肝素钠有关物质检测方法学研究及效价的快速测定.pdf

浙江大学硕士学位论文摘要摘要肝素钠(He pa r in so dium)是一种硫酸氨基葡聚糖的钠盐，具有抗凝血作用，是 需要迅速达到抗凝作用的首选药物，被广泛用于治疗静脉血栓和预防凝血。2008 年爆发的“肝素钠事件”暴露出肝素钠的药品标准存在严重漏洞。经调查，大量 掺杂了多硫酸软骨素(Ove r-sul f a t e d c h o ndr o it in sul f a t e,OSCS)的肝素钠污染品是 造成病患出现了过敏反应和其他副作用的主要原因。由于多硫酸软骨素的结构、电荷密度、分子量、抗凝活性均与肝素钠十分相似，如何快速和准确测定肝素钠 中的多硫酸软骨素和硫酸皮肤素(De r ma t a n sul f a t e,DS)等杂质，是提高该药品检 测水平的关键，也是提高肝素钠用药安全性的关键。因此本文首先对2008年以来各国药典及文献报道的肝素钠有关物质的检测 方法进行了比较系统的研究，建立了以新的阴离子交换HPLC检测方法，优化了 阴离子交换HPLC法的各种色谱条件，并对新方法进行了包括分离度、重复性和 耐用性等的方法学验证，确立了肝素钠中的OSCS和DS的检测限和定量限，应 用该方法对肝素钠相关产品进行检测，不仅可以准确测定肝素钠粗品、原料药和 制剂中的OSCS和DS,还可以准确测定低分子量肝素钠(LMWH)、依诺肝素钠 原料药和制剂中的OSCS,新方法切实可行，有望应用到新的药典标准中。将新的弱阴离子交换HPLC法与毛细管电泳(CE)、核磁共振(NMR)这两种 OSCS的测定方法进行比较研究。从方法可靠性、简便性、经济可行性等指标分 别考察。提出了 WAX-HPLC法是一种适合中小厂家规模的分析方法。为了快速测定肝素钠在制备过程中的效价变化，还优化开发了天青A双波 长分光光度法。以天青A作为显色剂，以酶标仪代替分光光度计，达到快速测 定肝素钠效价目的的同时，也可以减少样品和试剂的用量。与羊血浆法测定结果 相差土4U/mg以内。关键词：阴离子交换；肝素钠：多硫酸软骨素；硫酸皮肤素；HPLC；肝素钠效 价：天青A：双波长分光光度法VI浙江大学硬士学位论文摘要VII浙江大学硕士学位论文ABSTRACIABSTRACTHe pa r in so dium(HP)is t h e so dium sa l t o f sul f a t e d gl yc o sa mino gl yc a ns.He pa r in is be st kno wn a s a n int r a ve no us a nt ic o a gul a nt a nd wa s int r o duc e d int o me dic a l pr a c t ic e in t h e 1930s,so it is o ne o f t h e o l de st dr ugs c ur r e nt l y in wide spr e a d c l inic a l use.Ho we ve r,se r io us a dve r se e ve nt s a sso c ia t e d wit h h e pa r in a dminist r a t io n we r e r e po r t e d dur ing 2007-2008.Th is a dul t e r a t io n ma de t h e ne ws a nd put h e pa r in int o t h e l ime l igh t.As r e po r t e d,o ve r-sul f a t e d c h o ndr o it in sul f a t e(OSCS)in c o nt a mina t e d h e pa r in pr o duc t s is t h e so ur c e o f pa t ie nt s r e c e iving h e pa r in so dium r e sul t ing in a c ut e a l l e r gic r e a c t io ns a nd e ve n de a t h.OSCS is ve r y simil a r wit h h e pa r in so dium in st r uc t ur e,c h a r ge de nsit y,mo l e c ul a r we igh t a nd