小鼠骨髓细胞微核试验.ppt

食品专业食品专业1 1 通过本次实验通过本次实验,学习和掌握小鼠骨髓学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞多染红细胞(PCEPCE)微核微核的测定方法，了解的测定方法，了解环磷酰胺对骨髓细胞染色体的损伤作用。环磷酰胺对骨髓细胞染色体的损伤作用。实验目的实验目的1.1.1.2 2实验原理实验原理2.2.微核试验微核试验是用于染色体损伤和干扰细是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。微核微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的粒，大小相当于细胞直径的1/201/201/51/5，呈，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。一般认间期细胞中可以出现一个或多个。一般认为微核是为微核是细胞内染色体断裂细胞内染色体断裂或或纺锤丝受影纺锤丝受影响响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的的遗传物质遗传物质。3 3实验原理实验原理2.2.所以，微核试验能检测化学毒物或物理因所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的素诱导产生的染色体完整性改变染色体完整性改变和和染色体染色体分离改变分离改变这两种遗传学终点。这两种遗传学终点。微核可以出现在微核可以出现在多种细胞多种细胞中，但在有中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。由于相区别。由于红细胞红细胞在成熟之前最后一次在成熟之前最后一次分离后数小时可将分离后数小时可将主核排出主核排出，而仍保留，而仍保留微微核于核于PCEPCE细胞细胞中，因此通常中，因此通常计数计数PCEPCE细胞细胞中中的微核。的微核。4 4实验动物：实验动物：实验材料实验材料3.3.体重体重18-22g18-22g小鼠，雌雄对半。小鼠，雌雄对半。实验器材：实验器材：手术剪、晾片架、眼科剪、眼科镊、手术剪、晾片架、眼科剪、眼科镊、显微镜、饲养笼等。显微镜、饲养笼等。实验试剂：实验试剂：甲醇、冰醋酸、吉姆萨染液、小牛甲醇、冰醋酸、吉姆萨染液、小牛血清、生理盐水、环磷酰胺。血清、生理盐水、环磷酰胺。5 54.4.实验步骤实验步骤1.1.动物选择：动物选择：一般常用的试验动物为大、小鼠。一般常用的试验动物为大、小鼠。以小鼠使用最为广泛，要求体重以小鼠使用最为广泛，要求体重181820g20g，7-127-12周龄。每组小鼠数量周龄。每组小鼠数量1010只，雌雄各半。只，雌雄各半。2.2.染毒途径染毒途径：根据研究目的或受试化学毒物性：根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。但原则上应尽可能采用与及注射等染毒途径。但原则上应尽可能采用与人体接触化学毒物相同的途径。人体接触化学毒物相同的途径。3.3.染毒次数及取样时间：染毒次数及取样时间：研究证实化学毒物需研究证实化学毒物需在靶器官内蓄积至一定的浓度才具有致突变作在靶器官内蓄积至一定的浓度才具有致突变作用。不同化学毒物诱发微核出现的高峰时间也用。不同化学毒物诱发微核出现的高峰时间也不尽相同。波动范围可以达到不尽相同。波动范围可以达到242472h72h。这就要。这就要一、试验动物及处理一、试验动物及处理6 64.4.实验步骤实验步骤求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点。求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点。考虑到以上两方面的原因，建议采用多次染毒考虑到以上两方面的原因，建议采用多次染毒的方法。其中以的方法。其中以4 4次染毒比较方便合理。即每天次染毒比较方便合理。即每天染毒一次，连续染毒一次，连续4 4天，第天，第5 5天取样。这样，取样天取样。这样，取样一次就能覆盖一次就能覆盖242472h72h高峰，如果高峰延迟到高峰，如果高峰延迟到96h96h也不会漏掉。也不会漏掉。4.4.剂量选择：剂量选择：受试化学毒物的最大剂量除受溶受试化学毒物的最大剂量除受溶解度大小所限外，应达到最大耐受量解度大小所限外，应达到最大耐受量。一般。一般情情况下，应设况下，应设3 35 5个或更多剂量组，剂量覆盖的个或更多剂量组，剂量覆盖的范围要达到范围要达到3 3个数量级以上。同时还应设立阳性个数量级以上。同时还应设立阳性对照组和阴性对照组。阳性对照组可用环磷酰对照组和阴性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺胺(50-100mg/kg)(50-100mg/kg)或丝裂霉素或丝裂霉素C(10mg/kg)C(10mg/kg)腹腔注腹腔注射射1 1次或次或2 2次。阴性对照组使用等体积的溶剂。