细胞融合与细胞杂交.pdf

细胞融合与细胞杂交江维江维2011.05.23杂交：通过不同的基因型的个体之间的交配而取得某些双亲基因重新组合的个体。杂交优势：两个遗传基础不同的植物或动物进行杂交，其杂交后代所表现出的各种性状均优于杂交双亲，比如抗逆性强、早熟高产、品质优良等。杂交育种杂交育种中，根据亲缘关系的远近，又可分为种间杂交和远缘杂交。一般杂交育种是指品种间杂交育种。远缘杂交：不同种属之间，或是地理上远缘的种内亚种之间个体的交配。种属间存在着隔离机制，致使远缘杂交常表现不亲和或获得的远缘杂种表现不育。不亲和性：在有性生殖过程中，由于生物个体的细胞或组织水平上的不协调而使受精或接合不能正常进行，或是受精后不能产生后代的现象。一般表现为生殖细胞不能融合，或受精卵不能发育，或子代无繁殖能力等。不亲和性是稳定物种的重要机理之一。不亲和性杂交斑马：由斑马和马科动物杂交产物。狮虎：狮子和老虎的杂交产物。豹狮：美洲豹与狮子的杂交产物。细胞融合的概念和意义细胞融合的概念和意义?细胞融合(cell fusion)也叫细胞杂交(cell hybridization)，或者体细胞杂交(somatic hybridization)是指在离体条件下，使用人工方法使两个或两个以上的单个细胞通过无性生殖的方式合并形成一个细胞的技术。对于植物也叫“原生质体融合”。不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此在创造新细胞、培育新品种方面意义重大。植物：体细胞杂交培育新品种 动物：单克隆抗体生产，抗肿瘤疫苗等pomato绵山羊生物种类生物种类细胞来源细胞来源成功年代成功年代烟草两个种间苷蓝青菜大豆马唐草矮牵牛龙面花大麦花生大麦大豆小麦矮牵牛油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麦蚕豆大豆草香木犀酵母菌鸡大豆烟草大豆秋水仙人胡萝卜番茄马铃薯人小鼠叶叶叶根愈伤组织叶叶花瓣种子种子叶悬浮细胞叶花瓣叶悬浮细胞叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶根悬浮细胞叶原生质体血红细胞悬浮细胞叶悬浮细胞叶腹水癌细胞原生质体叶根尖纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972几种细胞融合成功的例子几种细胞融合成功的例子细胞融合的研究进展细胞融合的研究进展自发细胞融合(spontaneous fusion)?自发融合现象最初在动物细胞中发现。?发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞情况。?自然界的细胞融合现象：受精过程胚胎着床肌管形成破骨细胞多核巨细胞多核巨细胞 肌管是长而大的多核肌肉细胞。最初认为多核的肌管是有丝分裂中核分裂而质不分裂的结果，但发现肌管在体外并不发生有丝分裂，而是由单核的成肌细胞自发融合而成。小鼠成肌细胞的自发融合肌管形成肌管形成破骨细胞的形成 破骨细胞(osteoclastcell)是由排列在骨骼表面的成骨干细胞自发融合而成的多核细胞，其作用是吸收骨骼。破骨细胞含有十几至几十个细胞核。人工诱导细胞融合?1958年日本学者冈田(Okada)发现仙台病毒(Sendai Virus)在体外成功地融合了小鼠艾氏腹水癌细胞。?1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇(PEG)化学融合法。?1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。?20世纪80年代，齐默曼（Zimmerman）等建立了电融合技术。细胞融合的分类细胞融合的分类?从亲本来源上同核体(Homokaryon)基因型相同的细胞融合异核体(Heterokaryon)来自不同基因型的融合细胞?从融合效果上对称融合(Symmetric fusion)两个完整的细胞间的融合不对称融合(Asymmetric fusion)利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再与另外一个完整的细胞进行融合。a+b细胞融合的关键技术细胞融合的关键技术?融合材料的获得植物原生质体的制备动物单个细胞的获得?细胞融合的常用方法生物法、化学法、物理法原生质体（原生质体（Protoplast）?含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。质膜质膜细胞壁细胞壁无细胞壁，可以方便地进行遗传操作、人工诱变、细胞器转移、细胞融合等操作。