a nt ic o a gul a nt a c t ivit y.He nc e,t o se t up a f a st a nd a c c ur a t e me t h o d t o de t e r mine OSCS,de r ma t a n sul f a t e(DS)a nd o t h e r impur it ie s in h e pa r in so dium is no t o nl y t h e ke y t o r e vise t h e ph a r ma c o pe ia mo no gr a ph s,but a l so t o impr o ve t h e q ua l it y l e ve l o f pr o duc t s,t h us gua r a nt e e s it s dur g sa f e t y.Fir st l y,t o e st a bl ish a pr e c ise me t h o d t o de t e r mine simul t a ne o usl y t h e r e l a t e d subst a nc e s o f OSCS a nd DS in h e pa r in pr o duc t s,VWD wa s use d t o de t e r mine OSCS a nd DS.Five me t h o ds we r e c o mpa r e d a c c o r ding t o t h e ir r e so l ut io n o f OSCS a nd DS.Me t h o d E wa s t h e o pt imize d me t h o d wit h t h e gr e a t e st r e so l ut io n a nd t h e o r e t ic a l pl a t e s,t h e l imit o f de t e c t io n(LOD)a nd l imit o f q ua nt it a t io n(LOQ)f br t h e OSCS in h e pa r in so dium we r e de t e r mine d t o be 0.025%a nd 0.03%,r e spe c t ive l y.Th e LOD a nd LOQ f o r de r ma t a n sul f a t e we r e de t e r mine d t o be 0.03%a nd 0.05%,r e spe c t ive l y.Th is me t h o d is mo r e a c c ur a t e,se nsit ive,r o bust a nd r e pr o duc ibl e,a nd it c o ul d be a ppl ie d t o r e pl a c e t h e c ur r e nt ph a r ma c o pe ia spe c if ic a t io ns o f h e pa r in pr o duc t s.In o r de r t o se t up a n a na l yt ic a l me t h o d suit a bl e f o r sma l l a nd me dium-sc a l e ma nuf a c t ur e r s,a c o mpa r a t ive st udy o f t h e t h r e e ma in h e pa r in r e l a t e d subst a nc e s de t e c t io n me t h o ds:c a pil l a r y e l e c t r o ph o r e sis,nuc l e a r ma gne t ic r e so na nc e a nd we a k a nio n e xc h a nge HPLC,wa s c a r r ie d o ut.Th e r e l ia bil it y,simpl ic it y a nd e c o no mic f e a sibil it y indic a t o r s be t we e n t h e me t h o ds we r e inve st iga t e d.Th e r e sul