miR-375调控RWDD3参与脑胶质母细胞瘤U251细胞增殖的机制研究.pdf

作者单位 福建中医药大学附属第二人民医院 病理科福州 福建作者简介 程焰红()女初级病理技师大学通信作者 魏霖 :.:./.论著 调控 参与脑胶质母细胞瘤 细胞增殖的机制研究程焰红魏霖钟国栋李颜摘要目的:探讨 调控 参与脑胶质母细胞瘤 细胞增殖的作用机制 方法:采用 技术检测正常脑组织及脑胶质瘤组织中 和 的表达 以人脑胶质母细胞瘤细胞 为研究对象设立对照组和相应的 组空载体组和 过表达组分别过表达 及 蛋白利用 及细胞划痕实验检测 或 过表达对 细胞增殖和迁移能力的影响 在 组中利用 及 免疫印迹法检测脑胶质母细胞瘤 细胞中 及蛋白水平的变化在 联合 组细胞中共转 和 质粒观察 是否可以恢复 对脑胶质母细胞瘤 的抑制作用 结果:高级别胶质瘤组织中 的表达水平低于正常和低级别胶质瘤组织而 的表达水平高于正常和低级别胶质瘤组织差异均有统计学意义()及细胞划痕实验结果显示与对照组比较 可抑制脑胶质瘤细胞的增殖和迁移能力与空质粒组比较 可促进脑胶质瘤细胞的增殖和迁移能力 及 结果表明在 联合 组中水平升高可有效抑制 及蛋白水平的表达共转染 及 后 可恢复由 抑制的脑胶质瘤细胞增殖和迁移能力 结论:在胶质瘤组织中表达水平降低而 的表达水平升高 表达下调可以促进 的表达进而促进对脑胶质母细胞瘤 细胞的增殖和迁移能力关键词 脑胶质瘤 增殖 迁移中图分类号 文献标识码 文章编号()()【】:.:.:.:.【】脑胶质瘤为一种常见的中枢神经系统原发性肿瘤发病率占全身恶性肿瘤的 虽然手术切除联合术后放化疗的综合治疗手段已经取得长足进步但脑胶质瘤细胞较强的增殖和迁移能力的特点使此类患者治疗效果不佳 因此深入了解脑胶质瘤增殖、迁移的分子机制有助于为脑胶质瘤的治疗提供理论基础 在内的多种分子可参与调控肿瘤细胞的增殖、侵袭等诸多病理性行为淮海医药 年 月 第 卷 第 期 中多种 可通过逆调控一些关键基因或者信号通路的表达来抑制肿瘤的发生发展 研究表明在乳腺癌、肝癌及胃癌等多种肿瘤组织中 均呈现出差异性的表达 等研究发现 在脑胶质瘤组织中表达水平显著降低且与患者的预后有关即 的低表达可促进脑胶质瘤的发生发展 是 结构小泛素化增强子最初在垂体瘤细胞中发现 等研究表明 在脑胶质瘤组织中表达水平明显升高且与肿瘤恶性程度和预后密切相关考虑到 在脑胶质瘤发生发展中的重要作用并且 及 在脑胶质瘤中均呈现差异性表达 因此 有可能是通过调控 的表达来对肿瘤的发生发展起调控作用鉴于此本研究通过检测 靶向调控 对脑胶质瘤细胞增殖和迁移能力的影响探究其在脑胶质瘤中的潜在作用 材料及方法.脑胶质瘤标本本研究经我院医学伦理委员会审批同意 例脑胶质瘤标本来源于 年 月 年 月我院神经外科经手术切除后组织病理学检查证实为恶性胶质瘤的患者所有患者术前均未接受放化疗及其他免疫治疗 根据 年 中枢神经系统肿瘤分类修订版的标准对肿瘤组织进行分级其中级(毛细胞星型细胞瘤)例、级(弥散性星型细胞瘤)例、级(间变星型细胞瘤)例、级(胶质母细胞瘤)例、级为低恶性度组、级为高恶性度组 正常脑组织取自脑外伤患者颅内减压术后切除的部分组织共 例 标本采集后立即置于冻存管中液氮保存.细胞及试剂盒 人脑胶质母细胞瘤细胞购自美国 细胞库 及相应阴性对照()购买自中国广州锐博生物科技公司过表达质粒 及相应阴性对照()购买自中国苏州吉玛基因股份有限公司兔源抗、抗体()购于 公司总 提取试剂盒()购自 公司 逆转录试剂盒()购自美国 公司.