丛枝菌根真菌和根瘤菌对白三叶氮同化的影响.pdf

.():/.:./.吴会会 刘瑞成 江道菊 等.丛枝菌根真菌和根瘤菌对白三叶氮同化的影响.广西植物():.():.丛枝菌根真菌和根瘤菌对白三叶氮同化的影响吴会会 刘瑞成 江道菊 谢苗苗 邹英宁(.长江大学 园艺园林学院 湖北 荆州 .荆州市自然资源和规划局沙市区分局 湖北 荆州 )摘 要:为揭示丛枝菌根真菌()和根瘤菌在白三叶氮()同化中的作用该研究对白三叶进行单一或联合接种隐类球囊霉()和三叶草根瘤菌()分析其对白三叶的生长、光合作用、叶片 和氨基酸含量以及 同化相关酶活性的影响 结果表明:()单一接种 或根瘤菌以及联合接种 和根瘤菌均显著增加了白三叶的株高、匍匐茎长度、叶片数、地上部生物量、总生物量、叶绿素 和总叶绿素含量、稳态光量子效率和叶片 含量这种增强效应是联合接种单一 单一根瘤菌未接种处理()联合接种 和根瘤菌显著增加了白三叶叶片中丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和组氨酸的含量显著提升了叶片 同化相关酶如硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸脱氢酶、天冬酰胺合成酶和天冬氨酸转氨酶的活性显著促进 对白三叶根系的侵染 综上认为联合接种 和根瘤菌通过激活 同化相关酶活性有效促进 同化产生更多氨基酸进一步促进白三叶植株生长联合接种 和根瘤菌具有协同作用有效促进了白三叶的 同化关键词:丛枝菌根真菌 根瘤菌 白三叶 氮()同化 氨基酸中图分类号:文献标识码:文章编号:()(.):()()().().:()收稿日期:基金项目:湖北省农业科技创新行动项目(鄂农发 号)第一作者:吴会会()博士实验师主要从事植物菌根生理研究().通信作者:邹英宁教授主要从事植物菌根生物技术研究().().:()()丛枝菌根真菌()是土壤中广泛存在的有益真菌与植物共生后在根系表面形成根外菌丝促进植物对氮()、磷()等元素的吸收 帮助宿主植物吸收土壤中不同形态的 素铵态氮()是 根外菌丝主要的吸收形式(.)增加宿主植物游离氨基酸等氮源的积累其菌丝对植物 的贡献率达 (张良和杨春雪)因此 对宿主植物 的吸收至关重要 根瘤菌()是土壤中常见的革兰氏阴性细菌在豆科作物根毛中定殖形成根瘤从而建立共生体系进行生物固氮 帮助植物获取 ()等()研究表明与单一接种相比联合接种 和根瘤菌更能促进豆科作物生物固氮提高 的水平同时提高土壤铀清除率呈现出更高的植物修复效率 而 和根瘤菌联合接种则抑制了豌豆和绿豆对 的吸收(.)上述研究结果表明 和根瘤菌联合接种对宿主 的吸收是非常复杂的尚需要进一步研究特别是两者结合能否促进豆科作物如白三叶()的 同化目前还不清楚植株从土壤中获取的主要是硝态氮()和铵态氮()等无机氮只有将这些无机氮同化成如氨基酸、蛋白质等有机氮后才能为植物所利用而同化过程需要多种酶的参与 植物吸收的在硝酸还原酶()作用下首先被还原成亚硝态氮()之后在亚硝酸还原酶()作用下转化为(.)