t s indic a t e d t h a t WAX-HPLC me t h o d wa s pr o ve d t o be t h e mo st a ppr o pr ia t e me t h o d.To de t e r mine t h e po t e nc y o f h e pa r in so dium in t h e pr e pa r a t io n pr o c e ss r a pidl y,dua l wa ve l e ngt h spe c t r o ph o t o me t r y wit h a zur e A wa s use d.Mic r o pl a t e r e a de r wa s use d t o subst it ut e t h e spe c t r o ph o t o me t e r in t h e me t h o d.Th is me t h o d is r a pid a nd vin浙江大学硕士学位论文ABSTRACTa c c ur a t e,a l so c a n r e duc e t h e a mo unt o f sa mpl e s a nd r e a ge nt s.In c o mpa r iso n wit h t h e sh e e p pl a sma me t h o d,t h e dif f e r e nc e be t we e n t h e r e sul t s is wit h in 4U/mg.Key words:Anio n e xc h a nge;h e pa r in so dium;o ve r-sul f a t e d c h o ndr o it in sul t a t e(OSCS);de r ma t a n sul f a t e(DS);HPLC;h e pa r in so dium po t e nc y;a zur e A;dua l wa ve l e ngt h spe c t r o ph o t o me t r yIX浙江大学颂士学位论文目录目录致谢摘要VIABSTRACT.VTII第一章文献综述引言.11.1肝素的概述.11.L1肝素的结构特点.21.1.2肝素分类.31.1.2.1 普通(标准)肝素.31.1.2.2 低分子量肝素.41.1.23其它肝素.41.1.3 肝素的应用.51.1.4 肝素的理化性质.61.1.4.1 物理性质.61.1.4.2 化学性质.61.1.4.2.1 降解和水解反应.61.1.4.2.2 氧化反应.61.1.4.2.3 中和反应.71.1.4.2.4 酯化反应.71.1.5 肝素的抗凝机理.71.1.6 肝素类似物.71.1.6.1 硫酸皮肤素(DS).71.1.6.2 硫酸软骨素(CS).81.1.6.3 多硫酸软骨素(OSCS).81.1.63.1多硫酸软骨素的性质与结构.8浙江大学硕士学位论文目录1.1.6.3.2多硫酸软骨素的制备.91.1.6.4硫酸乙酰肝素(HS).91.2肝素的制备工艺.101.2.1 肝素钠的制备技术.101.2.1.1 粗品的制备技术.101.2.1.2 精品的制备技术.111.2.1.2.1 高锌酸钾和过氧化氢两步氧化法.111.2.1.2.2 过氧化氢分次加入的二次氧化法.121.2.1.23酹解结合氧化法.121.2.2低分子量肝素钠的制备技术.131.2.2.1 化学裂解法.131.2.2.1.1 亚硝酸降解法.131.2.2.1.2 过氧化氢降解法.131.2.2.1.3 叩消去降解法.141.2.2.1.4 其它化学降解法.141.2.2.1.5 化学降解法的优缺点.141.2,2.2 酶解法.151.3肝素钠的质量研究.151.3.1 肝素钠原料药质量标准比较.151.3.2 关键检测方法.151.3.2.1 动物来源的鉴别.1513.2.1.1降联免疫吸附法(ELISA).171.3.2.1.2,3C-NMR/SAX-HPLC 测定肝素钠的来源.1713.2.1.3 PCR 方法.1713.2.2病毒去除/灭活验证.171.3.2.2.1病毒选用.181.3.2.2.2病毒灭活与去除的方法.1813.2.2.3病毒滴度测定.181.3.2.2.4灭活/去除病毒效果的判定.18XI浙江大学硕士学位论文目录1.3.2.3多硫酸软骨素和硫酸皮肤素的测定.1813.2.3.1 