶红外光谱仪(N i c o l e t )对产絮菌官能团进行测定分析(结果由长春维石检测技术服务有限公司提供)()紫外光谱分析在波长 n m条件下,用水作为空白对照,以光谱带宽 n m、光度模式为A b s、扫描间隔为 H z进行全波长扫描,根据吸收峰判定样品是否含蛋白质和核酸采用J A S C O紫外分光光度计V 进行测定分析(结果由长春维石检测技术服务有限公司提供)()E D X元素分析 E D X元素测定设备为O X F O R DI N S T RUME NT SX MA X(结果由中科院长春应用化学研究所提供)东 北 师 大 学 报(自 然 科 学 版)第 卷 絮凝菌微生物分类学鉴定高通量分析结果由上海欧易生物有限公司提供结果 分离、筛选絮凝菌结果从污水厂附近得到的活性污泥或土壤中,经过几十代的培养筛选,从 多个样品中分离得到相关菌株,经过初筛、富集培养,最后得到具有高酶活性的复合菌剂C X 在L B固体培养基上培养 d之后,可见清晰透明圈菌落菌落呈圆形,菌株表面光滑且带有黏稠、微隆起、半透明的特点(见图 A)利用革兰氏试剂染色后观察菌株形态结果(见图 B),菌株的革兰氏反应呈现阳性,菌株形态表现为杆状图培养基上的产絮菌菌落形态(A)及菌株革兰氏显色反应结果(B)絮凝菌絮凝条件优化()菌株生长与絮凝率变化在 n m条件下,每隔 h取样,测定菌液对污水的絮凝率和菌种生物量随着菌株发酵天数的增加,对菌株生长情况与絮凝率的影响情况见图由图可见,随着培养时间的增长,菌株的生长曲线变化呈抛物线形,培养d后细胞生长迅速,生长量达到最高值,但随着培养时间的继续增长,生物量保持不变,菌体生长进入稳定期;培养 d后,生物量开始逐渐降低发酵液对污水的絮凝率随着菌体细胞的生长表现出缓慢上升的趋势,发酵d时,絮凝活性表现最高,在 d区间段内絮凝率保持稳定趋势,为 左右,但 d后絮凝活性表现出缓慢下降的趋势实验结果说明,该絮凝菌的絮凝产物不是由细胞自身产生的,是细胞发酵过程中产生的代谢产物菌种发酵的整个过程中,降低生产成本最重要的环节是控制好发酵时间,因此,从发酵时间对细胞生物量和絮凝效果的影响结果看,选取刚进入最佳对数期菌龄的菌株时间(d)为发酵的最佳天数图发酵天数对细胞生长曲线与絮凝率的影响()发酵温度对絮凝效果的影响温度影响微生物酶的反应速率和活性,在 梯度条件下,取菌液加入到液体培养基中,在 r/m i n的摇床中培养d,观察絮凝效果,分析不同温度对污水的絮凝率影响,结果见图由图可见,随着温度从 开始不断上升,絮凝率逐渐升高,至 时出现略有降低的趋势由于本实验是在冬季进行的,实验室的平均温度为 左右,若不采取加温措施会影响代谢产物正常发挥效果,因此,考虑低成本培养,以 为产絮菌的最佳培养温度第期高星爱,等:分离、筛选絮凝剂产生菌B a c i l l u ss p C X 及絮凝条件优化研究图温度对絮凝率的影响()絮凝菌投加量对絮凝率的影响在 温度条件下,利用 的絮凝菌进行絮凝菌投加量对絮凝率的影响实验,结果见图由图可见,随着絮凝菌发酵液投加量的增加,絮凝率表现出先升高而后降低的趋势当发酵液的投加量为以下时,絮凝率较低;当投加量达到时候,絮凝效果最高,达到,发酵液中过多的营养加速了微生物的代谢;但当发酵液的投加量超过时,絮凝率表现出下降的趋势在培养基有限的营养物质条件下,增加过多的接种量会影响菌株正常发挥活性,但考虑生产成本减少投加量也会影响絮凝效果,因此,从降低经济成本考虑,最终发酵液的投加量定为()温度对絮凝菌热稳定性的影响在 的不同温度条件下,将絮凝菌与猪场污水反应 m i n,测定温度对絮凝菌热稳定性的影响,结果见图由图可见,条件下,絮凝菌均表现出良好的热稳定性 时,絮凝菌与猪场污水反应 m i n后,絮凝率能维持在 以上;但在 条件下反应 m i n后,絮凝效果下降到,说明絮凝菌在低于 的条件下能维持较高的絮凝活性一般认为絮凝菌的热稳定性能反映出本身的化学组成成分,由蛋白质组成的絮凝菌热稳定差,而由多糖组成的絮凝菌则表现出较高的热稳定性 本实验获得的复合生物絮凝菌具有较好的耐热性,从这一结果初步判断,组成成分不是以蛋白质为主的活性物质图絮凝菌添加量对絮凝率的影响图不同温度下絮凝菌热稳定性 絮凝菌理化表征分析()紫外光谱分析利用紫外光谱进行微生物絮凝菌吸收峰的位置和强度分析,结果见图由图可见,n m之间的扫描图谱表现为连续平滑的曲线,核酸吸收特征峰的 n m处无吸收峰,蛋白吸收特征峰的 n m处也无吸收峰,证明该絮凝物质中不含有核酸、蛋白等物质()红外光谱分析利用红外光谱仪对絮凝菌结构组成进行进一步分析,结果见图由图可见,该絮凝物质在 ,c m处具有多个特征吸收峰,其中,c m处推测为羟基(OH)的伸缩振动吸收峰,c m处推测为CH键伸缩振动吸收峰,c m处推测为乙酰氨基(NHC O CH)的CO键伸缩振动吸收峰,c m处推测为CH弯曲振动吸收峰,c m处推测为酮类CC键伸缩振动吸收峰,c m处推测为CO键的伸缩振动吸收峰 根据实验结果与相关文献,初步判断该絮凝菌主要由OH,NHC O CH等多糖物质构成,羧酸根官能团(C O O)是絮凝菌的主要活性官能团,但是多糖结构和相对分子质量有待进一步的探讨()E D X元素分析通过E D