在谷氨酰胺合成酶()和 的共同作用下生成谷氨酰胺()再通过谷氨酸合成酶()催化成谷氨酸()通过/途径同化生成有 机 氮 此 途 径 同 化 植 株 内 量 达()谷氨酸脱氢酶()是/途径的补充途径只有当植株中 浓 度 过 高 时 才 进 行 作 用 催 化 合 成()而天冬氨酸转氨酶()和丙氨酸转氨酶()是将/途径形成的 转化成天冬氨酸()和丙氨酸()天冬酰胺()是植株韧皮部运输的主要有机 形式之一其合成受天冬酰胺合成酶()的影响(薛迎斌)目前还不清楚 和根瘤菌联合接种对宿主 同化产物水平的影响白三叶为多年生豆科牧草对根瘤菌和 有良好亲和性具有匍匐生长、扩张能力强、再生速度快和粗蛋白含量较高等特点是绿地建设的主要草种也是廉价优质的牧草(赵桂琴等)本研究通过对白三叶进行单一或联合接种 和根瘤菌分析其对白三叶生长、光合作用、含量、氨基酸组分及 同化相关酶活性的影响材料与方法.试验材料白三叶种子购自湖北省种子站 根据 等广 西 植 物 卷()的前期研究结果选用 菌种为隐类球囊霉()由中国丛枝菌根真菌种质资源库()提供经白三叶盆栽扩繁 个月后由长江大学根系生物学研究所通过孢子密度测定确定每克 菌种内含 个孢子 供试三叶草根瘤菌()由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供经酵母甘露醇液体培养基活化、单菌落培养 挑取单菌落置于 液体培养基中在 、下培养 取 菌液置于 液体培养基中在 、下继续培养 随后 离心 弃上清液用无菌水制菌悬液至浓度为.(为.)栽培基质为土和沙比例为/(/)经过高温灭菌(.)使沙和土中的土著真菌孢子失活 试验用土采自长江大学落叶果树基地试验用沙为直径 的河沙 试验用塑料盆的规格为上口径 、下口径 、高 装.基质.试验设计共 设 置 个 处 理 分 别 为 未 接 种 对 照()、接种根瘤菌()、接种()、联合接种 和根瘤菌()每个处理有 个重复随机排列共 盆.植物培养在将白三叶播种前用 乙醇和.次氯酸钠分别对种子进行表面消毒 用无菌水清洗 次之后按照 粒种子/盆播种在装有栽培基质的塑料盆中 周后间苗至 棵/盆 播种的时候进行接种处理其中单接种根瘤菌处理是每盆接种 三叶草根瘤菌菌悬液并且所播种子预先在三叶草根瘤菌菌悬液浸泡 单接种 处理是将 隐类球囊霉菌种混于栽培基质中联合接种 和根瘤菌处理是将 隐类球囊霉菌种混于栽培基质并且所播种子预先在三叶草根瘤菌菌悬液浸泡 之后将 三叶草根瘤菌菌悬液接种到栽培基质中未接种对照是混入等量灭菌的隐类球囊霉菌种和三叶草根瘤菌菌悬液并且种子同样浸泡在灭菌后的三叶草根瘤菌菌悬液中 处理后的植物生长在一个环境可控的生长室内培养光照强度为 温度为 /(白天/黑夜)空气相对湿度为 定期更换塑料盆位置以避免环境差异影响试验结果 植物培养期间未添加其他养分每日:浇水 培养 周后结束试验.植株生长及生理指标测定收获时植株分成地上部与地下部人工测定生长指标即植株株高、叶片数、匍匐茎长度和生物量 采用 叶绿素荧光成像仪进行活体测定叶绿素荧光参数根系 菌 根 真 菌 侵 染 测 定 采 取 和()的方法菌根真菌侵染率为 侵染的根段长度与观察的总根段长度的百分比 叶绿素含量测定采用王学奎()的方法 叶片 含量测定将叶片消化后采用间断化学分析仪()分析 叶片氨基酸组分经过乙腈 水 超 声 提 取、离 心 和 微 孔 滤 膜 过 滤(.)之后在高效液相色谱 质 谱 联 用(和 质谱仪)上分析叶片硝酸还原酶活性测定采用磺胺比色法(.)亚硝酸还原酶活性测定参照 等()的方法 谷氨酸合成酶测定依据 和()的方法 采用刘淑云等()的方法测定谷氨酸脱氢酶活性 天冬酰胺合成酶活性测定参照 等()的方法丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶活性测定依据梁成刚等()的方法 谷氨酰胺合成酶测定参照 等()的方法稍作修改即称取.