PTEN和p53蛋白在肝癌组织中的表达及意义[1].pdf

42PTEN 和 p53 蛋白在肝癌组织中的表达及意义程黎明1，王思元2，林菊生3Expression of Phosphatase and Tensin Homology Deleted onChromosome Ten（PTEN）and p53 Protein and Their Significancein Human Hepatocellular CarcinomasCheng Li-ming1,Wang Si-yuan2,Lin Ju-Sheng3华中科技大学同济医学院附属同济医院 1.检验科，2.消化内科，3.肝病研究所，湖北 武汉 4300301.ClinicalLaboratory；2.Department of Gastroenterology；3.InstituteofHepatology,TongjiHospital Affiliated to Tongji MedicalCollege,HuazhongUniuersityofScience and Technology,Wuhan,Hubei,430030，P.R.China通讯作者：程黎明Correspondence toz Cheng Li-mingTeIz 86-27-83663555Faxz 86-27-83662854E-maiIz chengIiming 2002 hotmaiI.com收稿日期：2002-04-04修回日期：2002-07-22【ABSTRACT】BACKGROUND&OBJECTIVE：Tumor suppressor gene phospha-tase and tensin homology deleted on chromosome ten(PTEN)was first reportedin 1997 and has become a hot spot shortly after discovery.mutations of PTENgene in human hepatocellular carcinomas(HCCs)have been examined byseveral groups abroad,while little is known about expression of PTEN in HCCs.lt has been believed that p53 mutation plays a role in the oncogenesis ofHCCs.However,divergence exist as regards the relationship between p53mutation and some biological behaviors of HCCs.The current study wasdesigned to investigate the correlations of expression of PTEN and mutant p53with carcinogenesis and tumor progression of HCCs.METHODS:Sixty-twoparaffin-embedded hepatocellular carcinoma samples were composed and allthe tissue sections included both HCC and surroundingnon-tumor livertissues.ExpressionofPTENandmutantp53wasexaminedusingSPimmunohistochemicaltechnigue.RESULTS:All sixty-two samplesshoweddecidedly positive staining of PTEN in surrounding non-tumor liver tissues(plasma).While,only twenty-nine tumors were detected positive staining ofPTEN(46.8%).Theexpressionlevelof PTEN in HCC samples withoutinvasiveness or with complete capsule was higher than that in HCC samples withinvasiveness or without complete capsule.Nopositive staining of p53 wasdetected in surrounding non-tumor