液相色谱常见问题解答HPLC_加拿大博朗科技.pdf

液相色谱常见问题解答液相色谱常见问题解答 加拿大博朗科技 万海滨 作者从事色谱分析的技术支持多年。以下是对于常见问题的一个总结.希望对从事色谱分析的同仁能有所帮助。如果您的问题在这里没有答案,可以给我们发个邮件。我们会尽力为您解答。1.在不能确定用什么色谱柱合适时在不能确定用什么色谱柱合适时,应该先试用哪种柱子应该先试用哪种柱子?答:一般来说先试用 C-18或 ODS 柱(ODS 就是 C18的意思)。C18柱适用范围广,容易得到良好的分析和分离结果。而且 C18柱稳定性好,使用寿命长,性价比高。2.HPLC 系统的基本构成是什么系统的基本构成是什么?答:能正常工作的 HPLC 系统必须包括:进样器、泵、检测器、和数据处理器(电脑和软件)。要想得到更好的分析结果,还可以再加上脱气机和柱温箱。HPLC 系统的配置方法基本上分两种:一是将所有的配件整合在一起;另一种是模块化设计,各个配件模块可以随意组合。3.HPLC 的品牌和型号众多的品牌和型号众多,哪一种最适合我呢哪一种最适合我呢?答:虽然仪器指标和价格很重要,但它们并不是唯一的决定因素。许多 HPLC的使用者觉得这些指标的意义很难理解;有的销售人员给出的指标甚至具有误导性。因此,您还可以参考考虑以下几个因素:1)别的用户意见;2)亲手试用仪器或参加仪器实际演示;3)经销商的售后服务能力;4)仪器维护费用;5)将来仪器能否升级。4.进样器有哪些重要指标进样器有哪些重要指标?答:进样器的重要指标包括:重复进样的重现性、进样范围以及线性进样范围、和交叉污染。当您只想用 12个标准溶液制作标准曲线时,或者样品的浓度范围很大时,进样器的线性范围就显得尤其重要。进样交叉污染对痕量分析结果的可靠性至关重要;有时侯甚至需要在每一次进样前后,都运行复杂的清洗程序以克服交叉污染。5.高压梯度泵和低压梯度泵有何不同高压梯度泵和低压梯度泵有何不同? 答:在低压梯度泵系统中,不同的流动相先经过混合阀混合后才进入泵头。低压梯度泵系统比较经济,因为它只有一个泵头。您可以使用多种流动相,成本不会太高。在高压梯度泵系统中,不同的流动相由不同的泵头输送,然后在泵出口处混合。它提供了比低压梯度泵快得多的梯度,这是因为溶剂的混合点非常接近柱头的缘故。梯度反应的快慢可以用滞后体积来衡量。高压梯度泵的滞后体积在 50 300 微升之间,而低压梯度泵的滞后体积可以是前者的 23 倍。当分析时间短或者流速很低时,一个小的滞后体积是非常重要的。如果滞后体积太大,就无法得到重现性好的淋洗梯度;因为设定的梯度尚未到达柱头前,分析运行已经完成。6.恒流恒流(Isocratic)泵有哪些重要指标泵有哪些重要指标?答:恒流泵的指标包括:最大工作压力、流速范围、流速的重现性和准确度、压力波动、压力监测与过压停机。7.梯度泵有哪些重要指标梯度泵有哪些重要指标?答:梯度泵的指标包括:最大工作压力、流速范围、流速的重现性和准确度、梯度的重现性和准确度、滞后体积、压力波动、压力监测与过压停机。8.在线脱气机是必须的吗在线脱气机是必须的吗?答:永久气体在不同的溶剂中溶解度不同。当不同的溶剂在线混合时,溶解于原溶剂中的气体会因在混合溶剂中的溶解度不同而释放出来。作为证明,您可以做一个小实验:加一些水到甲醇中 您会看到许多气泡冒出来了。如果 HPLC使用的是低压梯度泵,这些气泡会影响泵头的工作和使基线噪音增大,并且导致保留时间的改变。因此在线脱气机是必须的。对于高压梯度泵来说,因为液体的混和是在经过泵之后,气泡的影响要小一些。如果条件允许,还是建议使用在线脱气,有助于降低基线噪音。如果使用的是恒流泵,脱气机就不是那么必须了。因为在真空过滤溶剂时,已经将大部分的气泡除去。9.HPLC 检测器有哪几种检测器有哪几种?答:现有的检测器有:UV检测器、荧光检测器、电化学检测器(包括极谱、库仑、和安培检测器等)、电导检测器、示差折射率检测器、蒸发光散射检测器、手性检测器、放射性同位素检测器和质谱检测器。 10.如何选择合适的如何选择合适的 HPLC 检测器检测器?答:检测器的选择要依据分析的对象和目的来确定。包括分析物的类型与含量、检测的灵敏度和选择性、是否需要化合物分子结构的信息等。UV检测器是性能最可靠和应用最广的检测器。如果分析物在 200纳米以上有吸收,UV 检测器可谓最佳之选。而对于某些大的芳环类化合物(如多环芳烃),选用荧光检测器可能将检测灵敏度提高 10100 倍。电化学检测器用于易发生电化学氧化还原反应的化合物;例如酚类、芳香胺类、和一些碳水化合物。因为选择性强,所以对上述化合物的检测灵敏度要高于UV检测器。但是,由于电极与柱流出液直接接触并与其中的化合物发生反应,其电化学响应可能不如 UV检测器那样稳定。电导检测器也是一种电化学检测器,它是离子色谱常用的检测器;主要用于测定无机阴阳离子,和部分极性有机物(如一些羧酸)等。