植物细胞的细胞壁主要成分是纤维素(纤维素微纤丝Cellulose microfibrils)、果胶(pectin)、多糖(glycan)。果胶酶、纤维素酶等处理植物组织，可以破坏胞间层和去掉细胞的纤维素外壁，得到游离的裸露原生质体。细胞壁制备与纯化原生质体制备与纯化原生质体?酶解法（Enzymatic isolation）1960年，英国科金第一次采用酶方法从番茄幼苗大量制备出原生质体。1）取材消毒2）酶解：纤维素酶、果胶酶等3）分离纯化：离心收集-密度梯度离心果胶酶纤维素酶过滤离心果胶酶纤维素酶过滤离心图示原生质体分离过程（以叶片为例）形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。原生质体活力鉴定原生质体活力鉴定普通光原色细胞原色、核深红色原色原色原色原色荧光绿色细胞浅红、核橘红色无荧光无荧光无荧光 无荧光FDA 罗丹明B 伊文斯蓝刚果红曙红番红不同染料对有活力的原生质体的染色结果低渗爆破法染色识别?番红或Evans蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染色。?双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体原生质体靠近形成细胞桥胞质渗透细胞核融合细胞融合的主要步骤显微镜下的细胞融合过程细胞融合的方法细胞融合的方法?细胞融合的基础是细胞膜的流动性。生物膜的流动镶嵌模型(fluid mosaic model)细胞膜磷脂分子扰动出现通道细胞桥融合过程中两个细胞膜的变化过程?类脂质分子发生扰动和重排?导致细胞桥的形成?细胞质、核相互融合细胞融合的基础是细胞膜的流动性。若是没发生细胞核的融合，仅发生了细胞质的融合，则可能成为嵌合细胞。含有多个核的异核细胞合并后形成的单核细胞称为合核细胞。细胞核的合并发生在有丝分裂过程中。但是这种有丝分裂只有当两个核的DNA合成基本同步时才能发生：两个核同时进行有丝分裂，形成一个纺锤体，全部染色体都排列在一个赤道板上，结果伴随着细胞分裂就形成了单核的子细胞，其细胞核中含有双亲细胞的染色体。关键：细胞核的融合细胞融合的方法细胞融合的方法?生物法、化学法及物理法。?原理：增加细胞间的粘附、改变膜的通透性。生物法生物法?各种病毒(例灭活的仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒)都有凝集细胞的能力，一边粘接在一个细胞表面，另外一边粘接在另一个细胞表面，使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。?仙台病毒(HVJ，Hemagglutinating virus of Japan)是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因HVJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。?特点：研究最早的促融剂，应用HVJ技术有很多缺陷，细胞感染率低融合速度慢融合体的去病毒困难灭活后的病毒颗粒结合到原生质体表面，细胞开始凝聚;细胞膜紧密结合，病毒被膜与细胞浆膜融合。病毒颗粒周围的膜脱离整个膜产生破口，在两细胞间形成细胞质通道(371-2 min)，通道继续扩大，病毒颗粒流入细胞质内，细胞质互相融合;融合细胞变圆，融合过程结束。原理与过程可以采用的化学诱导剂包括：NaNO3、高pH的高浓度 Ca2+离子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明胶、植物凝血素伴刀豆球蛋白A等。细胞膜电荷平衡被打破。化学法化学法PEG诱导细胞融合PEG诱导细胞融合?PEG(Polyethylene glycol,聚乙二醇)是一种多聚化合物，分子式为H(OHCH2-CH2)nOH)。?PEG诱导：PEG与溶液中自由水结合，高度脱水后引起原生质体凝聚、扭曲变形、细胞膜连接处发生融合，形成很小的细胞桥，之后扩大，最终彻底融合。?高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导，进一步提高了PEG法的效率。高Ca2+：带负电荷间的原生质体在钙离子的连接下形成静电键钙桥，促使异源的原生质体间粘着和结合。高pH：增加Ca2+在细胞表面的黏附，从而促进两原生质体的接触。优点：成本低异核率较高不受物种限制缺点：过程繁杂对细胞有毒害PEG诱导鸡血细胞体外融合物理法物理法电融合诱导法电融合诱导法原理：在高频交变电场作用下，原生质发生极化作用形成偶极子，受电场力的作用进而沿电力线方向运动彼此粘连成串；对成串细胞施加瞬时高压脉冲，原生质膜在高电压作用下发生瞬时可逆性的电穿孔，进而发生原生质体的融合。