核磁共振法(NMR).191.3.23.2 红外光谱法(IR).191.3.23.3 高效液相色谱法(HPLC).201.3.23.4 电化学法.2013.2.3.5 荧光检测法.2013.2.3.6 毛细管电泳法(CE).21.3.23.7 电泳法.221.3.2.4效价测定.221.3.2.4.1 肝素生物测定法.221.3.2.4.2 生色底物法.231.3.2.43天青A快速测定法.231.3.2.5双糖组成的分析.241.4 肝素钠事件.241.4.1 肝素钠事件的冲击.241.4.2 肝素钠事件的产业影响.251.5 肝素钠质量标准的提高.261.6 课题的研究背景及意义.261.7 研究思路.27第二章阴离子交换HPLC法精确测定肝素钠中的多硫酸软骨素和硫酸皮肤素 292.1 引言.292.2 实验材料及方法.302.2.1 实验材料.302.2.2 实验方法.302.2.2.1 肝素钠的离子交换HPLC分析方法.302.2.2.2 对照溶液的制备.30222.3供试溶液的制备.302.3结果与讨论.32XII浙江大学硕士学位论文目录2.3.1 五种HPLC分析方法的供试溶液、进样体积和检测波长的确立.322.3.2 五种HPLC分析方法实验结果的比较.32233新HPLC方法E的方法学验证.352.3.3.1洗脱梯度的确定.35233.2专属性.35233.3多硫酸软骨素和硫酸皮肤素的线性关系.3623.3.4系统适用性.37233.5多硫酸软骨素和硫酸皮肤素的检测限和定量限.372.336精密度.3923.3.7回收率（准确度）.3923.3.8耐用性.402.3.4方法应用.402.3.4.1 肝素钠的测定.4023.4.1.1肝 素钠粗品的测定.402.3.4.1.2 被OSCS污染的肝素钠粗品的测定.402.3.4.1,3 肝素钠原料药的测定.412.3.4.1.4 被多硫酸软骨素污染的肝素钠原料药的测定.422.3.4.1.5 肝素钠注射液的测定（辅料为氯化钠）.:.432.3.4.1.6 被OSCS污染的肝素钠注射液的测定（辅料为氮化钠）.432.3.4.1.7 肝素钠注射液的测；定（辅料为苯酚）.442.3.4.1.8 被OSCS污染的肝素钠注射液的测定（辅料为苯酚）.4523.4.2 低分子量肝素钠的测定.4523.4.2.1 LMWH原料药的测定.45234.2.2被 OSCS污染的LMWH原料药的测定.462.3.423 LMWH注射液的测定.4723.4.2.4 被OSCS污染的LMWH注射液的测定.4723.4.3 依诺肝素钠的测定.472.3.43.1 依诺肝素钠原料药的测定.4823.4.3.2 被OSCS污染的依诺肝素钠原料药的测定.48XIII浙江大学硕士学位论文目录23.4.3.3 依诺肝素钠注射液的测定.:.4923.4.3.4 被OSCS的依诺肝素钠注射液的测定.492.3.5 讨论.502.4本章小结.51第三章毛细管电泳、核磁共振和HPLC法测定肝素钠中的OSCS含量的比较研究.533.1 引言.533.2 实验材料与方法.533.2.】实验材料.533.2.1.1 CE和NMR所用实验材料.533.2.1.2 阴离子交换HPLC法所用实验材料.533.2.2实验方法.543.221肝素钠的毛细管电泳分析.543.2.2.2肝素钠的核磁共振氢谱分析.543.2.23肝素钠的离子交换HPLC分析.5433结果及讨论.553.3.1肝素钠的毛细管电泳分析.55331.】肝素钠原料药的测定.：.56331.2被OSCS污染的肝素钠原料药的测定.573.3.2肝素钠的核磁共振图谱.573.3.2.1肝素钠原料药的测定.5833.2.2 被OSCS污染的肝素钠原料药的测定.593.33肝素钠的高效液相色谱分析.593.3.3.1系统适用性溶液的测定.59333.2肝素钠的高效液相色谱图对比分析.603.4本章小结.61第四章 肝素钠效价的研究一天青A快速测定法.634.1 引言.63XIV浙江大学硕士学位论文目录4.2 实验材料与方法.644.2.1 实验材料与设备.644.2.1.1 实验材料.644.2.1.2 实验设备.644.2.2 实验方法.644.2.2.1 天青A改良双波长分光光度法.644.2.2.1.1 标准曲线制备.654.2.2.1.2 样品测定.654.2.2.1.3 计算.654.2.2.2 绵羊血浆法测定肝素钠效价.664.2.2.2.1 标准品溶液的制备.664.2.2.2.2 样品溶液的制备.664.2.2.23 测定方法.664.3 结果与讨论.674.3.1 天青A双波长分光光度法的方法学研究.674.3.1.1 标准曲线.674.3.1.2 方法的精密度.674.3.1.3 方法的准确度.684.3.2 本法测定结果与绵羊血浆法结果的比较.684.4 本章小结.695.1 结论.715.2 建议.71 72作者简介.78XV浙江大学硕士学位论文第一章文献综述第一章文献综述引言生化制药是指利用现代生物化学技术从生物体中分离、纯化、制备用于预防、治疗和诊断疾病的具有活性的“生化物质”的方法。