X分析结果(见图)可见,絮凝菌除含有C,N,O等元素外,还包括少量的K和C a元素,这可能是培养基里含有的无机盐所致东 北 师 大 学 报(自 然 科 学 版)第 卷图絮凝菌的紫外光谱扫描结果图絮凝菌的红外光谱扫描情况图E D X元素分析结果E D X元素分析结果(见表)显示,C,N,O,K和C a种元素质量分数分别为 ,从此可以看出,絮凝菌C,N和O元素含量较高,同时也证实了该絮凝菌红外光谱分析结果中OH和NHC O C H所占比例较高的结论每种元素的E D X分层情况见图 表E D X元素分析结果元素线类型x/w/CK线系 NK线系 OK线系 KK线系 C aK线系 总量 图E D X分层图像()扫描电镜结果分析以标尺为m,在放大 倍的条件下,絮凝菌菌株的扫描电镜结果见图 由图 可以看出,该絮凝菌菌株成团状结构且菌株间空隙较大,呈多孔状,有利于吸附大分子物质 产絮菌微生物分类学鉴定对获得的菌剂进行分类学鉴定,通过 S高通量测序,对门、纲、目、科、属、种个分类的群落聚类及相关分析(O TU)进行对比,得到个门、个纲、个目、个科、个属此外,进一步通过基于K r o n a的分类学组成交互图分析可以得出:菌剂在属水平上以杆菌为主,丰度高达(见图)第期高星爱,等:分离、筛选絮凝剂产生菌B a c i l l u ss p C X 及絮凝条件优化研究图 絮凝菌扫描电子显微镜图像图 基于K r o n a的分类学组成交互图交互分析结果中,门、纲、目、科、属种分类水平从内到外依次排列,其中表面积越大表示其相对丰度越大,所占比例越高由图 可以看出,门水平上,拟杆菌门(F i r m i c u t e s)丰度高达 ,为优势菌门;变形菌门(P r o t e o b a c t e r i a)为 ,其余为 (包括未知门类(B a c t e r i a)各个分类水平中,不同的颜色代表不同的分类单元细菌群落组成中,芽孢杆菌(B a c i l l u ss p)所占比例为,因此,结合生化特征等分析结果,絮凝菌C X 鉴定为B a c i l l u ss p C X 结论()以污水处理厂附近土壤作为实验样品,经过初筛、复筛等实验过程,获得生物絮凝菌絮凝菌在固体培养基上的菌落表现为圆形,菌株表面光滑且带有黏性,黏稠、微隆起、半透明;扫描电镜观察菌株形状为杆状;革兰氏染色呈阳性()通过对絮凝菌培养条件进行的优化实验得出,最佳培养时间为d、温度为、发酵菌液接种量为絮凝菌热稳定性实验结果表明,条件下反应 m i n,未出现明显的失活现象,证明其具有较高的耐热性;温度达到 时,絮凝率开始出现下降趋势()微生物絮凝菌理化表征分析:紫外光谱结果表明,絮凝菌中不含有核酸类、蛋白类物质;红外光谱分析发现,该絮凝菌主要构成物质为OH,NHC O CH等多糖,是由酸性多糖组成,活性官能团主要以羧酸根官能团(C O O)的形式存在;通过E PMA与E D X元素分析,絮凝菌中C,N和O元素含量较高,证实了该絮凝菌红外光谱分析结果中OH,NHC O CH所占比例高的结论()产絮菌微生物分类学鉴定结果:通过基于K r o n a的分类学组成交互图分析可以得出,该菌剂在属水平上以杆菌为主,丰度高达,絮凝菌C X 命名为B a c i l l u ss p C X 本文经过初筛、复筛实验获得的生物絮凝菌作为高效絮凝产生菌,在猪场污水的处理过程中具有有效的絮凝作用,能够对畜牧业废水处理及畜种养殖环境改善达到良好效果东 北 师 大 学 报(自 然 科 学 版)第 卷 参考文献 KUMA R L R,Z HAN G X L,KAUR R,e ta l T e c h n o e c o n o m i ca n a l y s i sf o re x t r a c e l l u l a r p o l y m e r i cs u b s t a n c e s(E P S)p r o d u c t i o nu s i n ga c t i v a t e ds l u d g ef o r t i f i e dw i t hc r u d eg l y c e r o la ss u b s t r a t ea n di t sa p p l i c a t i o ni nl e a c h a t et r e a t m e n tJB i o r e s o u r c eT e c h n o l o g y,:刘叶,吕张义,戈林燕生物絮凝剂处理生活污水的应用研究J化工管理,():蒋宝军,王飞虎,李忠和,等微生物絮凝剂的特征及研究现状J东北农业科学,():朱超英,马荣骏,何静微生物絮凝剂及其研究与应用综述J矿冶工程,():覃孔昌,颜成,王电站,等生物聚沉氧化法快速处理奶牛场粪污废水的研究J南京农业大学学报,():李刚,杨克,许方程,等微生物菌剂处理规模化养猪场粪污水的研究进展J浙江农业科学,():WAN GT,T ANGX,Z HAN GSX,e t a l R o l e so f f u n c t i o n a lm i c r o b i a l f l o c c u l a n t i nd y e i n gw a s t e w a t e r t r e a t m e n