liver tissues for all sixty-two samples.However,twenty-one tumors showed positive staining of p53(nucleon).Theexpression level of p53 protein was not related with invasion or differentiation ofHCCs.CONCLUSION：Loss of PTEN expression and mutation of p53 may play arole in occurrence of HCCs.Loss of PTEN expression may be pertinent todeterioration of HCCs.KEYWORDS:Hepatoma;Tumor suppressor gene(TSG);Phosphatase andtensin homology deleted on chromosome ten(PTEN);p53【摘要】背景和目的：抑癌基因 PTEN 于 1997 年首次被报道之后即成为研究热点。国外曾有研究小组检测人类肝癌中 PTEN 基因突变情况，但对有关 PTEN 蛋白在肝癌中的表达情况了解甚少；p53 基因突变是肝癌发生的机制之一，但对于 p53基因突变与肝癌某些生物学行为的相关性，不同研究的结果不一。我们拟通过检测PTEN、p53 蛋白在肝癌中的表达来了解 PTEN、p53 与肝癌发生和进展的关系。方法：本研究共取 62 例石蜡包埋的肝癌标本，所有组织切片均含肝癌组织及癌旁组织。采用免疫组化 SP 法检测 PTEN 及突变的 p53 蛋白的表达情况。结果：62 例标本中癌旁肝组织均呈现明确的 PTEN 阳性染色（胞浆），只有 29 例(46.8%)标本中肝癌组织呈阳性染色，PTEN 在有包膜或无侵袭性肝癌中的表达明显高于无包膜或有侵袭性的肝癌。所有标本癌旁肝组织均未见 p53 阳性染色，21 例肝癌组织 p53 染色呈阳性（胞核）。p53 蛋白的表达与肝癌侵袭性或分化程度无关。结论：PTEN 的失表达及 p53 基因突变可能在肝癌发生中发挥作用，PTEN 失表达还可能与肝癌的恶性进展有关。关键词：肝肿瘤；抑癌基因；PTEN；p53中图分类号：R735.7文献标识码：A文章编号：1000-467X(2003)01-0042-04癌症Chinese JournaI of Cancer,2003,22(1)：42-45基础研究43Edmondson cIassificationI-II-VInvasionYesNoCompIete capsuIeYesNoDiameter of tumor 5 cm 5 cm236920171272220132013528330 0.05 0.05 0.05PTEN 抑癌基因定位于第 10g23 号染色体上，是人类发现的第一个具有酪氨酸磷酸酶作用的抑癌基因1。PTEN 全称为 Phosphatase and tensin homoIogydeIeted on chromosome ten，即“与张力蛋白和辅助蛋白同源、第 10 号染色体丢失的磷酸酶基因”。PTEN基因的异常可见于多种人类肿瘤，是继 p53 之后另一突变较为广泛、与肿瘤发生关系密切的抑癌基因。据文献报道，原发性肝癌中 PTEN 基因的突变率较低2 5，但邻近区域杂合性丢失发生率高达 30%5；p53基因突变是原发性肝癌发生的重要机制，部分作者认为其突变还与肝癌的组织学分级或侵袭转移6有关。本文试图对 PTEN 及 p53 这两种抑癌基因在人类原发性肝癌中的表达情况及其临床病理意义作一探讨。1材料和方法1.1材料收集 1996 年至 1999 年同济医院外科手术切除的原发性肝癌标本 62 例，患者术前均未经任何抗癌治疗。每例标本均包括肝癌组织及癌旁的非癌肝组织。取材标本经中性福尔马林固定、脱水、常规石蜡包埋，制备 4 Mm 连续切片，并经 HE 染色，由病理科医生进行诊断和病理分级。1.2方法采用免疫组化 S-P 法，抗 PTEN 单克隆抗体为Santa Cruz 公司产品，按 11 50 稀释。抗 p53 单克隆抗体 DO-7 为 Dako 公司产品，按 11 50 稀释。S-P 试剂盒购自 Zymed 公司。以已知阳性组织切片作阳性对照，以 PBS 代替一抗作阴性对照。切片常规脱蜡至水，3%双氧水处理 5 min 灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原，加一抗 4C湿盒中过夜，加生物素化二抗 37C反应 30 min，以辣根过氧化物酶标记链酶亲合素 37C处理 30 min，加 DAB 显色，脱水、封片后在光镜下观察。