双向（2-D）电泳原理和方法.pdf

概述 关于本手册 本手册旨在介绍高分辨率双向（2-D）电泳的操作方法。本手册共分七章：第一章介绍样品制备和蛋白定量的方法。第二章具体介绍双向电泳中第一向的操作过程，重点介绍EttanTM IPGphorTM 3等电聚焦系统。第三章包括采用各种垂直凝胶电泳系统进行固相pH梯度（IPG）胶条的第二向电泳的一般方法。第四章介绍使用平板Multiphor TM 电泳系统进行第一向和第二向电泳的方法。第五章讨论双向电泳结果的图像与分析。第六章介绍双向荧光差异凝胶电泳（2-D DIGE）的优势与使用技术。第七章描述双向凝胶电泳的常见问题与解决方法。涉及具体技术的故障排除方法请见相关章节。本手册介绍的操作程序使用Amersham Biosciences公司的产品，该公司现为GE Healthcare公司的一部分（下文均称GE Healthcare）。备选设备及照片见表1。产品订购信息见第155页。根据样本类型和研究性质的不同，本手册所介绍的操作步骤可能须调整或优化。双向电泳简介 双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，已得到广泛应用。这项技术利用蛋白质的两种特性，分两步将不同的蛋白质分离。第一向步骤为等电聚焦（IEF），即根据蛋白质的等电点（pI）差异将蛋白质分离。第二向步骤为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），即利用蛋白质的分子量（Mr,相对分子量）差异将蛋白质分离。双向凝胶电泳结果中的每个斑点都对应着样本中的一种蛋白。因此，可将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量和含量等信息。双向电泳由OFarrel（1）在1975年首次建立。在最早的技术中，第一向分离使用的是含有载体两性电解质的聚丙烯酰胺管胶，详见第43页2.1节。自从双向电泳技术一产生，人们就认识到其作为一种生物化学分离技术的重要性，但这一技术得到广泛的应用还应归功于以下几个方面的改进：?由于采用了固相pH梯度胶和Immobiline试剂（2），使第一向等电聚焦的分辨率和可重复性大大提高。基于这项技术，Grg及其同事们（3,4）开发出了目前所使用的双向电泳技术，用固相pH 梯度代替了载体两性电解质产生的pH梯度，并用带支持膜凝胶代替了管胶。关于此项技术的优越性详见第45页2.2节。?双向荧光差异凝胶电泳（2-D DIGE）首先由nl等（5）于1997年提出，这项技术可更好地控制系统误差，使研究人员能够发现具有统计学意义的生物变异的蛋白质表达。?双向电泳后的一系列自动化操控，如凝胶图像分析、斑点采集、胶内酶解、以及靶样本制备用于质谱测定等，大大增加了蛋白质分析与鉴定的能力。?新的质谱技术的发展，使人们能够快速鉴定和描述极微量的多肽和蛋白质。?现在的计算机和软件功能更强大，价格更低，可对高度复杂的双向电泳图像进行彻底的计算机分析。?现在人们已经掌握了大量生物体全部基因组数据，从而可以迅速识别编码双向电泳分离的蛋白质的基因。?目前蛋白质序列信息正日新月异地增加，并在公共域名数据库中共享，一些组织，如人类蛋白质组组织（HUPO），正在推动各国间的合作，共同进行蛋白质组学研究。?斑点图像数据库和基因组序列数据库均可以简单、直接地通过万维网访问，可分别用来比对双向电泳结果和分析序列信息。双向电泳技术在蛋白质组学领域里得到了大量的应用（6,7），利用该技术可对一种样本中的许多蛋白质同时进行系统化的分离、鉴定、定量。双向电泳在这一领域中的应用也正是因为其同时分离数千种蛋白质的无与伦比的能力，同时，该技术还可检测翻译后和翻译过程中的蛋白质修饰，这是无法通过基因组序列分析进行预测的。双向电泳技术的应用领域有蛋白质组分析、细胞鉴别、疾病标志物探测、治疗监测、新药发现、癌症研究、纯度检测、以及微量蛋白质纯化等。本手册所介绍的双向电泳操作，采用 GE Healthcare 公司所生产的预制 IPG 胶条（Immobiline DryStrip 凝胶）。本手册中使用的符号 此符号表示在特定情况下能够改善操作或提供推荐的一般性建议。此符号表示应视为强制性的建议，需要特别引起注意。此符号表示解决故障的建议，可用于分析和解决可能出现的困难。化学物质、缓冲液和设备 实验操作方案 表1.双向电泳的仪器选择 A.