生化药物主要包括氨基酸类药 物、多肽及蛋白质类药物、核酸类药物、酶类药物、多糖类药物和脂类药物等。糖胺聚糖(GAG)是多糖的一种，常见的GAG有透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(Ke p-S)、肝素(He pa r in,HP)及硫酸乙酰肝素(HS)6 种。肝素是1916年Ja y Mc l e a n在研究凝血机制时从狗的肝脏组织中发现的一种酸 性猫多糖3 Br inko us等证明了肝素具有抗凝血活性14 1935年，Mur r a y进行了 肝素的第一例临床试验，从此，肝素及相关产品作为抗凝药物得到广泛运用，至今仍广泛应用于临床。到目前为止还没有一种能够完全代替它的产品，所以它 仍然是最重要的抗凝血和抗血栓的生化药物之一，也是非常经典的生化药物之一。但是2008年2月爆发的“肝素钠事件”表明了已有药典标准对肝素钠药品质 量的监控存在明显漏洞，更进一步凸显了肝素钠质量控制的重要性。面对越来越 复杂的医药市场，提高已有药品的用药安全性和开发新的药物一样都具有非常重 要的经济价值和社会意义；同时开发新的方法检测研究肝素钠的污染物问题从而 提高药品质量和用药安全性也具有重要的科学技术价值。1.1 肝素的概述肝素(He pa r in,HP)首先从肝脏发现而得名，肝素广泛分布在哺乳动物的组织 中，如肝、肺、肠黏膜、心、脾、肾、胸腺、胎盘、肌肉和血液中都有存在网。各种组织中肝素的含量与肥大细胞的数目有关，肥大细胞内的颗粒含有肝素或肝 素前体，当物理或化学刺激使肥大细胞脱粒时，肝素被释放出来，在体内被肝脏 产生的肝素酶灭活而从尿排泄出来。肝素具有强抗凝作用，是防治深层静脉血 栓形成等血栓栓塞性疾病的首选药物。随着研究的深入，人们发现肝素不但有抗 凝、抗血栓形成和调整血脂的作用，还有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生 物学功能。肝素在体内多以与蛋白质结合以糖蛋白复合物的形式存在。这种复 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述合物没有抗凝血活性，但在去除蛋白质后，这种抗凝活性逐渐表现出来【叫由于 疯牛病的病原体肮粒是传染性蛋白质颗粒，为不含有核酸的感染性蛋白因子，其 主要成份是一种蛋白酶抗性蛋白，具有对蛋白前的抵抗力，易溶于去污剂、有致 病力和不诱发抗体等特性，给患病动物及人类的诊断和防治带来很大麻烦，给人 类和动物的健康和生命带来严重的威胁，因此从反刍动物中提取肝素钠存在较大 的安全性风险，现在药用肝素钠主要从猪小肠黏膜提取此1.1.1 肝素的结构特点肝素作为一种糖胺聚糖，是由糖醛酸（。-艾杜糖酷酸，Ido A和。-葡糖醛酸，Gl c A）和葡萄糖胺（小。-葡萄糖胺，GIc N）以及它们的衍生物（乙酰化、硫酸化）组 成的具有不同链长的多糖链混合物。肝素是由许多不同组分组成的非均一性的混 合物，未分级肝素（Unf r a c t io na t e d h e pa r in,UFH）的分子量为300030000 Da,平均 分子量约为12000-15000 Da。在肝素链中存在一种独特的五糖单位，与抗凝血酶 的相互作用，并通过它来产生功能。Ch o a y【等提出了一种高亲和肝素的结构模 型（如图1-1）。R=COCH?或 SOj n=5 m=20 图M.