和 法检测脑胶质瘤组织中 及 的表达():向正常对照组脑组织及胶质瘤组织加入液氮后进行研磨加入适量的蛋白裂解液在冰浴条件下充分裂解 收集至 离心管中于 离心 吸取上清经 变性 后放置于 冰箱中备用 将 的各样品加入相应的凝胶孔中进行 电泳 脱脂牛奶封闭 后加入一抗(、)孵育过夜 洗膜 次后加入相应的 标记的二抗()孵育 洗膜 次使用 液进行显影并使用 软件对薄膜带上的蛋白进行半定量分析():使用总 提取试剂盒提取各组细胞的 并利用逆转录试剂盒将提取的 逆转录为 设计、相关基因的上下游引物(如表 所示)进行实时定量 反应并使用 仪器检测胶质瘤组织中、以及各组 细胞中 水平的表达情况数据分析采用 法进行 见表 表 引物序列引物 序列:.法 及 细 胞 划 痕 实 验 检 测、对 细胞增殖和迁移能力的影响()实验:使用含 双抗的 培养基在 的条件下培养 细胞收集对数生长期细胞 洗涤并重悬后以每孔 的密度接种于 孔板中 设立以下几组实验:对照组、转染 组、空载体组、过表达组每一组设置 个复孔 待细胞生长至 融合后分别根据分组转染相应试剂培养 后向每孔加入 溶液并于细胞培养箱中孵育 随后使用酶标仪在 波长下测定各孔下的吸光度()值()细胞划痕:将 细胞以个/孔接种于 孔板中根据上述分组进行转染 后用直尺比对用 的枪头在每孔竖直划 条直线 缓冲液漂洗 次后换无血清培养基进行培养并在显微镜下观察拍照、之后分别使用 缓冲液漂洗 次后再次观察拍照使用 软件测量划痕的宽度并进行统计分析淮海医药 年 月 第 卷 第 期 .及 法检测转染 和对 细胞中 表达的影响:使用总 提取试剂盒提取各组细胞的 按.中 的方法检测各组 的表达量 按.中使用总蛋白抽提试剂盒抽提各组细胞的蛋白 法检测各组 蛋白的表达量.及细胞划痕实验检测过表达 后对 抑制的脑胶质瘤细胞增殖和迁移能力的影响实验分为对照组、联合空载体组以及 和 共转染组其中对照组接受空质粒转染 联合空载体组同时接受 及 空 质 粒 的 转 染 处 理 和 共转染组同时接受含有 及 基因的质粒 法及细胞划痕实验操作同.统计学方法 该研究采用 进行绘图和统计分析所有数据采用 表示组间两两比较采用单因素方差分析()组内比较采用 法以 低级别胶质瘤组织 高级别胶质瘤组织差异均有统计学意义()见图 表达情况:正常组织 低级别胶质瘤组织 高级别胶质瘤组织差异均有统计学意义()见图 在高级别胶质瘤中表达降低 的 在高级别胶质瘤中表达升高图 、在低、高级别脑胶质瘤中的表达水平.有效抑制脑胶质瘤细胞的增殖和迁移能力分别采用 和细胞划痕法检测转染 胶质瘤细胞 的增殖和迁移能力 与对照组比较 组的 高表达后可以明显抑制 的增殖能力(图)和迁移能力(图)转染 后胶质瘤细胞株 的增殖能力降低 转染 后胶质瘤细胞株 的迁移能力下降图 高表达对 的增殖和迁移能力的影响.促进脑胶质瘤细胞 的增殖和迁移能力同样选择 和细胞划痕法检测转染 质粒后脑胶质瘤细胞 的增殖和迁移能力 结果显示与空载体组比较 高表达可明显促进 的增殖能力(图)和迁移能力(图)转染 质粒后胶质瘤细胞株 的增殖能力增加 转染 质粒后胶质瘤细胞株 的迁移能力增加图 表达升高对胶质瘤细胞株 的增殖和迁移能力的影响.检测转染 后 和蛋白的表达水平在胶质瘤细胞 中转染 及空载体质粒后分别采用 及 检测 和蛋白水平的表达结果显示 可有效抑制 和蛋白水平的表达 见图 淮海医药 年 月 第 卷 第 期 图 转染 后脑胶质瘤细胞 中 的 及蛋白表达水平降低.