第一向和第二向电泳的最佳系统 使用Ettan IPGphor3等电聚焦系统进行第一向IEF 胶条尺寸采用胶条宽度分离区长度表示 Ettan IPGphor 3等电聚焦系统和Ettan IPGphor Manifold胶条槽或标准胶条槽 注：Ettan IPGphor,Ettan IPGphor II 系统与Manifold胶条槽完全兼容，与本手册中所介绍的实验操作方案也完全兼容。图1 Ettan IPGphor 3 等电聚焦系统和Ettan IPGphor Manifold胶条槽 选择因素：?独特设计的Ettan IPGphor Manifold胶条槽可同时最多容纳12个IPG胶条，长度范围724 cm，适合等电聚焦和后续的平衡反应。?可采用样品杯上样，改善蛋白质聚焦谱，尤其是使用碱性IPG胶条时。?Manifold胶条槽盘底采用导热氧化铝陶瓷制成，散热迅速，避免“热点”出现。?程序控制电压、电流、温度和时间。?通过控制软件以及个人电脑通过串行接口连接，可最多同时控制4套Ettan IPGphor 3设备，每套设备独立跑胶。?可最多存储、恢复、编辑10套实验操作方案（每套方案由9步构成）。使用垂直电泳系统进行第二向SDS-PAGE电泳 Ettan DALTsix大型垂直电泳系统，最多可容纳6个2620cm凝胶 图2 Ettan DALTsix大型垂直电泳系统 选择因素：?电泳工作时间：4小时至整夜?模块化系统?兼容带稳定缓冲系统的预制胶：Ettan DALT Gel 12.5（25.519.6 cm，厚度1 mm）?大型凝胶支持最高分辨率和最大蛋白质载量?中等通量（最多同时跑6块胶）?最适合采用18cm和24cm的IPG胶条?跑6块胶时缓冲液量约为5L Ettan DALTtwelve大型垂直电泳系统，最多可容纳12个2620cm凝胶 图3 Ettan DALTtwelve大型垂直电泳系统 选择因素：?电泳工作时间：4小时至整夜?带高效珀尔帖（Peltier）温控的集成化系统?兼容带稳定缓冲系统的预制胶：Ettan DALT Gel 12.5（25.519.6 cm，厚度1 mm）?大型凝胶支持最高分辨率和最大蛋白质载量?高通量（最多同时跑12块胶）?最适合采用18cm和24cm的IPG胶条?跑12块胶时缓冲液量约为10L miniVE和SE 260微型垂直电泳系统，可容纳1或2个87或9.5 cm凝胶 图4 miniVE垂直电泳系统 图5 SE 260微型垂直电泳系统 选择因素：?电泳速度快：12小时?最适合采用7cm IPG胶条?当需要快速分离或样本蛋白质谱相对简单时最适用 SE 600 Ruby标准垂直电泳系统，可容纳1至4个1416 cm凝胶 图6 SE 600 Ruby标准垂直电泳系统 选择因素：?电泳时间：25小时?中等分离效果（凝胶长16cm）?中等通量（使用分隔玻璃板最多可同时跑4块胶）?最适合采用11cm或13cm的IPG胶条?可选择分隔玻璃板对7cmIPG胶条进行高通量第二向电泳（使用分隔玻璃板最多每次可跑8根7cmIPG胶条）B.采用平板电泳系统进行第一向和第二向电泳 使用Multiphor 电泳系统和Immobiline DryStrip干胶条套件（在溶胀盘中进行溶胀）进行第一向IEF 图7 Multiphor 电泳系统和Immobiline DryStrip干胶条套件 选择因素：?既可用于第一向分离也可用于二向分离，还可用于许多其他电泳技术?使用724cm的IPG胶条，IEF分离通用?注：需要EPS 3501 XL电源供电和MultiTemp恒温循环水浴冷却 使用Multiphor 电泳系统进行第二向SDS-PAGE电泳 可容纳24.511/18cm凝胶 选择因素：?可使用预制凝胶：ExcelGelSDS均质凝胶12.5（24.511 cm）和ExcelGel梯度凝胶XL1214（24.518 cm）?电泳速度相对较快：小于4小时?高分辨率 可使用各种长度的IPG胶条。双向电泳的实验步骤为：1.样本制备 正确的样本制备对于良好的双向电泳结果是绝对重要的。2.Immobiline DryStrip 干胶条水化 进行 IEF 之前，必须加入恰当的添加物，使 Immobiline DryStrip 干胶条溶胀。3.等电聚焦电泳（IEF）第一向 IEF 电泳在平板电泳系统中进行，电泳时采用超高电压和主动温度控制。4.Immobiline DryStrip 干胶条平衡 将样本胶条在含有 SDS 的平衡液中进行平衡处理，以便第二向分离。5.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样本胶条进行第二向 SDS-PAGE 凝胶电泳。6.显影 对第二向凝胶基质上的蛋白质斑点进行染色，使之显影。