排队穿孔融合融合燕麦原生质体的融合电融合仪螺旋融合杯微融合杯特点特点?融合效率高、重复性、可控制性强、毒害小。?可能会造成不可恢复的细胞损伤。细胞融合方法选择根据不同对象选择不同的细胞融合方法和条件：?动物细胞融合：仙台病毒诱导、PEG法、电融合法；?植物细胞融合：常用PEG法和电融合法；?微生物细胞融合：多采用PEG法。融合细胞的筛选融合细胞的筛选?细胞融合是一个随机的物理过程，融合后细胞将以多种形式出现。?A与B融合过程中：?A-B异核体，A-A/B-B 同核体。?A-A-A，B-B-B等多聚体。?未融合的A，B。筛选的必要性?物理特性筛选形态/大小/颜色等性质常用的融合细胞筛选方法常用的融合细胞筛选方法拟南芥杂交亲本亲本薄荷?荧光标记法常用的融合细胞筛选方法常用的融合细胞筛选方法?选择性培养筛选法?抗药性筛选系统：利用细胞对药物敏感性差异筛选融合细胞。ABABAmp-Kana+Amp+Kana-Amp+Kana+细胞融合 常用的融合细胞筛选方法常用的融合细胞筛选方法?选择性培养筛选法?营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时不能生长繁殖，属于营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选融合细胞。ABABThr-Trp+Thr+Trp-Thr-Trp-细胞融合 常用的融合细胞筛选方法常用的融合细胞筛选方法?选择性培养筛选法?温度敏感突变型融合细胞筛选：一般细胞在30-40范围内生长，温度敏感突变型细胞能在高温和低温下生长，由此可筛选融合细胞。ABAB细胞融合 Kana+37Kana-37Kana+37融合细胞培养?经过组织培养再生植物?作为生物医药生产的细胞比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合（单克隆抗体制备）原理细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞膜的流动性、细胞增殖融合前处理酶解法除细胞壁(纤维素酶和果胶酶)注射特定抗原免疫处理正常小鼠促融方法物理法：离心、振动、电刺激等化学法：聚乙二醇（PEG）物理法、化学法与植物原生质体融合促融方法相同生物法：灭活的病毒过程第一步：用酶解法制备原生质体第二步：用物理法或化学法促使原生质体融合第三步：杂种细胞的筛选与培养第四步：杂种植株诱导和鉴定第一步：正常小鼠免疫处理第二步：用物理法、化学法或生物法促使动物细胞融合第三步：杂交瘤细胞筛选与培养第四步：单克隆抗体的提纯意义和用途克服远源杂交不亲合的障碍，大大扩展杂交的亲本组合范围制备单克隆抗体诊断、治疗、预防疾病。例如：a.肿瘤定位诊断，放射性抗体肿瘤b.生物导弹治疗，抗体抗癌药物肿瘤比较植物细胞杂交和动物细胞融合过程比较植物细胞杂交和动物细胞融合过程融合细胞遗传特性融合细胞遗传特性1、细胞分裂与染色体丢失、细胞分裂与染色体丢失2基因转移与性状表达基因转移与性状表达基因转移通常是在后代中某些性状得以表达，有时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。3体细胞杂种遗传上的不稳定性体细胞杂种遗传上的不稳定性染色体的基因定位这是融合细胞技术应用的主要成果之一。染色体的基因定位这是融合细胞技术应用的主要成果之一。如：将人体细胞与小鼠细胞融合，在杂种细胞系中，优先排斥人染色体，因此每种细胞系都仅含有一条或若干条特异性的人染色体。通过对这些细胞系生理生化功能分析，就可以断定特定的人染色体的功能。已经证明，仅保留着1号人染色体的人-小鼠杂种细胞系，才能合成人尿苷单硷酸激酶，证实编码这种激酶的人基因定位在1号染色体上。动物细胞融合技术主要应用动物细胞融合技术主要应用细胞融合技术的应用?培育新品种?单克隆抗体的制备?生产树突状细胞抗肿瘤疫苗（DC疫苗）pomato培育新品种生产树突状细胞抗肿瘤疫苗（DC疫苗）与肿瘤细胞融合？与肿瘤细胞融合？细胞杂交瘤技术与单克隆抗体细胞杂交瘤技术与单克隆抗体BCR主要内容主要内容?单克隆抗体的特点?单克隆抗体技术的产生?单克隆抗体的制备原理?单克隆抗体的制备过程?单克隆抗体的纯化?单克隆抗体的应用单克隆抗体（Monoclonal antibody，McAb）单克隆抗体（Monoclonal antibody，McAb）只针对专一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。