高亲和肝素的结构模型Fig 1-1.St r uc t ur e mo de l o f h q ja r in wit h h igh a f f init y在这个结构模型中，Ch o a y等把肝素分为三个区，各区有不同的结构和功能“叫第一区是五糖序列，GIcNHR-6-O-SO3-*G1cA-*GIcNSO3,6-di-0-OS03-*Ido A-2-OSO3-GIcNSO3-6-OSO3o该区具有较强的结合抗凝血酶II1（AT 1H）的 能力，它的生化特性主要包括三个方面：形成肝素-AT m复合物；诱导AT in构象发生改变；促进抗Xa活性，第二区是三硫酸双糖单位（Ido A-2-OSO3-GIcNSO3-6-OSO3）o该区对atm的结合力较弱，但与第一区形成一定序列后，2浙江大学硕上学位论文 第一章文献综述能促进抗Xa活性。这主要是由于肝素、AT Il l和Xa因子形成三元复合物，从而 增加Xa因子的灭活活性。第三区也是三硫酸双糖单位，该区对AT 111的结合力 较强，这主要是由于肝素、AT ID和IIa因子形成三元复合物，使AT HI能有效 地灭活凝血酶。因此至少要由18个单糖组成且含上述五糖单位的肝素链形成此复 合物。另外，Linda h l等用亚硝酸对肝素进行部分降解，在产物中发现一种对AT III具有高亲和性的最小寡糖片段八聚糖，在其第六个单糖上的N-S03基是结合 AT HI所必需的。五聚糖（八聚糖中的第2-6个片段）组成真正的AT结合区。这与 Ch o a y的结论是相同的。Ch a r uwa n】用肝素的把肝素降解成双糖单位，用HPLC分离。分析结果表明，凝血酶抑制活性高的肝素片段含有较多三硫酸双糖单位和二硫酸双糖单位，而一 硫酸双糖单位较少。Ro se nbe r g网通过对高活性和低活性分子量的肝素的研究指出：高活性的葡 萄糖醛酸含量较高，艾杜糖醛酸含量较低。肝素中的某些基团对其抗凝活性影响较大，肝素在酸性溶液中，N-硫酸基 容易被水解破坏，其抗凝活性降低；肝素碱性溶液中，。-硫酸基易被水解破坏，其抗凝活性降低，所以在肝素生产过程中要避免强酸或强碱的处理。1.1.2 肝素分类1.121普通（标准）肝素普通肝素是由猪或牛黏膜提取，平均分子量为12000-15000 Da,相当稳定。一般产品为其钠盐或钙盐。（1）肝素钠是由猪或牛的肠密膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属黏多糖 类物质。通过激活抗凝血酶in（AT-in）而发挥抗凝作用。它对凝血过程的三个阶 段均有影响，在体内外均有抗凝作用，可延长凝血时间、凝血酶原时间和凝血酶 时间。口服不吸收，皮下、肌肉或静脉给药均吸收良好。（2）肝素钙与肝素钠作用相似，但肝素钙皮F注射后不减少细胞间毛细血管的钙胶质，也不改变血管通透性，基本上克服了肝素钠皮下注射易致出血的副作 用。肝素钙还有明显的抗肾素和抗醛固酮的活性。3浙江大学硕士学位论文第一尊文献统述1.1.2.2 低分子量肝素低分子量肝素(Lo w-mo】e c ul a r-we igh t h e pa r in,LMWH)是一类以未分级肝素 为起始物料经过分级或降解而得到的具有较低分子量的低聚糖混合物,它具有抗 Xa活性，可抑制体内、体外血栓和动静脉血栓的形成，但不影响血小板聚集和 纤维蛋白原与血小板的结合。与普通肝素比较，其半衰期较长，抗血栓效果好，而抗凝出血倾向较弱，有取代普通肝素的趋势，英国药典1993版开始收载了这类品种的通则要求：重均分子量在8000 Da 以下，小于8000 Da的级分不少于60%；抗Xa因子与抗Il a因子活性比不小于 1.5随着不同生产工艺的应用，各工艺产品体现出各自的特点，如存在着不同 的末端结构、分子量及其分布、抗Xa因子活性、抗Ha因子活性、抗Xa因子与 抗Ha因子活性比等，其药理作用和临床适应症也有所不同。EP7.0和BP2010 收载了 5种不同工艺的LMWH,分别是达肝素钠(Da l t e pa r in so dium)、依诺肝素 钠(Eno xa pa r in so dium)、那曲肝素钙(Na dr o pa r in c a l c ium)、帕肝素钠(Pa ma pa r in so dium)和汀肝素钠(Tinza pa r in so dium,又名汀扎肝素)。其结构特点与制备工艺 见表1-101.1.2.3 其它肝素目前正在深入研究的肝素制剂中还有低抗凝活性肝素、改构型肝素、类肝素 等，这些药物特点是具有低抗凝、高抗栓、作用时间长和出血作用少的优点，很 有开发前途。