如果蛋白质经预先标记过，就可以通过放射自显影、或紫外线照射、或荧光显像的方法使蛋白质斑点显影。7.分析 对样本双向电泳斑点结果进行分析。设备选择 等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE凝胶电泳有多种实验方法与设备，表1列出了GE Healthcare公司所提供的设备，关于这些设备的详细操作信息请参阅设备用户手册，关于设备的其他信息和本公司的其他产品信息，请参阅 GE Healthcare BioDirectory，或登陆。等电聚焦（IEF）系统的选择 GE Healthcare 公司提供两种可进行第一向电泳的系统：Ettan IPGphor3 等电聚焦系统和Multiphor电泳系统。这两种系统均可以通过升级配件而进一步改善 IEF 电泳性能。Ettan IPGphor3 等电聚焦系统（图 1）是一种 IEF 电泳专用系统，电泳在 Immobiline DryStrip干胶条上进行，该系统已经过升级，操作简单，可轻松完成第一向电泳分离。Ettan IPGphor3等电聚焦系统的一贯特点是高速，可重复性好，高通量。该系统配备了高安全性的高压电源（根据所使用的 DryStrip 干胶条的不同，最高可提供 10 000V 电压）和珀耳帖（Peltier）固相温度控制装置（1530），程序控制参数包括水化温度和时间、等电聚焦的温度和最大电流，以及每次电泳分离中各步骤的时间及电压模式。除了IEF电泳仪以外，该系统的关键配件还包括Manifold胶条槽，标准胶条槽和溶胀盘。另外，该系统整合的Ettan IPGphor3控制软件可更好地操控IEF电泳，并可最多同时控制4套Ettan IPGphor3电泳仪，每一套可设定不同的跑胶参数。这些配件将在2.3节中详细介绍。如果样本较多地集中在高端和低端pH梯度，或者在较窄的pH梯度内分离大量蛋白质，应使用Ettan IPGphor Manifold胶条槽和7、11、13、18或24 cm的Immobiline DryStrip干胶条，上样可采用样品杯、溶胀盘、或纸桥，详见2.32.5节。Multiphor电泳系统（图7）具有多种功能，可进行几种不同的电泳。对于双向电泳，它既可用于第一向IEF电泳，也可用于第二向SDS-PAGE电泳。干胶条进行溶胀时既可以含有样本，也可以不含样本，溶胀在溶胀盘内进行。溶胀后，胶条被转移到电泳仪上进行第一向等电聚焦（IEF）。本系统由 Multiphor电泳系统和 Immobiline DryStrip 干胶条套件组成，可用杯上样和纸桥上样的方式把样品加到已溶胀的胶条上。该系统可容纳最多 12 条同样长度的溶胀胶条进行任何方式的 IEF 电泳。该系统由 EPS 3501 XL 电源单独供电，并由 MultiTemp 恒温循环水浴进行温度控制。表 2 列出了采用 Ettan IPGphor3 等电聚焦系统和 Multiphor电泳系统进行第一向 IEF 电泳的主要区别。表 2.等电聚焦系统选择 最大电压 所需附加设备 等电聚焦时间*Ettan IPGphor3 10 000V 相应长度的胶条槽 或 Manifold 胶条槽联合溶胀盘 236 h Multiphor 3500V 溶胀盘；Immobiline DryStrip 干胶条套件；EPS 3501 XL 电源；MultiTemp 恒温循环水浴 272 h*最佳的聚焦时间依 Immobiline DryStrip 干胶条长度、pH 值范围以及样品特性的不同而有较大波动。对于类似的样本分离，采用 Ettan IPGphor3 等电聚焦系统比采用 Multiphor电泳系统至少可快 2 倍。出于安全考虑，不推荐采用更高电压。关于Ettan IPGphor3等电聚焦系统和Multiphor电泳系统上样方法的选择分别见2.4节和4.1.34.1.4节。第二向电泳系统的选择 第二向电泳分离既可以在垂直设备上进行也能在平板设备上进行。表 3 列出了可进行第二向电泳的设备以及所用凝胶的尺寸和 Immobiline DryStrip 干胶条的长度，进一步讨论详见下文。关于垂直系统与平板系统的比较优势，详见参考文献 8。表 3.