只针对专一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。特点：分子组成均匀，纯度高、特异性强、效价高，交叉反应少或无，利于实验标准化，可大量生产供应，制备成本低。缺点：鼠源性对人具有较强的免疫原性，反复使用于人体后，可诱导产生人抗鼠的免疫应答，甚至导致机体组织的免疫病理损伤。1975年，Kohler和Milstein创立了1975年，Kohler和Milstein创立了单克隆抗体技术单克隆抗体技术The Nobel Prize 1984for the discovery of the principle for production of monoclonal antibodiesB淋巴细胞：寿命短,分泌特异性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，抗体单克隆抗体制备原理单克隆抗体制备原理依据的原则：1）淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，一种克隆只产生一种抗体2）细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可保持双方亲代细胞的特性3）利用代谢缺陷补救机制，可筛选出杂交瘤细胞单克隆抗体制备基本流程单克隆抗体制备基本流程单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1 抗原制备2 免疫动物3 脾细胞的制备4 骨髓瘤细胞的制备5 饲养细胞6 细胞融合7 杂交瘤细胞的选择性培养8 杂交瘤细胞的筛选9 杂交瘤细胞的克隆化10 单克隆抗体的鉴定11 单克隆抗体的大量制备12 杂交瘤的冷冻保存和复苏单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1抗原制备2 免疫动物3 脾细胞的制备4 骨髓瘤细胞的制备5 饲养细胞6 细胞融合7 杂交瘤细胞的选择性培养8 杂交瘤细胞的筛选9 杂交瘤细胞的克隆化10 单克隆抗体的鉴定11 单克隆抗体的大量制备12 杂交瘤的冷冻保存和复苏纯度越高越好抗原決定基abbcd免疫前要用佐剂把抗原作成乳剂抗原抗原通常有多个抗原決定基Ag X要求：纯度越高越好乳化：佐剂单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1 抗原制备2 免疫动物3 脾细胞的制备4 骨髓瘤细胞的制备5 饲养细胞6 细胞融合7 杂交瘤细胞的选择性培养8 杂交瘤细胞的筛选9 杂交瘤细胞的克隆化10 单克隆抗体的鉴定11 单克隆抗体的大量制备12 杂交瘤的冷冻保存和复苏抗原決定基abbcd免疫前要先把抗原作成乳剂抗原抗原通常有多个抗原決定基Ag XBALB/c免疫约在两月內注射35次X选用与骨髓瘤细胞同源的动物免疫过程和方法：?细胞抗原：可取12107个细胞作腹腔或静脉注射。?可溶性抗原：如蛋白质，1次剂量10100mg/只，需加等量完全弗氏佐剂并经充分乳化，腹腔或小鼠颈背部多点注射。?必须加强免疫?免疫间隔一般23周。?末次免疫后34天，分离脾细胞融合。免疫动物：加强免疫免疫动物：加强免疫?加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。?加强免疫，使B淋巴细胞处于更加易于融合的状态。加强免疫：抗原量减半加强免疫可行多次，直至血清效价达到要求细胞融合前34d,必须加强免疫一次免疫效果检测：免疫23次后取血用ELISA法检测血清效价。单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1 抗原制备2 免疫动物3 脾细胞的制备4 骨髓瘤细胞的制备5 饲养细胞6 细胞融合7 杂交瘤细胞的选择性培养8 杂交瘤细胞的筛选9 杂交瘤细胞的克隆化10 单克隆抗体的鉴定11 单克隆抗体的大量制备12 杂交瘤的冷冻保存和复苏BALB/c免疫约在两月內注射35次X抗原決定基abbcd免疫前要先把抗原作成乳剂抗原抗原通常有多个抗原決定基Ag X-a-b-c-d脾脏产生各种 B 細胞抗体由脾脏收集 B 細胞?冲击免疫后3天，摘除小鼠眼球放血。血清留作阳性对照。?按无菌操作规程取出脾脏，压碎研磨,加入无血清的培养液，用100目的不锈钢网过滤。?细胞计数，活细胞数应高于95。