新鲜样品加入 缓冲液(.、二硫苏糖醇和 蔗糖)研磨成浆下 离心 取.上清液加入.反应液(、谷氨酸盐和 半胱氨酸)以及.溶液混匀后置于 下保温 加入 显色剂(.三氯乙酸、.和.)摇匀显色 后于 离心 后取其上清液在 下测定吸光值.数据统计分析使用 软件(.)(.)进行方差分析采用邓肯新复极差法进行多重比较 期吴会会等:丛枝菌根真菌和根瘤菌对白三叶氮同化的影响结果与分析.单一或联合接种 和根瘤菌对 侵染白三叶根系的影响未接种 的植株根系未发现菌根真菌侵染而接种 的植株根系可见菌根结构(图)其中单接种 的白三叶菌根真菌侵染率为(.)联合接种 和根瘤菌的植株根系菌根真菌侵染率为(.)表明接种根瘤菌促进了 对白三叶根系的侵染.单一或联合接种 和根瘤菌对白三叶生长的影响接种处理均促进了白三叶的生长(表)与不接种对照相比单接种根瘤菌显著提高了株高、匍匐茎长度、叶片数、地上部生物量以及总生物量分别提高了.、.、.、.和.而对地下部生物量无显著影响单接种 与联合接种 和根瘤菌均显著提高了白三叶的株高、匍匐茎长度、叶片数、地上部生物量、地下部生物量和总生物量单接种 分别提高了.、.、.、.、.和.联合 接 种 和 根 瘤 菌 分 别 提 高 了.、.、.、.、.和.可见联合接种对植株生长的促进作用明显优于单接种单接种 对植株生长的促进效果在叶片数和生物量上要优于单接种根瘤菌.单一或联合接种 和根瘤菌对白三叶叶绿素含量的影响如图 所示与不接种处理相比单接种根瘤菌处理显著提高了叶绿素 和总叶绿素含量分别提高了.和.而对叶绿素 无显著影响 单接种 与联合接种 和根瘤菌均显著提高了叶绿素、叶绿素 和总叶绿素的含量单接种 分别提高了.、.、.联合接 种 和 根 瘤 菌 分 别 提 高 了.、.、.可见联合接种对叶绿素含量的促进效应明显优于单接种根瘤菌或.单一或联合接种 和根瘤菌对白三叶叶绿素荧光参数的影响由图:可知与不接种对照相比单接种 或根瘤菌对叶片最大光量子效率()均无显著影响而联合接种 和根瘤菌的处理中 显著提高了.可见单接种根瘤菌、单接种 与联合接种 和根瘤菌均显著提高了叶片稳态光量子效率()显著降低了叶片稳态非光化荧光淬灭().单一或联合接种 和根瘤菌对白三叶叶片 含量的影响与不接种相比单接种根瘤菌、单接种 以及联合接种 和根瘤菌的白三叶叶片 含量分别显著提高了.、.和.(图)可见联合接种对叶片 含量的增强效果要显著高于单一接种根瘤菌或.单一或联合接种 和根瘤菌对白三叶叶片氨基酸含量的影响与未接种相比单接种根瘤菌显著提高了叶片的、含量分别提高了.、.显著降低了 含量(降低了.)而对、和 含量无显著影响单接种 以及联合接种 和根瘤菌均显著提高了白三叶叶片的、含量单接种 分 别 提 高 了.、.、.、.、.、.、.联合接种 和根瘤 菌 分 别 提 高 了.、.、.、.、.、.、.均显著降低了 含量分别降低了.、.(表)可见联合接种 和根瘤菌对白三叶叶片氨基酸含量的促进效果更显著.单一或联合接种 和根瘤菌对白三叶叶片 同化相关酶活性的影响与未接种处理相比单接种根瘤菌显著提高了叶片的、活性分别提高.、.、.、.、.单接种 显著提高了叶片的、活性分别提高了.、.、.、.、.、.联合接种 和根瘤菌处理显著提高了叶片的、活性分别提高了.、.、.、.、.、.、.(表)可见联合接种对 同化相关酶活性的提升效果要明显高于单一接种讨论与结论本研究中 根瘤菌的接种显著促进了 对广 西 植 物 卷图 对白三叶草根系的侵染.