第二向电泳系统及其 Immobiline DryStrip 干胶条和预制凝胶板的选择 凝胶大致尺寸（宽长 cm）凝胶数量 凝胶厚度（mm）IPG 胶条长度（cm）总分离时间（h:m）垂直系统：Ettan DALTsix*2620 16 1，1.5 18，24 4:006:30 Ettan DALTtwelve*2620 112 1，1.5 18，24 5:007:00 miniVE或SE 260 89.5 12 1，1.5 7 1:30 SE 600 Ruby 1416 1616 168 14 14 14 1，1.5 1，1.5 1，1.5 11 13 13 3:005:00 3:005:00 3:004:00 平板系统：Multiphor ExcelGel 2-D Homogeneous 12.5*24.511 1 0.5 各种长度 1:45 ExcelGel Gradient XL 1214*24.518 1 0.5 各种长度 3:20*适用多个较短的 Immobiline DryStrip 干胶条（2 个 11cm 胶条或 3 个 7cm 胶条）须使用 1cm 宽的垫片 如使用分配板，可同时跑 4 块胶 联合使用较短的玻璃板（8cm）和分配板，可同时进行 8 个小面积电泳分离 垂直系统 垂直系统使用方便，能同时进行多块胶的分离。垂直系统所用的第二向凝胶既可以是 1mm 厚也可以是 1.5mm 厚。Ettan DALTsix（图 2）可用于中等通量的高分辨率第二向凝胶电泳，最多可同时跑 6 块胶。该系统可容纳 18 或 24cm 长的 Immobiline DryStrip 干胶条，可使用预制或实验室制备的大面积Ettan DALT 凝胶。内置循环泵能推动缓冲液循环流动，以调节温度（与 MultiTemp恒温循环水浴配合使用）。为了得到最佳的分辨率、可重复性和样品通量，建议使用 Ettan DALTtwelve 系统（图 3）。采用预制的带支持膜 Ettan DALT 大面积凝胶，方便易用，该系统能够容纳 18cm 或 24cm 长的Immobiline DryStrip 干胶条（包括分子量标记），最多能同时跑 12 块凝胶。该系统整合了珀尔帖（Peltier）温控装置和缓冲液循环泵，能保证精确而稳定的温度环境。使用 Ettan DALTtwelve灌胶模具能同时灌制最多 14 块 1 mm 厚的凝胶。若需要尽快得出结果，建议采用微型凝胶电泳系统miniVE（图 4）或 SE-260（图 5）系统，通常能够在 12 小时内完成第二向电泳分离。在需要快速了解蛋白质组成情况或样本中蛋白质谱相对比较简单时，最佳的办法是采用微型凝胶进行第二向电泳分离。如需要提高样本通量和分辨率，建议采用标准规格的 SE600 Ruby 垂直电泳系统（图 6）。该系统能够同时容纳 4 块 16cm 长的凝胶，内置的热量交换器（与 MultiTemp 恒温循环水浴配合使用）冷却能力强，确保了实验的高度可重复性。使用 14cm 宽凝胶时标准垫片宽度为 2cm。如果需要利用 13cm 长的 Immobiline DryStrip 干胶条两端的额外空间用于分子量标记，可选用1cm 宽的垫片，进行 16cm 宽的凝胶电泳。如果需要制备 1416cm 宽、8cm 长的凝胶，可选用较短的 8cm 夹子、短板和垫片，这些较短的凝胶适于同时快速地对数个 7cm 长的 Immobiline DryStrip 胶条进行第二向电泳分析。Multiphor电泳系统 Multiphor平板电泳系统（图 7）分辨率高，分离速度相对较快，可使用大面积凝胶。预制的 ExcelGel 产品可提供方便易用的凝胶和缓冲胶条。Immobiline DryStrip 胶条的蛋白含量可能会超过较薄的水平第二向凝胶的容量，因此在进行微量制备时，最好采用较厚的垂直第二向凝胶。如果第一向电泳使用的 Immobiline DryStrip 胶条 pH 值范围为 69、611 或 711，不建议使用 Multiphor 电泳系统进行第二向电泳。良好的实验室操作技术 在操作 Immobiline DryStrip 干胶条、SDS-聚丙烯酰胺凝胶、ExcelGel 缓冲胶条以及任何接触这些物质的仪器设备时，务必戴上手套。使用手套能减少因蛋白质污染而产生的杂点和条带。凡是接触凝胶或样本的器件，都要用玻璃器皿专用去污剂清洗，并用蒸馏水冲洗。当采用高敏感度质谱分析进行斑点鉴定和描述时，这一点特别重要。对于标准胶条槽和 Manifold 胶条槽，可选用一种特殊清洁剂（见第 2 章）。一定要使用最高级别纯度的试剂以及所能得到的最纯净的水。在双向电泳操作过程中所用的一些化学物质如丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、硫脲、DTT、碘乙酰胺和 DeStreak 试剂等，具有很强的毒性。例如，丙烯酰胺单体是一种神经性毒素，且有可能致癌。