次。阴性对照组使用等体积的溶剂。7 74.4.实验步骤实验步骤二、骨髓液的制备和涂片二、骨髓液的制备和涂片 试验动物最后一次染毒后，按确定的时间用试验动物最后一次染毒后，按确定的时间用颈颈椎脱臼椎脱臼或或麻醉麻醉的方法将其的方法将其处死处死，四肢固定于解剖，四肢固定于解剖板，将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨，板，将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨，擦净血污，剔去肌肉，剪去股骨两端，用擦净血污，剔去肌肉，剪去股骨两端，用小型弯小型弯止血钳止血钳将骨髓将骨髓挤于挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片有一滴小牛血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片。也可在动物处死后，迅速上，混合均匀后推片。也可在动物处死后，迅速用手术剪将其两腿股骨取下，剔去肌肉，用生理用手术剪将其两腿股骨取下，剔去肌肉，用生理盐水洗去血污和碎肉，剪去股骨两端，用带针头盐水洗去血污和碎肉，剪去股骨两端，用带针头的的2ml2ml注射器吸取注射器吸取小牛血清小牛血清，插人骨髓腔内，插人骨髓腔内，将骨将骨髓冲人离心管，然后用吸管吹打骨髓团块使其均髓冲人离心管，然后用吸管吹打骨髓团块使其均匀，以匀，以1000r1000rminmin离心离心10min10min，弃去多余的上清液，弃去多余的上清液，留下约留下约0.5ml0.5ml8 84.4.实验步骤实验步骤与沉淀物混匀后，用滴管吸取并滴一滴在清洁的与沉淀物混匀后，用滴管吸取并滴一滴在清洁的载玻片上推片。阳性及阴性对照组按上述方法同载玻片上推片。阳性及阴性对照组按上述方法同时进行处理。时进行处理。三、固定三、固定 将推好晾干的骨髓片放人染色缸中，用将推好晾干的骨髓片放人染色缸中，用甲醇溶甲醇溶液固定液固定15min15min，取出晾干。不能及时染色的涂片，取出晾干。不能及时染色的涂片也应固定后保存。也应固定后保存。四、染色四、染色 将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的GiemsaGiemsa应应用液用液(Giemsa(Giemsa储备液储备液l l份加份加pH6.8pH6.8的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液9 9份份)染色染色10-15min10-15min，然后冲洗掉玻片上的染色液，然后冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。置晾片架上晾干。9 94.4.实验步骤实验步骤五、观察计数五、观察计数 先在先在低倍镜低倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在较好的区域，再在油镜下油镜下观察计数，观察计数，PCEPCE细胞呈细胞呈灰蓝色灰蓝色，正染红细胞，正染红细胞(NCE)(NCE)呈橘黄色。细胞中含呈橘黄色。细胞中含有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可出核质一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可出现一个或多个微核。计数现一个或多个微核。计数10001000个个PCEPCE中含微核的中含微核的PCEPCE数，并且计数数，并且计数200200个细胞中个细胞中PCEPCE与与NCENCE的比值。的比值。10105.5.结果分析结果分析本试验中只计数本试验中只计数PCEPCE中的微核，微核率以千分中的微核，微核率以千分率表示。每只动物为一观察单位。每组的雌、雄率表示。每只动物为一观察单位。每组的雌、雄动物分别计算微核动物分别计算微核PCEPCE的均值。雌、雄动物之间的均值。雌、雄动物之间无明显的性别差异时可合并计算结果，否则应分无明显的性别差异时可合并计算结果，否则应分别进行计算；正常的别进行计算；正常的PCEPCENCENCE比值约为比值约为1(1(正常范正常范围为围为0.60.61.2)1.2)。如比值。如比值0.10.1，则表示，则表示PCEPCE形成受形成受到严重抑制，受试化学毒物的剂量过大，试验结到严重抑制，受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。阴性对照组和阳性对照组的微核发生果不可靠。阴性对照组和阳性对照组的微核发生率，应与试验所用动物种属及品系的文献报道结率，应与试验所用动物种属及品系的文献报道结果或者是与研究的历史数据相一致。果或者是与研究的历史数据相一致。11116.6.注意事项注意事项1.1.良好的骨髓涂片及良好的染色，是本实良好的骨髓涂片及良好的染色，是本实验的关键步骤。验的关键步骤。2.2.熟悉并正确区分跟中骨髓细胞。熟悉并正确区分跟中骨髓细胞。1212微核微核11313微核微核21414