实验六 胰蛋白酶的结晶及活力测定.doc

实验一 胰蛋白酶的结晶及活力测定
原理
胰蛋白酶（trypsin，EC.3.4.21.4）通常是以无活性的胰蛋白酶原（trypsinogen）形式存在于动物的胰脏中。在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌到十二指肠后，在小肠上腔有钙离子的环境中被肠激酶（enterokinase）或胰蛋白酶所激活，其肽链N端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解而失去一个酸性6肽，分子构象发生改变，转变成有生物活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的Mr约为24000，其等电点为pH8.9。胰蛋白酶的的Mr为23400，等电点为pH10.8。胰蛋白酶在酸性条件下稳定。通常在pH3.0的溶液内，在4的冰箱内储存数约乃至2年其活性无显著变化。当溶液的pH值小于2.5时，胰蛋白酶易变性；pH大于5.0时，容易发生自溶；在pH7.6~8.0时，其催化水解的活性最佳。
重金属离子，有机磷化合物和某些反应产物均可抑制胰蛋白酶的活性。在胰脏、卵清和大豆中含有一些对胰蛋白酶活性具有抑制作用的天然抑制剂。
胰蛋白酶催化水解蛋白质的能力，表现在它对碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸所形成的肽键具有高度的专一性。此外，还能催化水解有碱性氨基酸所形成的酰胺键和酯键，胰蛋白酶对这些化学键催化水解活性的敏感性依次是酯键＞酰胺键＞肽键。因此，可以利用含有这些化学键的人工合成的化合物为底物来研究胰蛋白酶的专一性催化活性。
在动物的胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶的性质相似的蛋白水解酶，即：胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）亦称糜蛋白酶，弹性蛋白酶(elastase)。在制备过程，采用常规的方法往往很难将三者彼此分离开。而采用具有高度专一性的亲合层析法可将它们分开。
从胰脏中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH调至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋白沉淀析出。经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原，胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原沉淀，抽滤后的沉淀物经水溶解并调至pH8.0，用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活，同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原、弹性蛋白酶原也被激活。三种酶原激活相互作用过程如下：

流程图

激活后的酶溶液，用硫酸铵分级盐析法初步将胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶分开，收集胰蛋白酶部分，通过结晶进一步纯化，使胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶通过离子交换层析可进一步分离。
胰蛋白酶能水解酯键、酰胺键和肽键，根据这一性质，用人工合成的底物或天然的蛋白质（如酪蛋白）测定胰蛋白酶的活性。目前，用于检测胰蛋白酶活性人工合成的底物主要是酰胺和酯两类。常用苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺（enzoyl-arginine p-nitro-anilide,简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酰-β-精氨酸乙酯(enzoyl-arginine naphthylamide ,简称BANA)为底物测定酰胺酶的活力；用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（enzoyl-arginine ethyl ester, 简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（tosyl-L-arginine methyl ester ，简称TAME）为底物测定酯酶的活力。以BAEE为例，酶水解的反应如下：
反应方程式