白三叶根系的侵染表明根瘤菌引入有利于根系丛枝菌根的形成其原因是根瘤菌通过固氮满足 对 的需求有利于根系 的建立()此外根瘤菌提高了豆科植物体内的 水平为了其维持体内 和 的平衡豆科植物的固 效率在很大程度上取决于 的供应而 有利于促进植株对 的吸收 因此豆科植物会提供给 足够多的 供应促进根系菌根的形成(.)进而有利于 的吸收本研究中联合接种 和根瘤菌对白三叶生长的促进效果显著高于单一接种 表明 和表 单一或联合接种 和根瘤菌对白三叶生长的影响 ()处理株高()匍匐茎长度()叶片数 生物量 ()地上部 地下部 总 未接种对照.接种根瘤菌 .接种 .接种 和根瘤菌 .注:同一列不同字母表示差异显著(.).根瘤菌.丛枝菌根真菌 下同:(.).不同字母表示处理间差异显著(.)(.).图 单一或联合接种 和根瘤菌对白三叶叶绿素、叶绿素 和总叶绿素含量的影响.()根瘤菌产生了协同效应共同促进植物生长这与 和()在蚕豆上的研究结果一致 根瘤菌和 对白三叶生长的协同作用原因是根瘤菌的引入既促进了植株固 效率和固 总量又促进了白三叶根系中 的侵染率促使白三叶植株根系和 的生长更好进一步扩大植株根系和根外菌丝对水分和养分的吸收面积本研究中单一接种 和根瘤菌均显著增加了叶绿素 及总叶绿素的含量并且联合接种 和根瘤菌进一步增强了这种效应 此外联合接种的白三叶植株的 和 参数显著高于未接种植株而 参数显著低于未接种植株 和 是光合性能的敏感指标 是过多的激发能以热能形式散发的参数(黄小辉等)联合接种 和根瘤菌一方面提高植株叶片光能转化的效率以及反应中心电子传递活性 另一方面抑制植株光能 期吴会会等:丛枝菌根真菌和根瘤菌对白三叶氮同化的影响.最大光量子效率.稳态光量子效率.稳态非光化荧光淬灭.未接种对照.接种根瘤菌.接种 .接种 和根瘤菌.图 单一或联合接种 和根瘤菌对白三叶叶绿素荧光参数的影响.()广 西 植 物 卷图 单一或联合接种 和根瘤菌对白三叶叶片 含量的影响.()以热量散失保障了白三叶植株光合产物最大效率的积累 因此联合接种 和根瘤菌的植株拥有较高的光合能力而植株积累大量的光合产物为植物根系、和根瘤菌生长提供了保障本研究中单接种根瘤菌或 均显著增加白三叶叶片 含量联合接种植株叶片 含量显著高于单接种 事实上豆科植物的固 效率与 的供应密切相关 是根瘤菌固 反应所需 酶合成的重要元素 豆科植物根瘤的形成也需要而 庞大的根外菌丝结构有利于 的获取因此 在根瘤菌与植株建立友好共生过程中提供根瘤形成所需的 共同提高植株共生固氮水平(.)是 菌丝中氨基酸运输的主要类型其含量占菌丝氨基酸总量的(金海如)因此 对菌根 的转移起到重要作用 本研究证实接种 显著提高了表 单一或联合接种 和根瘤菌对白三叶叶片氨基酸含量的影响(单位:)()(:)氨基酸 未接种对照接种根瘤菌 接种 接种 和根瘤菌 丙氨酸.精氨酸.天冬酰胺.天冬氨酸.谷氨酰胺.谷氨酸.组氨酸.鸟氨酸.注:同一行不同字母表示差异显著(.):(.).