示差折射率检测器可检测任何一种化合物,但是它的灵敏度要比 UV 检测器低100 1000 倍。它的另一个应用限制是不能进行梯度淋洗。因此,示差检测器主要用于弱紫外吸收的有机化合物;例如小分子有机酸、碳水化合物、和一些聚合物的检测。蒸发光散射检测器的应用范围与示差检测器相近,但它可以用于梯度淋洗。它的主要限制因素是需要使用大量的氮气来蒸发掉流动相。质谱检测器的应用越来越广泛,尽管它的价格比其它种类的检测器高 1020倍。它是一种兼具高特异性和高灵敏度的通用型检测器。与传统检测器相比,它在定性和定量方面都有很大的优点。它不仅能够给出普通色谱图,而且可以提供化合物的分子结构信息。11.如何选择紫外检测器的流通池如何选择紫外检测器的流通池?答:如果流通池过大,两个相邻的峰有可能在流通池中混合在一起;如果流通池太小,到达光检测元件的光太少而可能使噪音过高。较高的柱前压也会限制流速的范围从而影响流通池的选择。我们可以根据信号峰的大小来选择流通池。如果峰型狭窄,需要的流通池就小。一般来说,流通池的体积应该不大于峰体积的 1/3。譬如在峰宽是 0.1分钟时的流通池体积:如果流速为 1毫升/分钟,则不应该大于 33微升;如果流速为0.01 毫升/分钟则约为 0.3微升。12.如何选择相似的如何选择相似的 C18 柱柱? 答:不同厂家提供的 C18柱或 ODS柱的 HPLC谱图差别可能相当大;其原因是所用硅胶的性质、碳覆盖率和表面积等差别都很大。如果要想在同样的条件下得到相同的谱图,就要用同一厂家的产品。如果想要试用性质类似的 C18柱,可以选择硅胶的性质、碳覆盖率和表面积都很接近的柱子。13.怎样选择保护柱怎样选择保护柱?答:保护柱的体积应该小于分析柱的十分之一;柱内填料也要与分析柱类似。如果做不到,可以选择保留能力比分析柱弱一些的保护柱。14.色谱柱的重要指标有哪些色谱柱的重要指标有哪些?答:这些指标包括:柱效、惰性、重现性、耐用性和 pH范围,以及不同批次的色谱柱之间分析结果的重现性。15.怎样选择手性柱怎样选择手性柱?答:一对手性分子能否被某一手性柱分开是很难说的。因此,最好的方法就是查找文献看有无现成的方法,或者将样品送到手性柱厂家做试分离。16.封尾型反相色谱柱有什么优越性封尾型反相色谱柱有什么优越性?答:当硅胶表面键合了 C18或者 C8等基团后,硅胶表面仍然有残存的硅羟基(SiOH)。这些硅羟基可能同离子型的化合物发生二级反应,导致峰型不对称或者拖尾。特别是当流动相中含有金属离子,或者是在分析分离碱性化合物的情况下,二级反应尤为严重。当用小分子硅烷将裸露的硅羟基键合封尾后,二级反应即被大大降低。但是,封端基团在酸性的条件下容易水解;因此,封尾柱不宜在 pH3的情况下使用。17.怎样延长色谱柱的使用寿命怎样延长色谱柱的使用寿命?答:流动相和样品应事先过滤;确认流动相的 pH范围在色谱柱的规定工作范围之内。如果色谱柱有一段时间闲置不用,应该用甲醇或乙腈做最后清洗。18.在反相液相色谱中在反相液相色谱中,为什么乙腈和甲醇是最常用的流动相为什么乙腈和甲醇是最常用的流动相?答:因为乙腈和甲醇可以和水以任意比例混合。而且在紫外测定范围内,乙腈的透明度很高;甲醇虽然有吸收,但它是常用的样品溶剂,流动相和溶剂一致时可以减少背景的吸收。此外,它们也容易得到。19.用乙腈和甲醇做流动相有何不同用乙腈和甲醇做流动相有何不同? 答:乙腈在近紫外区(200210 纳米)几乎没有吸收;如果分析物(如小分子有机酸)在这一波长段有吸收的话,乙腈将是最佳的选择。乙腈也非常适用于高流速或柱子部分堵塞时的情形,因为用乙腈时的柱压比用甲醇时低的多。甲醇最大的优势是价格低廉;而且它比乙腈稳定。当乙腈长时间暴露于常见光下时,有可能形成聚合物并堵塞 HPLC的阀和过滤头。因此,乙腈最好盛放于棕色的玻璃中。20.正相正相 HPLC 和反相和反相 HPLC 有何不同有何不同?答:在反相 HPLC系统中,流动相是极性的,色谱柱填料则是非极性的。所以,极性强的化合物比极性弱的先被冲洗出色谱柱。而正相 HPLC的情况则完全相反 色谱柱填料是极性的,而流动相是低极性的;弱极性的的化合物较快被洗出。目前应用最多的是反相 HPLC,因为它的应用范围广,结果重现性好,溶剂也容易处理。而正相 HPLC的保留时间易改变,这是由于水分被硅胶填料慢慢吸附所造成的。正相 HPLC难以做梯度洗脱。但是,正相 HPLC 在异构体和弱极性化合物的分离上效果不错,而这正是反相 HPLC 的弱项。21.哪一种参数能最好的反映工作中的哪一种参数能最好的反映工作中的 HPLC 的仪器状态的仪器状态?答:泵压。它反映了色谱柱和整个 HPLC系统的状况。压力过低(譬如50 巴),可能是泵入口处堵塞,系统内有气泡,或者进样阀出了故障。要养成随时注意泵压的好习惯。