请阅读生产商安全数据表（MSDS），该表详细介绍了实验室中所有化学物质的性质及注意事项，请在开始本手册中所介绍的实验操作之前，阅读该表。处理有害化学物质时，在所有的实验中一般均须戴双层乳胶手套。称量有害物质时，应在通风橱中进行，并戴一次性防尘面罩。另外还须遵守操作与处置化学物质的当地法规与规定。第 1 章 样本制备 1.0 一般策略 要得到良好的双向电泳结果，适当的样本制备是绝对重要的。由于蛋白质样本的类型和来源各不相同，最佳的样本制备方法必须通过经验决定。若能使样本中的蛋白质完全溶解、分离、变性、还原，那是最理想的。对于双向荧光差异凝胶电泳（2-D DIGE），样本制备方面有一些特殊之处，请参见 6.3.2节。在设计某种样本制备方案时，必须对双向电泳最终要达到怎样的结果有清晰的把握。是要尽可能地分离更多的蛋白质，还是仅仅想看到样本中感兴趣的那部分蛋白质？到底哪一个目标更重要？是样本的完全分离还是获得清晰而可重复的蛋白质谱？样本制备过程中，增加步骤能提高电泳最终结果的质量，但同时也能导致一些蛋白选择性的丢失。所以必须充分考虑提高样本质量和样本的完全分离之间的相互关系，权衡利弊。要想在复杂的蛋白质混和物中辨别出特定的蛋白，必须使那些感兴趣的蛋白质在电泳条件下完全裂解。裂解不同种类的蛋白质样本应采用不同的处理和条件：一些蛋白质在天然条件下与膜、核酸及其他蛋白质形成复合物；一些蛋白质形成各种非特异性的集合体；一些蛋白质一旦离开其正常环境就会发生沉淀。裂解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质浓缩和裂解的方法、去污剂的选择以及样本溶液的组成。在处理某种样本的时候，如果这些步骤中的任何一步没有充分完成，分离就可能不完全或失败，并且一些信息也可能丢失。1.0.1 细胞破碎、避免蛋白水解、样本分级 为了对细胞内蛋白作全面分析，必须有效地破碎细胞。细胞破碎方法的选择，依赖于样本是来源于细胞悬液、实体组织还是其他生物材料，以及是否要分析细胞内所有蛋白质或仅仅是细胞内的一部分蛋白质。关于温和的细胞裂解方法和强烈的细胞裂解方法将在 1.1.1 节和 1.1.2节中分别介绍。第 1.1.3 节介绍了采用样本研磨试剂盒（Sample Grinding Kit）研磨细胞的实验操作方案。在细胞破碎过程中，蛋白酶也可能被释放出来。样本中的蛋白质一旦被水解，将极大地增加双向电泳结果分析的难度，因此，在细胞破碎和随后的制备过程中，应防止样本中的蛋白质被水解。第 1.2 节将讨论蛋白酶的抑制方法，第 1.2.1 节介绍了蛋白酶抑制剂混合物（Protease Inhibitor Mix）的实验操作方案。如果只对组织或细胞中的一部分蛋白感兴趣，在样品制备过程中可以采取样本分级的方法。如果想要分析的蛋白质来源于某一亚细胞单位（如细胞核、线粒体、质膜等），可以在蛋白质裂解之前采取差速离心或其他方法将感兴趣的细胞器纯化。还可以在双向电泳前，将样本在不同的提取条件下利用溶解性的不同进行样本分级（实验条件参见参考文献 913）。1.0.2 蛋白质沉淀和去除干扰物质 在全细胞裂解液中，各种蛋白质的浓度范围差异很大，并呈动态变化，这种情况下，高丰度蛋白质就有可能掩盖低丰度但我们又感兴趣的蛋白质。有效的蛋白质组学分析自然既包括将高丰度蛋白质分离，还包括富集低丰度蛋白质以达到可以检测到的水平。通过这种处理，可以提高样本分析的分辨率，使双向电泳图像不至于过分拥挤，简化结果分析与解释，增加发现新的具有诊断或治疗价值蛋白质的机会。沉淀样本中的蛋白质和去除干扰物质并非必须的步骤。是否采用这两个步骤依赖于样本的特性和实验的目的。沉淀既可用来浓缩样本，也能用于分离蛋白质中可能的干扰物，沉淀的实验操作将在 1.4 节中介绍。第 1.4.1 节介绍了采用 2D clean-up 试剂盒（2-D Clean-Up Kit）进行样本清洁的实验操作方案。第 1.5 节讨论了如果各种污染物（盐类、小离子分子、人血清白蛋白和 IgG、离子型去污剂、核酸、多聚糖、脂类及酚类化合物等）未能及时清除会对双向电泳结果产生哪些影响，该小节还讨论了样本去除杂质的技术。具体实验操作方案包括采用微透析试剂盒（mini Dialysis Kit）进行脱盐（第 1.5.1 节）、采用核酶混合物（Nuclease Mix）去除核酸（第 1.5.2 节）、还有采用白蛋白和 IgG 清除试剂盒（Albumin and IgG Removal Kit）消除因人血清白蛋白和 IgG 存在而引起的问题（第 1.5.3 节）。