含量 是生成信使分子如多胺的前体可以促进细胞分裂(杨洪强和高华军)联合接种植株中的 含量显著高于单接种和未接种的植株这与刁亚南等()在绿豆上接种 真菌和根瘤菌的结果一致 这表明 和根瘤菌的协同作用显著增加了 含量共同促进植株地上部细胞分裂进一步促进植株生长 是根瘤向共生植株输送 化合物的主要形式(薛迎斌)因此单接种根瘤菌比单接种 更加显著提高 的含量联合接种 和根瘤处理具有协同作用显著提高了白三叶叶片氨基酸的含量说明此处理方式有利于促进 的同化本研究中接种 显著增加白三叶叶片 和 的活性而接种根瘤菌对 和 的活性无影响表明 接种有利于白三叶由 向转变这与田超等()在苜蓿上的研究结果一致 此外联合接种根瘤菌和 的处理进一步增强了单一接种 对 和 活性的刺激效果表明两种微生物协同地增强了菌根植物叶片 向 转变的速率 单一或联合接种 期吴会会等:丛枝菌根真菌和根瘤菌对白三叶氮同化的影响表 单一或联合接种 和根瘤菌对白三叶叶片 同化相关酶活性的影响 ()同化相关酶活性 未接种对照接种根瘤菌 接种 接种 和根瘤菌 硝酸还原酶().亚硝酸还原酶().谷氨酰胺合成酶().谷氨酸合成酶().谷氨酸脱氢酶().天冬酰胺合成酶().天冬氨酸转氨酶().丙氨酸转氨酶().根瘤菌和 均提高了白三叶叶片的、活性这说明单一或联合接种根瘤菌和 通过调控/和 途径中的酶活性不同程度地促进 同化合成氨基酸其中联合接种的作用效果更明显而接种根瘤菌在促进 转化为 上比接种 效果显著 本研究中单一和联合接种根瘤菌和 均显著促进白三叶叶片的 和 活性从而促进 和 的积累 这表明联合接种 和根瘤菌有效地激活了 同化相关酶的活性提升了生成氨基酸的含量联合接种 和根瘤菌具有协同效应有效促进白三叶的植株生长、显著提高植株光合作用水平、叶片 含量同时显著增加了白三叶叶片中丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和组氨酸的含量显著提升了叶片 同化相关酶如硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸脱氢酶、天冬酰胺合成酶和天冬氨酸转氨酶的活性并显著促进 对白三叶根系的侵染 这说明 和根瘤菌的协同作用有效地促进了白三叶的 同化参考文献:.():.():.():.刁亚南 赵腊梅 金海如.镉胁迫下豆科植物接种 真菌和根瘤菌的生长及生理指标变化.贵州农业科学():.:.():.():.().()():.黄小辉 吴焦焦 王玉书 等.不同供氮水平的核桃幼苗生长及叶绿素荧光特性.南京林业大学学报(自然科学版)():.():.():.金海如.丛枝菌根菌丝精氨广 西 植 物 卷酸双向运转并分解为鸟氨酸.中国科学:辑():.():.梁成刚 张青 李敬 等.水稻灌浆期高温对天冬氨酸代谢酶活性及其家族氨基酸含量的影响.中国水稻科学():.():.().():.刘淑云 董树亭 赵秉强 等.长期施肥对夏玉米叶片氮代谢关键酶活性的影响.作物学报():.():.():.():.():.:.().():.(.).():.():.().():.(.).():.():.田超 李倩 许庆芳 等.矿区土接种 和根瘤菌对紫花苜蓿及土壤氮磷的影响.山西农业科学():.:.王学奎.植物生理生化实 验 原 理 和 技 术 .北 京:高 等 教 育 出 版社:.():.:.:.():.:.薛迎斌.大豆根瘤缺磷响应基因的表达谱及 调控根瘤生长的研究.广州:华南农业大学:.():.杨洪强 高华军.植物精氨酸及其代谢产物的生理功能.植物生理与分子生物学学报():.():.张良 杨春雪.盐碱胁迫对星星草丛枝菌根真菌共生体酶活性及游离氨基酸的影响.东北林业大学学报():.():.赵桂琴 王锁民 任继周.白三叶转基因及其生态适应性研究进展.生态学报():.(责任编辑 蒋巧媛 王登惠)期吴会会等:丛枝菌根真菌和根瘤菌对白三叶氮同化的影响