BALB/c免疫约在两月內注射35次X抗原決定基abbcd免疫前要先把抗原作成乳剂抗原抗原通常有多个抗原決定基Ag X-a -b -c -d传统抗体(抗血清)是所有抗体的混和采血后可得传统抗血清-a-b-c-d脾脏产生各种 B 細胞抗体由脾脏收集 B 細胞单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1 抗原制备2 免疫动物3 脾细胞的制备4 骨髓瘤细胞的制备5 饲养细胞6 细胞融合7 杂交瘤细胞的选择性培养8 杂交瘤细胞的筛选9 杂交瘤细胞的克隆化10 单克隆抗体的鉴定11 单克隆抗体的大量制备12 杂交瘤的冷冻保存和复苏抗体X-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd脾脏产生各种 B 細胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫抗原由脾脏收集 B 細胞抗原通常有多个抗原決定基免疫后的脾脏约在两月內注射35次Ag X已建立之小鼠骨髓癌细胞株无限繁殖，不分泌免疫球蛋白品系：SP2/0细胞株HGPRT-,8-氮鸟嘌呤筛选状态：对数生长期切记过度传代HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶)缺陷株对8-氮鸟嘌呤（8-AG）有抗性用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系Ig链名 称来 源耐 受 药 物H LP3/X63-Ag8(X63)BALB/C骨髓瘤MOPC-218-氮鸟嘌呤r1 KP3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)P3/X63-Ag88-氮鸟嘌呤 P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)P3/X63-Ag88-氮鸟嘌呤 K（不分泌型）P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)（X63BALB/C脾细胞）杂交瘤8-氮鸟嘌呤 SP2/0-Ag14(SP2/0)（X63BALB/C脾细胞）杂交瘤8-氮鸟嘌呤 S194/5.XXO.BU.1P3/X63-Ag85-溴脱氧尿嘧啶核苷 210.RCY3.Ag1.2.3LOU大鼠骨髓瘤R2108-氮鸟嘌呤KGM15006TG-A12人骨髓瘤GM15006-巯鸟嘌呤r1 KU-266AR人骨髓瘤U-2668-氮鸟嘌呤单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1 抗原制备2 免疫动物3 脾细胞的制备4 骨髓瘤细胞的制备5 饲养细胞6 细胞融合7 杂交瘤细胞的选择性培养8 杂交瘤细胞的筛选9 杂交瘤细胞的克隆化10 单克隆抗体的鉴定11 单克隆抗体的大量制备12 杂交瘤的冷冻保存和复苏饲养细胞的制备饲养细胞的制备饲养细胞：在体外培养条件下，单个或少数分散的细胞不易顺利生长繁殖。当加入一定量其他活细胞后，常可促进原有少数细胞的繁殖，这种加入的细胞称之为饲养细胞(Feeder cell)。主要有小鼠腹腔细胞和小鼠胸腺细胞应用腹腔细胞的优点：巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化。取小鼠腹腔细胞作饲养细胞（1）取一只68周的健康Balb/c小鼠，拉颈处死。（2）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤（按无菌操作剪开皮肤，应注意不要剪破腹膜），露出腹腔。（3）用注射器将5ml无血清培养液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。（4）1 000rmin离心10min。（每只小鼠可得35108个腹腔细胞）（5）去上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，饲养细胞调至4105/ml个活细胞。（6）将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1 抗原制备2 免疫动物3 脾细胞的制备4 骨髓瘤细胞的制备5 饲养细胞6 细胞融合7 杂交瘤细胞的选择性培养8 杂交瘤细胞的筛选9 杂交瘤细胞的克隆化10 单克隆抗体的鉴定11 单克隆抗体的大量制备12 杂交瘤的冷冻保存和复苏抗体X-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd脾脏产生各种 B 細胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫抗原由脾脏收集B細胞抗原通常有多个抗原決定基免疫后的脾脏约在两月內注射35次Ag X已建立之小鼠骨髓癌细胞株细胞融合-a-b-c-dPEG Cell fusion骨髓癌细胞B cell脾细胞骨髓瘤细胞与B淋巴细胞50%PEG 1min内加完2min内加10ml培养液HAT培养基选择细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比例可从1:21:10不等，常用1:4的比例。