一般来说，样本制备越简单越好，举例来说，低蛋白质浓度高盐浓度的样本可用冻干的方法脱盐然后浓缩，或采用 TCA 和预冷的丙酮进行沉淀，再用水化溶液将其再溶。一些情况下，用水化溶液简单地对样本进行稀释就足够了。若蛋白质浓缩存在问题或干扰物质的问题不能克服，就须使用蛋白质沉淀和除杂技术。1.0.3 样本制备的其他方面 样本溶液的成份对双向电泳极为重要，因为用于第一向电泳的裂解处理必须既不影响蛋白质的 pI 值，也不能使样本溶液具有高导电性。通常地，样本制备过程会使用高浓度尿素（或联合使用尿素和硫脲）和一种或多种去污剂。样本溶液的组成将在第 1.6 节中讨论。对所制备的样本中的蛋白质精确定量使比较困难的，因为用于制备和裂解样本的许多试剂（如促溶剂、载体两性电解质、去污剂、还原剂等）都与普通的蛋白质检测相排斥，第 1.7 节将讨论这一问题，第 1.7.1 节介绍采用双向电泳蛋白定量试剂盒（2-D Quant Kit）来解决这个问题的实验操作方案。上述的各种 GE Healthcare 公司的样本制备试剂盒既可简化制备操作过程又可提升样本的质量，这对于良好的电泳结果是十分重要的。表 4 总结了这些试剂盒，详细内容参见相应章节。表 4 样本制备试剂盒 1.0.4 样本制备的一般原则 样本制备方案应尽可能简单，以避免蛋白质的丢失。附加样本处理步骤能提高双向电泳最终结果的质量，但是有可能以选择性蛋白质丢失为代价。通过文献检索了解是否有其他人已经制定了类似的方案，网络上的讨论组也可能提供有益的帮助，如登录 。进行细胞或组织破碎时，必须最小限度地减少蛋白质水解和其他形式的蛋白降解。有可能的话，在尽可能低的温度下进行细胞破碎，并尽量减少破碎过程中热量的产生。理想情况是，细胞破碎应当直接在含有蛋白酶抑制剂的强变性溶液中进行。尽可能保持样本的质量，应在等电聚焦之前新鲜制备，或将样本分批保存在-40以下的环境中。不要使样本反复冰冻和融化。通过超离心方法除去所有颗粒物，必须清除所有固体颗粒和油滴，因为他们能堵塞凝胶的孔隙。为了防止蛋白质的修饰，不要在加入尿素后加热样本。如果样本中存在尿素，溶液温度不能超过 37。温度上升会使尿素水解为异氰酸酯，异氰酸酯能通过氨基甲酰化作用（carbamylation）对蛋白质进行修饰，造成人为的“斑点串（charge trains）”。本章描述双向电泳样本制备的方法，电泳采用 GE Healthcare 公司的预制 Immobiline DryStrip 干胶条。关于 Immobiline DryStrip 干胶条的最佳蛋白含量将在第 2.5 节讨论。其他关于Immobiline DryStrip干胶条和IEF和双向电泳设备的信息，参见第2章和第3章。关于Immobiline DryStrip 干胶条样本制备的进一步详细技术，参见参考文献 1416。1.1 细胞破碎的方法 表 5 和表 6 列出了一些标准的机械和化学的破碎方法。细胞破碎必须在低温下进行，可能的话应将样本放在冰块上并且使用预冷的溶液。在细胞破碎过程中蛋白酶有可能被释放出来，因此，无论采用本节所介绍的那种方法，都须防止蛋白质样本被水解。通常采取的方法是，直接将样本置于强变性裂解液中破碎，这样能使蛋白水解酶迅速失活，并且也能抑制其他一些能修饰蛋白质的酶的活性。细胞破碎往往在合适的能裂解特定蛋白质的裂解液中进行（见参考文献 17 和 18 关于组织破碎和细胞裂解的一般信息）。1.1.1 温和的裂解方法 如果所感兴趣的样本是由易于裂解的细胞组成的（如组织培养细胞、血细胞以及一些微生物等），一般采用温和的细胞裂解方法来破碎样本。当只有一种特定的亚细胞成分需要分析时，也可以用温和的裂解方法。例如，选择反应的条件，只释放胞质蛋白，或通过差速离心的方法得到完整的线粒体或其他细胞器。有时，这些方法需要联合使用（如酶处理后再渗透裂解，或在去污剂存在的条件下冻融）。表 5 中总结了各种温和的裂解方法。表 5.温和的裂解方法 细胞破碎的方法 适用材料 一般操作过程 渗透裂解（19）这是一种非常温和的方法，非常适合裂解后须破碎成亚细胞成分的样本。血细胞 组织培养细胞将细胞悬浮在低渗溶液中。冻融裂解（9,17,20）许多类型的细胞可通过对其进行一次或多次快速冷冻再融化的方法来裂解。细菌细胞 组织培养细胞利用液氮将细胞悬液迅速冻结后再融化。如果需要，可反复进行。去污剂裂解 去污剂能溶解细胞膜，从而裂解细胞并释放细胞内容物。组织培养细胞将细胞悬浮在含有去污剂的裂解液中。细胞往往可以直接在样本溶液或水化液中裂解，因为这些液体一般都含有去污剂。参见附录中溶液 A，这是一种普遍使用的裂解液，其他例子参见参考文献 21 和 22。