恢复 导致的脑胶质瘤细胞增殖及迁移能力 为观察 是否可以恢复 导致的脑胶质瘤细胞增殖和迁移能力设置对照组、联合空载体组及 和 共转染组 分别向 组细胞中分别转染空载体质粒、及 利 用 细胞增殖实验及细胞划痕实验观察脑胶质瘤细胞 的增殖能力结果显示与对照组比较 和 共转染组的细胞增殖和迁移能力明显下降()与 联合空载体组比较 和 共转染组的细胞增殖和迁移能力明显上升()见图 恢复 抑制的脑胶质瘤细胞增殖能力 可恢复 抑制的脑胶质瘤细胞迁移能力图 恢复 抑制的脑胶质瘤细胞增殖和迁移能力 讨论 脑胶质瘤是中枢神经系统常见的恶性肿瘤死亡率高预后差其中以高级别的胶质母细胞瘤表现最为严重 目前临床上针对胶质瘤的治疗方法主要有放疗、化疗以及手术切除等然而肿瘤细胞极强的增殖和迁移能力导致此类治疗方法不佳患者极易复发 表达失调会导致其调控的下游蛋白表达异常直接参与肿瘤的发生及进展 本研究选择脑胶质瘤中出现差异的 及 作为研究对象探讨它们在脑胶质瘤中的表达特征以及对细胞功能的影响旨在揭示脑胶质瘤增殖、迁移的分子机制奠定前期研究基础 是 结构小泛素化增强子最初在垂体瘤细胞中发现且在小脑、心脏及肾脏等组织中均有所表达 可在缺氧、炎症等多种外界刺激下表达升高由于其具有强烈的促血管生成的能力因此会参与诸多肿瘤的发生发展过程中本课题在胶质瘤组织中也发现 的表达升高提示其同样参与肿瘤的发生过程 生物信息学软件能分析潜在影响 的 分子结果显示 可靶向 的表达由于 是一类长度约 个核苷酸的内源性非编码小分 其可以与下游靶基因 的 区相结合进而导致下游靶基因 降解或抑制其翻译过程对靶基因的转录后调控起着重要作用 因此我们推测是由于正常脑组织、低级别及高级别胶质瘤组织中 的表达水平逐渐降低后导致了胶质瘤组织中 的表达升高 位于人体细胞染色体长臂 区 带上 近年来有研究表明 与肿瘤的发生发展有着密切关系 为了进一步证实 对 调控作用本研究 在 体 外 实 验 中 分 析 过 表 达对 的增殖及迁移能力的影响结果显示在脑胶质瘤细胞中转染 后该细胞的增殖迁移能力降低提示它是脑胶质瘤发病过程中重要的促进因子 本研究结果与既往研究相符可通过下调/及/信号通淮海医药 年 月 第 卷 第 期 路抑制结直肠癌细胞的增殖能力同时 等发现 在胃癌中表达量降低且其可通过 和 通路影响胃癌细胞的生存及凋亡能力 以上结果不仅提示 可以促进脑胶质瘤的发生发展也预示着作为一种血液中可以检测到的分子同样有希望作为一种监控脑胶质瘤病情进展的分子来早期预测脑胶质瘤的发生及复发既往研究发现 的表达在垂体瘤中升高且敲减 的表达可抑制垂体瘤的侵袭能力 本研究通过实验证实转染含有 的质粒可以明显促进胶质瘤细胞的发生发展这表明 是 一 个 脑 胶 质 瘤 治 疗 的 促 进 因 子生物信息学软件预测发现 可靶向 的表达且本研究细胞实验中已经证实过表达 可以抑制细胞的增殖和迁移能力那么我们推测在胶质瘤的发生过程中是由于表达的降低导致了 表达升高最终导致了脑胶质瘤的发生为证实该推论本研究在脑胶质瘤细胞中转染 后检测 含量的变化 及 结果表明细胞中的 含量同样降低该结果说明 可以直接作用于 的区发挥对 表达的抑制作用 为此我们设计了回复实验来验证推测的可靠性在 细胞 中 共 转 染 及 质 粒 后诱导的细胞增殖迁移下降的能力明显下降证实 可有效恢复因 抑制的脑胶质瘤细胞增殖迁移能力 该结果进一步表明 在脑胶质瘤中表达下降而 水平下降会导致 水平升高最终促进脑胶质瘤的发生和发展综上所述 及 在胶质瘤中呈现差异性表达检测血清中 的含量可用于早期预测脑胶质瘤的发生及复发 胶质瘤中 含量降低可以导致细胞中 的表达上调并促进脑胶质瘤细胞的增殖和迁移能力参 考 文 献 丁永奇翟进忠.显微镜下肿瘤切除术对脑胶质瘤患者术后认知功能及神经肽水平的影响.淮海医药():.:.():.():.范阳华祝新根吕世刚等.慢病毒介导的 沉默对人胶质瘤 细胞增殖和侵袭的影响.中国病理生理杂志():.():.:.():.():.():.:.:.方克云.愈梗通瘀汤对心肌梗死后患者心室重构及、表达的影响.淮海医药():.:.:.陆小琴雷娇娇刘雨欣等.通过 轴调控急性 淋巴细胞白血病细胞增殖、侵袭的实验研究.实用肿瘤学杂志():.():./.():.():.(收稿日期:)本文编辑:王艳淮海医药 年 月 第 卷 第 期