反应时间：在两种细胞的混合细胞悬液中，滴加培养液要注意速度和时间。培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1 抗原制备2 免疫动物3 脾细胞的制备4 骨髓瘤细胞的制备5 饲养细胞6 细胞融合7 杂交瘤细胞的选择性培养8 杂交瘤细胞的筛选9 杂交瘤细胞的克隆化10 单克隆抗体的鉴定11 单克隆抗体的大量制备12 杂交瘤的冷冻保存和复苏细胞融合-a-b-c-dPEG Cell fusion骨髓癌细胞B cell脾细胞HAT选择性培养基H（Hypoxanthine）次黄嘌呤A（Aminopterin）氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)胸腺嘧啶核苷；供细胞通过替代途径合成DNADNA生物合成途径及HAT培养基的选择机制次黄嘌呤次黄嘌呤(H)(H)HGPRT酶HGPRT酶核糖核苷酸氨基喋呤核糖核苷酸氨基喋呤(A)(A)阻断DNA,RNA核糖核苷阻断DNA,RNA核糖核苷TK酶TK酶胸腺嘧啶胸腺嘧啶(T)(T)DNA的主要合成途径DNA的补救合成途径HGPRT酶：次黄嘌呤磷酸核糖转化酶TK酶：胸腺嘧啶核苷激酶SP2/0:SP2/0:HGPRT-,TK-脾细胞:脾细胞:HGPRT+,TK+杂交瘤细胞:杂交瘤细胞:HGPRT+,TK+H H次黄嘌呤A A氨基喋呤T T胸腺嘧啶核苷选择性培养基主要/补救途径皆无，长命长命有补救途径，短命(5-7天)有补救途径，长命有补救途径，长命主要途径被氨基喋呤所阻断主要途径被氨基喋呤所阻断胸腺嘧啶核苷供细胞通过替代途径合成胸腺嘧啶核苷供细胞通过替代途径合成DNAHAT选择性培养的方法1.往已于前一日种有饲养细胞的96孔塑料培养板中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml，2105个）。2.轻摇后，放入5CO2饱和湿度的37温箱中培育。3.第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意每次先自培养孔轻轻吸去一半上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。4.于第12、15日换用含有HT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。5.依情况(再维持2周后)改用10%FCS1640液。对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代，同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。细胞融合-a-b-c-dPEG Cell fusion骨髓癌细胞B cell脾细胞HATHybridoma cells 杂交瘤细胞-d-c-b-a分株培养筛选单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1 抗原制备2 免疫动物3 脾细胞的制备4 骨髓瘤细胞的制备5 饲养细胞6 细胞融合7 杂交瘤细胞的选择性培养8 杂交瘤细胞的筛选9 杂交瘤细胞的克隆化10 单克隆抗体的鉴定11 单克隆抗体的大量制备12 杂交瘤的冷冻保存和复苏细胞融合-a-b-c-dHATPEG Cell fusionHybridoma cells 杂交瘤细胞-d-c-b-a骨髓癌细胞B cell脾细胞分株培养筛选ELISA克隆化(确定只有一种细胞)筛选筛选有抗体分泌能力的杂交瘤在培养10d后，用低倍镜观察，杂交瘤细胞的集落长成约占1/31/2视野面积时，即可取培养上清进行特异性抗体的检测，确定有无分泌抗体的能力，以便及时进行细胞克隆化。