浙江大学硕士学位论文第一章文献综述表1-1.BP2010收载的五种低分子量肝素的比较Ta bl e 1-1,Co mpa r iso n o f f ive l o w-mo l e c ul a r-we igh t h e pa r ins in BP2010质量指标达肝素钠那曲肝素钙依诺肝素钠柏肝素钠汀肝素钠也均分子量5600-64003600-50003800-50004000.60005500-7500(Da)(6000)(4300)(4500)(5000)(6500)3000:2000:2000:3000:2000:13.0%;15%;12.2-20.0%；30%;8000:2000-8000:2000-8000：3000-8000:2000-8000:15.0%-25.0%75%-95%;68 够 82.0%5Wi-60%60%-72%;2000-4000:8000：35 怯 55%22.0%-36.0%抗Xa效价(IU/mg)110-210951309c M 2575-11070720抗】l a效价(IU/mg)3510095-130A X a/A II a1.93.22.5-4.03.35.31.53.01.52.5非还原末端20-硫酸-qL艾杜糖醛酸2-0-硫酸-a-L-文杜糖酸酸4-健醇式毗喃 糖酸酸盐(酯)2-0-硫酸 v-L文杜糖酸酸2-0-硫酸4烯醇式喉喃糖酸酸还原末端6-0-藐酸-2,5-脱水-D-甘露爵&O-硫酸25-脱水-D-甘露醇15%-25%的蛆 分含有1,6-脱 水结构2-N,6X)-二硫酸-D-氨基葡1糠2-N,69-二硫酸-D氨基葡曲糖硫酸化程度(双糖单位)2.02.5222.02.61.8-2.5降解方法亚硝酸降解亚硝酸降解卞晶裂解过氧化物降解肝素的降解1.13肝素的应用临床上最初应用的肝素称为普通肝素或标准肝素(Unf ia c t io na t e d h e pa r in)。标 准肝素主要用于治疗各种原因引起的弥漫性血管内凝血，以及血液透析、体外循 环、导管术、微血管手术等操作中及某些血液标本或器械的抗凝处理等。临床应 用及研究显示，标准肝素除具有抗凝血作用外，还具有其他多种生物活性和临床 用途，包括降血脂作用、抗中膜平滑肌细胞(SMC)增生、促进纤维蛋白溶解等作 用，还可以治疗冻疮、静脉曲张、神经性皮炎、浅表性静脉炎等多种常见症状。5浙江大学硕士学位论文第一章文献综述肝素的临床应用进展随着人们对肝素生物化学和药理作用的深入研究不断 被发掘，如抗炎、抗过敏、降血脂及抗动脉粥样硬化、扩张冠脉、缓解支气管痉 挛、抑制单纯疱疹病毒活性、抗肿瘤转移以及诱导干扰素的产生等等。另外，陆 续发现肝素在血液系统疾病、心脏病、体外循环手术、血液净化疗法、显微外科、肺内科、肾病、产科、儿科、眼科等12个大的临床学的40余种疾病的治疗中都 发挥了较好的医疗作用，而且这样的研究还远没有结束，肝素完全可能衍生成为 治疗更多疾病的药物。因此，这些显示出来的许多新的临床用途及功效，受到了日益广泛的关注。1.1.4肝素的理化性质1.1.4.1 物理性质肝素为白色或灰白色粉末，无臭无味，有吸湿性，肝素或其钠盐易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。肝素游离酸在乙酸中有一定溶解性；肝素的分子是趋于螺旋形的纤维状分子，维持这种分子形状的关键是分子内 氢犍和疏水键等，与其它黏多糖相比，其特性黏度较小。这种结构与肝素的抗凝 活性密切相关，结构被破坏则抗凝活性丧失“支肝素在波长185220nm有特征吸收峰，在230300nm无光吸收。在红外890 c m,940 c m“有特征吸收峰,测定1210 c m/l 150 c m的吸收强度，可作快速 测定用1.1.4.2 化学性质1.1.4.2.1 降解和水解反应肝素的糖昔键可以被亚硝酸、肝素酶、过氨化物以及高磷酸等降解，从而制 得低分子量肝素(LMWH)。肝素分子上的M硫酸基对酸水解敏感，肝素在温热 的稀酸中会失活，温度越高，pH值越低，失活越快。在碱性条件下，N-硫酸基 相当稳定，但艾杜糖醛酸上的2-0-硫酸基可被水解，从而也会使其失去活性。1.14.2.2氧化36浙江大学硕士学位论文第一克文献徐述肝素与氧化剂反应可被降解成酸性产物。使用氧化剂进行纯化时，i般会影 响肝素的收率，在使用氧化法纯化肝素过程中，为避免肝素失活，往往加入亚硫 酸氢钠作为保护剂。还原剂的存在基本不影响肝素的活性。1.1.4.23中和反应肝素呈酸性，其聚阴离子能与各种阳离子反应生成盐。这些阳离子包括金属 离子、碱性染料、阳离子表面活性剂和蛋白质等。例如，有机碱有十五烷基澳化 毗咤(PPB)、十六烷基氯化毗咤(CPC)、番木鳖碱等；碱性染料有天青A等；长 链季铉盐有十六烷基三甲基澳化铉(CTAB)等。