1.3阳性判断标准PTEN 蛋白阳性信号主要位于胞浆内，为胞浆内均匀的棕黄色颗粒状染色。PTEN 蛋白在组织中的染色情况分 3 种：A，所有细胞均着棕色；B，部分细胞着棕色，部分细胞未着色（混合型染色）；C，所有细胞均未着色。其中 A、B 归为 PTEN 阳性表达组，C 为 PTEN 阴性组（分组标准参照参考文献 7）。p53 蛋白以细胞核或细胞浆有明确的棕褐色着色为阳性细胞，在高倍镜视野下计数 1 000 个癌细胞，其中阳性细胞数与总细胞数比值即为肝癌细胞 p53 蛋白阳性表达率。p53 蛋白表达阳性率在 0 10%为（-），阳性细胞数在 11%25%为（+），阳性细胞数在 26%50%为（+），阳性细胞数在 50%以上为（+）8。将10%者定为 p53 蛋白表达阴性，将11%(+)者例数相加作为阳性例数。1.4统计学分析方法采用两样本率比较的 X2检验，以!0.05 为差异有统计学意义。2结果2.162 例肝癌组织及癌旁组织 PTEN 染色结果62 例标本中，所有癌旁肝组织（包括肝炎、肝硬变和正常肝组织）均呈显著的 PTEN 阳性染色，阳性率为 100%；而肝癌组织 PTEN 染色阳性者 29 例，阳性率为 46.8%，其中所有细胞均着色者（图 1）23例，部分细胞着色者（图 2）6 例（此 6 例标本的肝癌组织中 PTEN 阳性表达率均大于 10%）。所有细胞均未着色者（阴性，图 3）33 例。上述结果提示在癌旁非癌肝组织和肝癌组织中 PTEN 基因的表达存在显著差异。我们将有多发病灶和/或血管癌栓的病例定为侵袭性肝癌，将单发病灶且无血管癌栓者定为非侵袭性肝癌。PTEN 蛋白在非侵袭性肝癌或有完整包膜的肝癌中的表达明显高于侵袭性肝癌或无完整包膜的肝癌（!0.05 及!0.01）。而在不同大小、不同分化程度的原发性肝癌中，PTEN 的表达无显著性差异。结果见表 1。2.262 例肝癌组织及癌旁组织 p53 染色结果本组中有 21 例肝癌标本呈现 p53 阳性染色，主要表现为细胞核内棕褐色颗粒状或团块状着色（图4），少数可见胞浆内着色，而癌旁肝组织均未见细程黎明，等.PTEN 和 p53 蛋白在肝癌组织中的表达及意义CIinicaI pathoIogicaI features!Expression of PTENPositiveNegative表 1PTEN 基因表达与肝癌临床病理学特征的关系Tab.1Relationship between the Expression of Phosphataseand Tensin Homology Deleted on Chromosome Ten(PTEN)andClinicalPathologicalFeaturesofHuman Hepatocellular Carcinoma44Edmondson ciassification!-#-$InvasionYesNoCompiete capsuieYesNoDiameter of tumor 0.05 0.05 0.05胞核或细胞浆着色。统计结果表明，p53 蛋白的表达与肿瘤大小、分化程度、有无侵袭性的相关性均无统计学意义。结果见表 2。3讨论3.1PTEN 基因与原发性肝癌的关系PTEN 基因于 1997 年首次被发现。此前已发现很多癌基因具有蛋白激酶活性，学者们推测应该存在一种抑癌基因，它所编码的蛋白质具有磷酸酶作用，PTEN 的出现使这一设想得到证实，因而引起国际社会的广泛关注9。PTEN 通过对焦点粘附激酶（FAK）的去磷酸化作用影响整合素介导的聚焦粘附过程，抑制肿瘤细胞的浸润和转移；通过对 1,3,5-三磷酸肌醇（PIP3）的去磷酸化作用影响PI-3K/Akt 信号通道,使肿瘤细胞停留在 G1期和/或引起肿瘤细胞的凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。故PTEN 基因的突变、缺失或表达产物的失活等，影响肿瘤的发生与发展。我们检测到原发性肝癌中 PTEN 蛋白的失表达率极高（53.2%），而相应的 PTEN 基因的突变率却较低（10%），因而推测在原发性肝癌中，PTEN 基程黎明，等.PTEN 和 p53 蛋白在肝癌组织中的表达及意义Ciinicai pathoiogicai features!表 2p53 蛋白表达与肝癌临床病理学特征的关系Tab.2 Relationship between p53 Expression and ClinicalPathological Features of Human Hepatocellular CarcinomaExpression of p53PositiveNegative!