酶联免疫吸附试验(ELISA)间接血凝试验放射免疫测定间接免疫荧光测定筛选单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1 抗原制备2 免疫动物3 脾细胞的制备4 骨髓瘤细胞的制备5 饲养细胞6 细胞融合7 杂交瘤细胞的选择性培养8 杂交瘤细胞的筛选9 杂交瘤细胞的克隆化10 单克隆抗体的鉴定11 单克隆抗体的大量制备12 杂交瘤的冷冻保存和复苏细胞融合-a-b-c-dHATPEG Cell fusionHybridoma cells 杂交瘤细胞-d-c-b-aNS-1骨髓癌细胞B cell脾细胞分株培养筛选ELISA克隆化(确定只有一种细胞)-d筛选克隆化杂交瘤细胞的克隆化获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系有限稀释法显微操作法软琼脂平板法细胞分选仪法15ml7.5ml7.5ml200 100 50 25 12.5 6.2 个个/ml20 10 5 2.5 1.25 0.62 个个/孔（孔（100ul）稀释稀释有限稀释法特点：不需任何特殊设备操作简便效率高方法：试管连续稀释法试管连续稀释法细胞悬液通过系列稀释每个培养孔平均含1个细胞显微镜下观察：选择只有一个集落生长的孔大量生长后测培养上清抗体含量抗体阳性孔细胞建系单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1 抗原制备2 免疫动物3 脾细胞的制备4 骨髓瘤细胞的制备5 饲养细胞6 细胞融合7 杂交瘤细胞的选择性培养8 杂交瘤细胞的筛选9 杂交瘤细胞的克隆化10 单克隆抗体的制备和纯化11 单克隆抗体的鉴定12 杂交瘤的冷冻保存和复苏-d细胞融合-a-b-c-dELISAHATPEG Cell fusionHybridoma cells 杂交瘤细胞-d-c-b-a-dNS-1骨髓癌细胞B cell脾细胞分株培养筛选单抗克隆化(确定只有一种细胞)筛选动物体内诱生法体外培养法?选用BALB/c小鼠?先用降植烷或液体石蜡0.5 ml 进行小鼠腹腔注射?一周后将杂交瘤细胞（5105 1.0106）接种到小鼠腹腔?通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集510ml的腹水，有时甚至超过40ml。小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体（腹水：520mg/ml；血清：110mg/ml）。这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的1001 000倍。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。*接种细胞的数量应适当，可根据腹水生长情况适当增减。*利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。小鼠腹腔接种法单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化盐析凝胶过滤离子交换层析亲和层析（目前最有效的单克隆抗体纯化方法）单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1 抗原制备2 免疫动物3 脾细胞的制备4 骨髓瘤细胞的制备5 饲养细胞6 细胞融合7 杂交瘤细胞的选择性培养8 杂交瘤细胞的筛选9 杂交瘤细胞的克隆化10 单克隆抗体的制备11 单克隆抗体的鉴定12 杂交瘤的冷冻保存和复苏-d细胞融合-a-b-c-dELISAHATPEG Cell fusionHybridoma cells 融合瘤细胞-d-c-b-a-d骨髓癌细胞B cell脾细胞分株培养筛选单抗克隆化(确定只有一种细胞)筛选性质鉴定杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，B细胞染色体40条,SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条Ig类型亚类测定：双扩法/ELISA效价测定：腹水或培养液的稀释度表示亲和性测定：测定亲和常数K分子量：western blot特异性测定：抗原类似物交叉反应-d细胞融合-a-b-c-dAgXAgXELISAHATPEG Cell fusionHybridoma cells 杂交瘤细胞（Subcloning）(确定只有一种细胞)ddabcdabcd+-X-d-c-b-a+-dNS-1骨髓癌细胞B cell脾细胞分株培养筛选筛选单抗传统抗体(抗血清)试验专一性对抗原的反应无法分辨完全不同d旧有抗原d新的抗原性质鉴定：特异性杂交瘤的冷冻保存及复苏杂交瘤的冷冻保存及复苏配制方案：杂交瘤细胞（15）x106/ml+细胞冻存液(30%40%牛血清，50%60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30-70液氮“快融”：立即浸入3740水浴中，使其迅速融化复苏抗体X-a-b-c-d-a -b -c -d抗原決定基BALB/cabbcd传统抗体(抗血清)是所有抗体的混和脾脏产生各种 