如果使用了诸如 SDS 这样的阴离子去污剂，为了确保其不干扰 IEF 电泳，须采取以下步骤之一：将裂解的样本在含有过量非离子或兼性离子去污剂的溶液中稀释 或 利用丙酮沉淀法，将 SDS 与样本蛋白分离。酶裂解 具有细胞壁的细胞可以用酶降解除去细胞壁。采用这种方法，所使用的酶必须对被降解细胞具有植物组织 细菌细胞 真菌细胞 在等渗溶液中用酶处理细胞。特异性（如溶菌酶用于细菌细胞；纤维素酶和果胶酶用于植物细胞；溶壁酶用于酵母细胞）。1.1.2 较强烈的裂解方法 如果细胞不容易破碎，可以采用这类方法，如实体组织中的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞。较强烈的裂解方法能彻底的破碎细胞，但是必须要避免在此过程中所产生热量和泡沫。表6 总结了这些较强烈的裂解方法。表 6.较强烈的裂解方法 细胞破碎的方法 适用材料 一般操作过程 超声波裂解法（5,25,26）通过超声波发生器产生的超声波剪切力将细胞破碎。当达到最大的振幅时，剪切最完全，但必须注意尽量减少热量的产生和泡沫的形成。细胞悬浮液 短时间冲击细胞悬液以避免产生热量。超声波冲击间隙将样本放在冰上冷却。高压法（23,24,27）高压下通过小孔对细胞悬液施加压力产生的剪切力破碎细胞。带细胞壁的微生物（细菌、藻类、酵母菌）将细胞悬浮液放入预冷的压力室中，施加压力并收集被挤出的破碎样本。研磨法（5,8,28,29）一些类型的细胞可通过研钵和杵将其研磨破碎。实体组织 微生物 用液氮冷冻组织或细胞，并将他们反复研磨成精细的粉末。加入氧化铝（Al2O3）和沙粒有助于研磨。机械匀桨法（9,19,30-32）许多装置能用来进行机械匀桨组织。手 持 装 置 如 Dounce 或Polfer-Elvehjem 匀桨器能够用来破碎细胞悬浮液或相对较柔软的组织。搅拌器或其他电动装置能用来处理大一些的样本。除了在粉碎过程中会有蛋白酶的释放，采用这种方法样本粉碎很迅速且对蛋白质无影响。实体组织 如果需要，将组织切碎。加入预冷的匀桨缓冲液（组织体积的 520倍），迅速匀桨粉碎。利用过滤和/或离心的方法使裂解物澄清。滚珠粉碎法（23,24,33）振荡玻璃球的摩擦作用能破坏细胞壁，并释放细胞的内容物。细胞悬浮液 微生物 将细胞悬浮在等体积预冷的裂解液中，置于一支坚硬的试管内。每克湿细胞加入 13 克预冷的玻璃珠，振荡 1 分钟并在冰上冷却 1分钟，重复 24 次。1.1.3 采用样本研磨试剂盒处理较小的组织或细胞样本 样本研磨试剂盒用于破碎细胞或组织样本。其采用一种研磨树脂和研磨杵来破碎细胞、提取蛋白质。细胞内的细胞器同时也被破碎，这样，只要是能够溶于提取液的蛋白质都能提取出来。小于 100mg 的样本仅须 10 分钟即可处理完毕。该试剂盒含有 50 个 1.5ml 的微型离心管，每个管中含有少量的研磨树脂，悬浮于水中。将管离心，使树脂聚集成沉淀，然后将水去掉。操作方法如图 8 所示。图 8.样本研磨试剂盒操作方法示意图。（a）将研磨树脂在微型离心管中离心成沉淀。（b）加入样本和提取液。用研磨杵将样本破碎。（c）离心，将细胞残骸与树脂分开。（d）收集上清液。所选择的提取液与样本一同加入微型离心管中。用一次性研磨杵研磨样本。然后立即进行510 分钟离心，将细胞残骸与研磨树脂分开。提取后，如果需要，还可用 2D clean-up 试剂盒(2D clean-up kit)处理样本溶液，去掉干扰物质（见第 1.4.1 节）。实验操作方案：样本研磨试剂盒 组成 微型离心管，内含研磨树脂悬浮于水中；一次性研磨杵，用于样本研磨。所需条件 离心设备，至少 12000g；振荡搅拌器；提取液 准备注意事项 样本提取可以采用8 M尿素和4%CHAPS（两性离子去污剂）溶液，或7M尿素、2M硫脲和4%CHAPS溶液（见附录中溶液A和溶液B）。提取过程中可加入非离子型去污剂或蛋白酶抑制剂。标准实验操作中，最多可加入2%的载体两性电解质（Pharmalyte试剂、Ampholines、或 IPG 缓冲液等），但在如果蛋白提取用于双向 DIGE 电泳标记，不能加载体两性电解质。1.在试剂盒所提供的1.5ml的微型离心管中（图8A），以最大速度短暂离心研磨树脂，然后用微量吸液管去除上清液。2.加入样本（最多100mg）和所选择的提取溶液（200300 l）（见附录中溶液A和溶液B）。组织可以用解剖刀切碎，也可以用液氮冷冻后用杵臼打碎，细胞悬液可与研磨树脂一同离心，然后再与提取溶液制成悬液。3.用试剂盒所提供的一次性研磨杵（图8B）将样本彻底研碎（最长1分钟）。4.