1.1.4.2.4酯化反应肝素结构中的N-硫酸基与抗凝血作用有密切关系，如遭到破坏其抗凝血活 性降低，肝素分子中的游离羟基可以酯化，如经硫酸化则抗凝血活性下降。高度 乙酰化的肝素抗凝活性降低，而降酯活性不变。1.1.5 肝素的抗凝机理肝素是一种由硫酸D-葡萄糖胺和0-葡萄糖醛酸组成的黏多糖，含多个硫酸 根，硫酸根约占分子量的40%,因而带有许多负电荷，这种高度带负电的物理化 学特性，干扰了血凝过程的许多环节。肝素的阴离子活性基团与抗凝血酶m(AT-m)的阳离子基团结合，加速抗凝血酶-凝血酶复合体形成，因此产生抗凝效 应。此外肝素还有催化抑制凝血因子x的功能。1.1.6 肝素类似物肝素的类似物主要包括硫酸软骨素(Ch o ndr o it in sul f o t e,CS)、硫酸皮肤素(De r ma t a n sul f a t e,DS)、硫酸乙酰肝素(He pa r a n sul f a t e,HS)和多硫酸软骨素(Ove r-sul f a t e d c h o ndr o int in sul f a t e,OSCS)等。1.1.6.1 硫酸皮肤素(DS)7浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述硫酸皮肤素(De r ma t a n sul f a t e,DS)为肝素的生产过程产生的杂质。它是由糖 醛酸(葡糖醛酸Gl c A/艾杜糖醛酸Ido A)、N-乙酰氨基半乳糖(Ga l NAc)及不同含量 硫酸基组成。DS是一种天然的糖胺聚糖，广泛分布于动物组织中，有抗血栓作用，但不 同于肝素，它不依赖血浆AT ID,而是通过肝素辅因子(He pa r in c o f a c t o r II.HC II),催化抑制凝血酶，其出血副作用小，是近年来国外日益重视的新型抗凝血 药区巴1.1.6.2 硫酸软骨素(CS)硫酸软骨素是软骨素(Ch o ndr o it in,Ch)的不同位置硫酸基取代产物，是由糖 醛酸(葡糖醛酸Gl c A/艾杜糖醛酸Ido A)、2乙酰氨基半乳糖(Ga l NAc)及不同含量 硫酸基组成。根据CS的结构特点，通常将天然来源的CS分为A,B,C,D,E,F,H,K,L和M等叽此外，采用化学方法对其进行过硫酸化修饰，可得到多硫酸软骨 素(OSCS)。1.1.6.3 多硫酸软骨素(OSCS)1.1.6.3.1 多硫酸软骨素的性质与结构OSCS为化学合成污染物，是由CS经过硫酸化修饰后的半合成产物。OSCS 的抗凝活性高于CS12。)，但不具备肝素钠所具有的抗Xa因子活性】。OSCS的结 构、电荷密度、分子量、抗凝活性均与肝素(He pa r m,HP)相似卬】，因此在肝素钠 中发现OSCS较为不易。图1-2列举了OSCS、DS与肝素钠的结构组成。图1-2.a:多硫酸软骨素：R为SO2H；b为硫酸皮肤素-b：c:肝素钠Fig 1-2.a:OSCS;Rm：SO?H;b:DS 一b;c:He pa r in So dium8浙江大学硕士学位论文第一章文献综述1.1.6.3.2 多硫酸软骨素的制备(1)OSCS粗品制备根据专利I网报道，对硫酸软骨素进行磺化可得到OSCS,流程见图1-3。甲酰胺溶解 氯碱酸磺化 无水乙醇沉淀 pH9.5除锈 pH7.0乙醉沉淀CS k溶液 k 沉淀OSCS图1-3.CS的硬化流程图FigI-3.Sc h e me o f c h o ndr o it in sul f a t e sul f o na t io nOSCS脱盐纯化1)超滤脱盐由于OSCS粗品制备过程中引入较多的Na Cl,故需要将粗品进行脱盐纯化,本步骤采用超漉方法除去盐杂质123流程图如图1-4。淋洗 超滤 清洗 保存粗品-淋洗液-OSCS无盐溶液-l OOODa IMNa OH,25 C,超滤膜 去离子水 3%的甲醛OSCS保存溶液图14 OSCS超滤脱盐流程图Figl-4.Sc h e me o f OSCS by ul t r a f il t r a t io n2)OSCS冻干将OSCS无盐溶液45 C旋转蒸发浓缩至较浓黄色液体后，用0.45 微孔 滤膜过滤，置于厚玻璃瓶中，用锡箔纸封口，纸上用针扎出密集小孔，置于-80C 冰箱预冻。于-50 Q温度、6.5真空度下冷冻干燥4天。1.1.6.4硫酸乙酰肝素(HS)浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述硫酸乙酰肝素，又称硫酸类肝素，是一种N-硫酸化