B 細胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫抗原采血后可得传统抗血清已建之小鼠骨髓癌细胞株由脾脏收集 B 細胞抗原通常有多个抗原決定基免疫后的脾脏约在两月內注射35次Ag X-d细胞融合-a-b-c-dELISAHATPEG Cell fusionHybridoma cells 杂交瘤细胞（Subcloning）(确定只有一种细胞)-d-c-b-a-d骨髓癌细胞B cell脾细胞分株培养筛选筛选单抗试验专一性AgXAgXddabcdabcd+-X+-传统抗体(抗血清)对抗原的反应无法分辨完全不同d旧有抗原d新的抗原单克隆抗体单克隆抗体多克隆抗体多克隆抗体特异性相对的高相对的低均一性强变异性大抗体产量不限不易生产大量均一性抗体抗体的亲和力相对的小相对的高制备方法复杂、费时、耗工比较容易单克隆抗体与多克隆抗体的比较单克隆抗体与多克隆抗体的比较单克隆抗体制备过程中的注意事项?污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。?融合后杂交瘤不生长。PEG毒性或作用时间太长血清质量差支原体污染HAT培养基A过量或HT不足?3.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体。支原体污染染色体丢失?诊断用试剂?研究工作中的“探针”?特异性抗原的发现及提纯?疾病的治疗单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用疾病的治疗被动免疫治疗：中和抗原、杀死靶细胞中和特性、抗体依赖的细胞毒作用、免疫复合物活化补体作为生物“导弹”的运载工具治疗肿瘤：增强对肿瘤的杀伤，减轻对无关细胞的伤害利用抗肿瘤抗原McAb能与肿瘤特异性结合的能力，在McAb上绑定细胞毒素、化疗药物、放射性同位素等单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用McAbs treatment for cancer cellsADEPT,antibody directed enzyme prodrug therapy;ADCC,antibody dependent cell-mediated cytotoxicity;CDC,complement dependent cytotoxicity;MAb,monoclonal antibody;scFv,single-chain Fv fragment.Carter P:Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies.Nat Rev Cancer 2001;1:118-129 双特异性抗体修饰性抗体被动治疗整体水平抗体整体水平抗体细胞工程抗体细胞工程抗体基因工程抗体基因工程抗体多克隆抗体（抗血清）多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体单克隆抗体第二代抗体第二代抗体嵌合抗体、改形抗体嵌合抗体、改形抗体第三代抗体第三代抗体“小型化抗体小型化抗体”（单链抗体）（单链抗体）组合抗体库技术组合抗体库技术噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术IgIg基因转基因小鼠基因转基因小鼠抗体真核表达技术抗体真核表达技术第一代抗体第一代抗体鼠源单抗的可变区鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体融合而得到的抗体把鼠抗体的互补决定区把鼠抗体的互补决定区(CDR)(CDR)序列移植到人抗序列移植到人抗体的可变区内体的可变区内小分子抗体Fab：抗原结合片断Fv：可变区片段ScFv：单链可变区片段SdAb：单区抗体是指能同时识别是指能同时识别2 2种抗原的抗体。种抗原的抗体。1 1种为种为对应肿瘤相关抗原。另对应肿瘤相关抗原。另1 1种为对应效应种为对应效应成分。成分。即能即能结合靶肿瘤细胞结合靶肿瘤细胞又能又能结合高结合高细胞毒性的效应细胞细胞毒性的效应细胞,将效应细胞富集将效应细胞富集在肿瘤周围在肿瘤周围,而且可以模拟天然配体的而且可以模拟天然配体的作用作用,与细胞表面引发分子结合与细胞表面引发分子结合,激活效激活效应细胞应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。双特异性抗体双特异性抗体(bispecificbispecific antibody,BSAbantibody,BSAb)