研磨时应限制提取溶液量在200300 l，防止液体溅出。研磨后可向管中再加提取溶液（最多1ml）。5.以最大速度离心510分钟，将树脂与细胞残骸分离（图8C）。6.收集上清液，并转移至另一个管中（图8D）。如需要，还可进一步用2D clean-up 试剂盒处理（第1.4.1节）。1.1.4 蛋白来源“困难”的样本制备 如果组织中的蛋白质浓度很低，并含有较多干扰物质的话（如植物组织），建议采用下列操作。按照该方法操作，蛋白溶液基本不含盐类、核酸和其他污染物质：1.将组织与液氮一同用杵臼研磨。2.将研磨粉末用10%TCA和0.3%DTT丙酮制成悬液。3.置于-18过夜，再离心，用丙酮洗掉小球。4.干燥后再用9M尿素、2%CHAPS、1%DTT、和2%Pharmalyte 310（52,64）制成悬液。样本应在室温下置于样本溶液中至少30分钟，使其在离心和上样之前充分变性和溶解。在有去污剂存在的条件下，加热样本有利于溶解，但是只能在加入尿素之前进行。超声波也能加速溶解，尤其是对于那些难以再制成悬液的物质。1.2 防止蛋白质水解 当细胞被破碎后，蛋白酶就被释放出来或被激活。由于蛋白酶的作用，会使蛋白质分解，使双向电泳的最后结果复杂化，因此，必须避免这个问题。如果可能的话，应直接将样本在强变性液中裂解，如 8M 尿素、10%TCA、或 2%SDS（34-38）来抑制蛋白酶。低温下蛋白酶的活性低，因此，建议在样本制备时尽可能地在低温下进行。此外，样本制备过程中，通常在 Tris碱、碳酸钠或碱性载体两性电解质存在的条件下，蛋白酶能被有效抑制。一般单独使用这些方法来抑制蛋白酶已足够了，然而有些蛋白酶在这些条件下仍然保持着活性，在这种情况下，应当使用蛋白酶抑制剂。每一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用，因此，建议复合使用蛋白酶抑制剂，目前市场上有多种广谱蛋白酶抑制剂混合试剂盒“cocktails”可供选择。GE Healthcare 公司提供了蛋白酶抑制试剂盒，详见第 1.2.1 节。表 7 列出了常用的抑制剂及他们所抑制的蛋白酶。关于蛋白酶抑制的更多知识请参阅参考文献 15，31，39-43。表 7.蛋白酶抑制剂 蛋白酶抑制剂 能有效抑制的蛋白酶 局限性 PMSF（苯甲基磺酰氟）最常用的抑制剂，使用浓度最高为 1mM。PMSF 是不可逆抑制剂，能失活：?丝氨酸水解酶。?一些半胱氨酸水解酶。PMSF 在水溶液中很快失活，需在使用前现配。PMSF 在含有巯基试剂（如DTT 或 2-巯基乙醇）时效果不好。将样本在含有 PMSF 而无巯基去污剂的溶液裂解，可克服这一不足，含巯基去污剂可以在其后加入。PMSF 毒性大。AEBSF（Aminoethyl benzylsulfonyl fluoride 或Pefabloc SC丝氨酸蛋白酶抑制剂）使用浓度最高为 4 mM。AEBSF在抑制活性上与PMSF相近，但它更易溶于水且毒性较低。AEBSF 能诱导蛋白质修饰，可能会改变蛋白质的 pI 值。EDTA 或 EGTA 使用浓度 1mM 通过与维持蛋白酶活性所必需的金属离子发生螯合反应，抑制金属蛋白酶。多肽蛋白酶抑制剂（如亮肽素、抑肽素、抑肽酶、苯丁抑制剂等）?不可逆抑制剂?在有 DTT 存在下发生作用?在各种条件下、低浓度下即有活性 使用浓度 2-20g/ml。亮肽素（Leupeptin）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶。抑肽素（Pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶。抑肽酶（Aprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶。苯丁抑制剂（Bestatin）能抑制氨基酸多肽酶。多肽蛋白酶抑制剂：?价格昂贵?是小分子多肽，根据其分子大小能被第二向凝胶电泳分离，有可能出现在双向电泳结果图中。抑肽素（Pepstatin）在 pH 为 9时不起作用。TLCK、TPCK（对甲苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮,苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮）使用浓度 0.1-0.5mM。不可逆地抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶。苄脒（Benzamidine）使用