以人工合成的底物测定胰蛋白酶活力时，通常采用紫外吸收法，酶活力单位的规定因底物及测定方法而异。

操作方法
一 结晶胰蛋白酶的制备
（一） 胰蛋白酶原的提取
1. 称取1kg（净重）新鲜的或速冻的动物胰脏，剥去脂肪及接替组织。剪成小块，捣碎。
2. 加入2~2.5倍体积预冷的pH2.5~3.0乙酸酸化水，在5~10℃下提取6小时以上，并不时的的轻轻搅拌。
3. 用4层纱布挤滤，拧挤出滤液；组织残渣再加入约1/2体积（500ml左右）的乙酸酸化水，提取1~2小时。再次用纱布过滤。合并两次滤液，用2.5mol/L的硫酸调至pH2.5~3.0，静置约4小时，使提取液中的酸性蛋白承佃析出。
4. 用折叠滤纸过滤，收集全部的滤液，加入粉状固体的硫酸铵至0.75饱和度（按每1000ml滤液加492g，5℃）。放置过夜，使胰蛋白酶原完全析出。
5. 用布氏漏斗抽滤，压紧成滤饼。即可获得胰蛋白酶原粗品。
（二） 胰蛋白酶原的激活
1. 将硫酸铵沉淀的胰蛋白酶原称重（湿重），加入约10倍体积的预冷蒸馏水（按滤饼重量计算），使滤饼完全溶解，一般情况滤饼中硫酸铵含量约站1/4。
2. 用5mol/L氢氧化钠将溶液调至pH8.0，慢慢加入固体无水氯化钙使钙离子的终浓度达到0.1mol/L（要减去一部分氯化钙和硫酸铵结合生成硫酸钙沉淀的钙离子）。随加随搅拌均匀。
3. 取出0.1ml溶液，稀释200倍测定激活前的蛋白含量及酶活性（一般情况下是无活性或活性极低）。
4. 加入2~5mg该种动物的胰蛋白酶为激活启动酶，轻轻搅匀，于4℃激活12~16小时或25℃激活3~4小时。在激活期间每隔一段时间测定一次酶活性，观察酶原激活增长情况，直到酶激活速度有快变慢或停止增长，表明酶原已经全部被激活。一般比活可达到3500~4500 BAEE单位/mg酶蛋白。
5. 酶原激活后，用2.5mol/L的硫酸调至pH2.5~3.0，用滤纸过滤除区硫酸钙沉淀。置冰箱内保存备用。
（三） 胰蛋白酶的分级分离
1. 将以激活的胰蛋白酶溶液，慢慢加入固体硫酸铵至0.4饱和度（每1000ml 溶液加入240g硫酸铵）。使胰凝乳蛋白酶沉淀出来。
2. 用布氏漏斗抽滤，收集滤液，（滤饼留做制备胰凝乳蛋白酶），再加入固体硫酸铵至0.75饱和度（每1000ml 溶液加入250g硫酸铵），使胰蛋白酶析出。
3. 在4℃放置约4小时，待胰蛋白酶完全沉淀析出后，用布氏漏斗抽滤，收集滤饼，即可获得胰蛋白酶的粗制品。
二 胰蛋白酶的活力测定
1. N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）为底物测定法
N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯在波长253nm下的紫外吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸(benzoyl-L-arginine,简称BA)的紫外光吸收。在胰蛋白酶催化水解下，BAEE随着酯键的被水解，水解产物BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253计算胰蛋白酶的比活力。
取两个石英比色杯（带盖，光程为1cm），分别加入25℃预热过的2.8ml1.0mmol/L的BAEE底物溶液。向一个比色池内加入0.2ml 10mmol/L的盐酸，在波长253nm下调整仪器零点；向另一个比色池内假如0.2ml胰蛋白酶溶液（酶的用量一般为5~10μg 纯胰蛋白酶，若是粗制品应增加用量），立即盖上盖迅速颠倒几次混匀并计时，于253nm处测定其光吸收增加值（A253nm），每隔30秒读数一次，反应持续5~7分钟。测得结果要使△253nm/min控制在0.05~0.1之间为宜。若偏离此范围则要适当增减酶量。
以时间（t）为横坐标，光吸收值（A253nm）为纵坐标做直线，在直线部分任选一个时间间隔（t）与相应的光吸收值变化（△A253nm）。按下列公式计算胰蛋白酶的活力单位和比活力。
酶的活力单位（BAEE单位）=（△A253nm/min）/0.001
酶的比活力单位（BAEE单位/mg酶）=（△A253nm/min）×1000/（ε×0.001）
式中的△A253nm/min为每一分钟递增光吸收值；ε为测定时所用的胰蛋白酶量（μg）；1000为酶蛋白的μg转换成mg的转换值；0.001为光吸收值每增加0.001定义为1个BAEE活力单位的常数。
2. 对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME）为底物测定法
取2个石英比色杯（带盖，光程为1cm），分别加入经25℃预热过的2.8ml1.0mol/L TAMA 底物溶液。向一个比色杯中加入0.2ml 10mmol/L的盐酸溶液作为空白对照，在波长247nm下调整仪器的零点，然后向另一个比色池加入0.2ml胰蛋白酶溶液（酶用量5~10μg），盖上盖，迅速颠倒几次混匀并计时，于波长247nm处测定其光吸收。每隔30秒读数一次，反应持续5~7分钟。△247nm/min控制在0.05~0.1为宜。若偏离此范围要适当增减酶量。
以时间（t）为横坐标，光吸收值（A247nm）为纵坐标做直线，在直线部分任选一个时间间隔（t）与相应的光吸收值变化（△A247nm）。按下列公式计算胰蛋白酶的活力单位和比活力。