t:b r i d g i n ga n da d s o r p t i o nJ J o u r n a l o fH a z a r d o u sM a t e r i a l s,:李娜,范祎立,李雪,等 株微生物絮凝剂产生菌的分离、鉴定与絮凝剂的成分分析J江苏农业科学,():马放,冯玉杰,任南琪环境生物技术M北京:化学工业出版社,:立欣,刘婉萌,马放复合型微生物絮凝剂研究进展J化工学报,():张玉玲,张兰英,姚军,等高效复合型微生物絮凝剂研究J哈尔滨工业大学学报,():赵东风,刘洁,张云波,等复合型微生物絮凝剂的絮凝条件优化J工业水处理,():孙嘉龙,李忠微生物絮凝剂产生菌的选育及条件优化J贵州农业科学,():王玫,刘艳一株高效微生物絮凝剂产生菌的筛选与絮凝条件优化J环境工程,(S):王融,刘云鹏,霍远涛,等高效微生物絮凝剂产生菌X N J 的筛选与絮凝条件优化J南京农业大学学报,():张鲁新,鲁陈,李吕木,等产絮凝剂菌种的筛选及其在猪场污水净化中的应用J农业工程学报,():张云波,李政,刘其友,等微生物絮凝剂产生菌K J 的絮凝性能及絮凝成分分析J环境工程学报,():张东晨,刘志勇,王涛,等微生物絮凝煤泥水试验及其红外光谱研究J选煤技术,():林炜铁,昝继清微生物絮凝剂MB F 的絮凝特性J化工进展,():潘多涛,刘桂萍,刘长风生物絮凝剂产生菌的筛选及培养条件优化J山东大学学报(工学版),():张东晨,刘志勇,王涛,等煤炭絮凝微生物黄孢原毛平革菌光谱及电镜研究J煤炭学报,():I s o l a t i o na n ds c r e e n i n go fb a c t e r i ap r o d u c i n ge f f i c i e n t f l o c c u l a n tB a c i l l u ss p C X a n do p t i m i z a t i o no f c o n d i t i o n sGAOX i n g a i,YANGC h a o,YAN H a i y a n g,YUB o y a n g,Z HANGD i,L IM i n g,WUL e i,YANQ i u l i a n g,L IZ h o n g h e,Z h a n gS h u y i n g(J i l i nA c a d e m yo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s,C h a n g c h u n ,C h i n a;J i l i nP r o v i n c eA g r i c u l t u r a lM e c h a n i z a t i o nM a n a g e m e n tC e n t e r,C h a n g c h u n ,C h i n a;C i v i l a n dE n v i r o n m e n t a lE n g i n e e r i n gC o l l e g e,K e yL a b o r a t o r yo fS o n g l i a oA q u a t i cE n v i r o n m e n t,M i n i s t r yo fE d u c a t i o n,J i l i nJ i a n z h uU n i v e r s i t y,C h a n g c h u n ,C h i n a;J i l i nP r o v i n c i a lC e n t e r f o rA n i m a lD i s e a s eC o n t r o l a n dP r e v e n t i o n,C h a n g c h u n ,C h i n a)A b s t r a c t:I n o r d e r t o e f f e c t i v e l y d e g r a d e p i g f a r m w a s t e w a t e r,a f t e ri s o l a t i o n,s c r e e n i n g a n di d e n t i f i c a t i o nac o m p o u n dm i c r o b i a l f l o c c u l a n t(B a c i l l u ss p C X )b a c t e r i a f r o mt h ew a s t e w a t e rp l a n ts o i l T h e r e s u l t s o f o p t i m i z e d c u l t u r ef a c t o r s o ff l o c c u l e n t b a c t e r i a s h o w e d t h a tt h e o p t i m a lf e r m e n t 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a c t e r i s t i c s;f l o c c u l a t i o nr a t e(责任编辑:方林)