#$图 1PTEN 阳性染色的肝癌组织图 2PTEN 混合型染色的肝癌组织图 3PTEN 蛋白表达阴性的肝癌组织图 4p53 蛋白表达阳性的肝癌组织Fig.1 Positive staining of PTEN in hepatoceiiuiar carcinoma tissue(X 200)Fig.2 Mixed staining of PTEN in hepatoceiiuiar carcinoma tissue(X 200)Fig.3 Negative staining of PTEN in hepatoceiiuiar carcinoma tissue(X 100)Fig.4 Positive staining of p53 in hepatoceiiuiar carcinoma tissue(X 100)45因失活的主要模式可能不是基因突变，而是表达缺失（包括 mRNA 和蛋白质）。类似情况还可见于前列腺癌10、乳腺癌11、散发性黑色素瘤12等。Dahia13等认为某些影响转录的因素可能参与 PTEN 的灭活，而 mRNA 甲基化可能是 PTEN 转录受抑制的原因之一10。PTEN 蛋白失表达在原发性肝癌中是频发事件，而配对的癌旁肝组织均呈现明确的 PTEN阳性染色，提示抑癌基因 PTEN 的失活可能是肝癌的发生机制之一。PTEN 失活的环节和机制是下一步研究的方向。我们发现侵袭性肝癌和非侵袭性肝癌、无完整包膜的肝癌和有完整包膜的肝癌中PTEN 的表达差异有统计学意义，提示 PTEN 基因的灭活可能与肝癌的浸润转移有关。PTEN 在不同大小、不同分化程度的肝癌中的表达差异无统计学意义。3.2p53 基因与原发性肝癌的关系免疫组织化学方法难以检测到野生型 p53 蛋白，因其半衰期很短，而很多突变的 p53 基因所表达的蛋白产物具有较长的半衰期（2 12 h），可以在细胞内聚集。既往的研究表明，用免疫组化方法检测p53 蛋白能较好地反映 p53 基因的突变。突变的 p53蛋白能与野生型 p53 蛋白形成寡聚蛋白复合物，使野生型 p53 蛋白降低或丧失与 DNA 结合的能力，从而不能控制这些结合位点的基因转录，使细胞生长繁殖失控，进而引起细胞转化及癌变。在肝癌发生的机制中，黄曲霉毒素和乙型肝炎病毒引起的 p53 基因第 249 位密码子突变被认为是肿瘤发生的中间环节。我们发现在本组 62 例肝癌标本中 p53 蛋白的检出率达 33.9%，而癌周肝组织（包括肝炎、肝硬化组织）未发现 p53 蛋白的异常表达，提示 p53 基因的改变发生在肝癌癌变启动阶段之后；与既往的研究不同的是，我们并未找到 p53 蛋白表达与肝癌的分化程度及侵袭性有明显相关性的依据。我们认为，p53 基因突变作为肝癌的发生机制之一无可争议，但是否能作为肿瘤恶性程度和转移的生物学标志，尚值得商榷。然而上述结果也可能与本研究所选取的样本例数较少有关。总之，本研究结果提示，PTEN 与 p53 都是抑癌基因家族中的重要成员，但 p53 的异常发生在基因水平，而 PTEN 的失活极有可能是基因后事件，它们的失活或突变都可能与肝癌的发生有关。参考文献Li J,Yen C,Liaw D,et aI.PTEN,a putative protein tyrosinephosphatase gene mutated in human brain,breast,and prostatecancerJ.Science,1997,275:1943-1947.Kawamura N,Nagai H,Bando K,et aI.PTEN/MMAC1mutations in hepatoceIIuIar carcinomas:somatic inactivation ofboth aIIeIes in tumorsJ.Jpn J Cancer Res,1999,90(4):413-418.Yao YJ,Ping XL,Zhang H,et aI.PTEN/MMAC1 mutations inhepatoceIIuIarcarcinomas J .Oncogene,1999,18(20):3181-3185.Yeh KT,Chang JG,Chen YJ,et aI.Mutation anaIysis of theputative tumor suppressor gene PTEN/MMAC1 in hepatoceIIuIarcarcinomaJ.Cancer Invest,2000,18(2):123-129.Fujiwara Y,Hoon DS,Yamada T,et 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