酶的活力单位（TAME单位）=（△A247nm/min）/0.001
酶的比活力单位（TAME单位/mg酶）=（△A247nm/min）×1000/（ε×0.001）
式中的△A253nm/min为每一分钟递增光吸收值；ε为测定时所用的胰蛋白酶量（μg）;1000为酶蛋白的μg转换成mg的转换值；0.001为光吸收值每增加0.001定义为1个TAME活力单位的常数。
3.甲酰-L-精氨酰-β-萘酰胺（BANA）为底物测定法
取3只试管，其中两支为平行测定酶活力实验，均加入0.1ml0.25%BANA 乙醇溶液，0.4ml0.2mol/L，pH8.0磷酸盐缓冲液，在加入1ml已稀释好的酶溶液，混匀后于37℃保温15分钟，然后立即加入0.5ml 2mol/L的盐酸溶液，以停止酶促反应，摇匀。另一支试管加入试剂与前2支相同，只是先加入0.5ml 2mol/L的盐酸溶液，后加酶液。加酶后亦同样保温15分钟，作为空白对照。然后在3支试管中都加入1ml 0.1%的亚硝酸钠溶液，充分振荡3分钟后，加入1.5ml 0.5%氨基磺酸铵溶液，再振荡2分钟，最后加入2ml 0.05%的N-萘基-乙二胺二盐酸乙醇溶液，摇匀。溶液逐渐呈兰色，在25℃保温30分钟后，产物的颜色即达稳定。于560nm处测其光吸收。以不同样品量为横坐标，所得相应的△560nm为纵坐标做图，选择曲线的直线部分，按以下计算公式计算胰蛋白酶的活力单位和比活。
酶的活力单位（BANA单位）=（△A5603nm）/（0.01×t）
酶的比活力单位（BANA单位/mg酶）=（△A560nm）×1000/（ε×t×0.01）
式中的△A560nm为样品管光吸收值－空白管光吸收值；ε为每个样品管所用的胰蛋白酶量（μg）；1000为酶蛋白的μg转换成mg的转换值；0.01为光吸收值每增加0.01定义为1个BANA活力单位的常数；t为保温时间（min）。
在上述条件下，每分钟光吸收值增加0.01时，所需酶量定为一个BANA单位。
4.酪蛋白为底物测定法
以酪蛋白为底物，主要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。按修改后的Kunitz法进行测定，方法如下：
样品管：将酶液用0.1mol/L，pH8.0的硼酸缓冲液稀释到适当的浓度（粗胰蛋白酶粉约8~80μg/ml，结晶胰蛋白酶粉约2~20μg/ml），取不同量的酶液（0.1~1.0ml），并用0.1mol/L，pH8.0的硼酸缓冲液补足体积到1.0ml。然后在每个样品管中在加入1ml预先在37℃保温好的1%酪蛋白溶液，混匀，在37℃保温10分钟，立即个加入3.0ml 5%的三氯乙酸，迅速摇匀，于室温放置半小时。
空白管：在每支试管中个加入1.0ml1%酪蛋白溶液和3.0ml5%三氯乙酸，摇匀后，再加入1.0ml酶液（酶浓度分别与样品管相同），在37℃保温10分钟，以下操作同样品管。
将样品管、空白管分别离心，取上清液于280nm策其光吸收值。以不同样品量作为横坐标，所得相应的△280nm为纵坐标作图，选择曲线的直线部分按下列公式计算胰蛋白酶的活力单位和比活力。
酶的活力单位=△280nm/t
酶比活力（活力单位/mg酶）=（△280nm×1000）/（ε×t）
式中：△280nm为样品管光吸收值（A2）－空白管光吸收值（A1）；ε为每个样品管中胰蛋白酶的用量μg；t为保温时间（min）；1000为样品由μg换算成mg时的转换值。
三 胰凝乳蛋白酶的活力测定
以N-乙酰-L-酪氨酸乙酯（N-acetyl-tyrosine ethyl ester简称ATEE）为底物，用紫外吸收法测定。方法如下：
取2个石英比色杯（带盖，光程为1cm），其中一个加蒸馏水，用于调零。另一个比色杯加入2.8ml ATEE—0.05mol/L，pH7.0的磷酸缓冲液，0.20ml酶液（用量一般为10μg蛋白的结晶酶），立即混匀并计时，于237nm处测其光吸收值（降低），每隔半分钟读一次数，共3~5分钟。若△237nm/min＞0.400，则酶液需要适当稀释或减量。
根据时间—光吸收关系曲线中的直线部分，任选一时间间隔与相应的光吸收值变化（△237nm），按以下计算公式计算胰凝乳蛋白酶的活力单位和比活力。
酶的活力单位（ATEE单位）=△237nm/t ×0.001
比活力=酶活力单位数/mg蛋白质 =（△237nm×1000）/（ε×t×0.001）
式中：△237nm为任选一个时间间隔（min）光吸收值的变化（降低）；ε为测定时所用的酶量（μg）；1000为酶蛋白由μg转换成mg时的转换值；0.001为每分钟光密度值降低0.001定为1个ATEE活力单位的常数。
五 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的蛋白含量测定
根据蛋白质溶液在波长280nm处具紫外光吸收的特性，将测得的光吸收值A280nm除以该蛋白质的消光系数或乘以该蛋白质的比消光系数，即可计算出该蛋白质溶液的浓度。胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶及弹性蛋白酶的消光系数和比消光系数分别列在下表中。
胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶及弹性蛋白酶的消光系数和比消光系数

蛋白质名称
消光系数
比消光系数
猪胰蛋白酶
1.35
0.740
牛胰蛋白酶
1.71
0.585
牛胰凝乳蛋白酶
2.00
0.500
计算出的蛋白质的浓度为mg/ml
蛋白酶（mg/ml）=（A280nm×N）/消光系数 或 A280nm×比消光系数×N
式中：N为测定时酶溶液的稀释倍数。

结果处理
1. 乘量所得到的胰蛋白酶结晶的重量
2. 计算结晶酶的比活力。以单位数/mg蛋白来表示
3. 将实验数据列表如下：
步骤
总体积
（ml）
总蛋白质
（mg）
比活力
（单位数/mg蛋白质）
总活力
总单位数
回收率
（%）
激活后

第一次结晶

第二次结晶

试剂和器材
试剂
1.pH2.5乙酸酸化水 2.10%乙酸
3.2.5mol/L硫酸 4.硫酸铵
5.氯化钙（AR） 6.5mol/L氢氧化钠溶液
7. 2mol/L氢氧化钠溶液
8. 0.8mol/L，pH9.0硼酸溶液：取20ml0.8mol/L硼酸溶液，加30ml0.05mol/L四硼酸钠
溶液，混合后，检查溶液的pH值。
9. 0.8mol/L，pH9.0硼酸溶液
10.0.2mol/L，ph8.0硼酸缓冲液：取70ml0.2mol/L硼酸溶液，加30ml0.05mol/L四硼酸
钠溶液，混合后，检查溶液的pH值。
11.2mol/L盐酸
12.ATEE—0.05mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液（每ml磷酸盐缓冲液中含0.25mg ATEE）
13.0.1mol/L pH8.0硼酸缓冲液
14.5%三氯乙酸溶液
15.1%酪蛋白溶液
16.0.25%BANA—乙醇溶液：贮于冰箱可使用2周
17.0.1%亚硝酸钠溶液
18.0.5%氨基磺酸铵溶液
19.0.05%N-1-萘基-乙二胺盐酸乙醇溶液：贮于冰箱可使用4周
20.0.2mol/L，pH8.0磷酸盐缓冲液：取5.3ml 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液，加入94.7ml
0. 2mol/LL磷酸氢二钠溶液，混匀后，检查溶液的pH值
21.TAME—0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液：取29mg TAME，222mg氯化钙，溶于100ml
0. 05mol/L，pH8.0 Tris-HCl缓冲液中
22.0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液
23.BAEE底物溶液的配制：每ml 0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液含有0.34mgBAEE和
2.2mg氯化钙。如配制50ml0.05mol/L，pH8.0Tris-HCl缓冲液，加110mg氯化钙，
17mgBAEE（相当于1mmol/L BAEE）
器材
1. 新鲜动物胰脏
2. 剪刀、镊子
3. 搪瓷盘
4. 绞肉机
5. 标本缸（约17cmX25cm）
6. 乳钵
7. 大玻璃漏斗（直径17cm~12cm）
8. 塑料小桶
9. 离心机
10. 布氏漏斗（直径分别为15 cm，7cm，1.5cm）
11. 抽滤瓶
12. 恒温水浴
13. 分光光度计
14. 纱布
15. pH试纸

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