液相色谱仪器基本操作_大连依利特公司.pdf

1High Performance Liquid Chromatography maitenances大连依利特分析仪器有限公司讲演者：李炳源液相色谱仪器基本操作液相色谱仪器基本操作HPLC常规操作常规操作1.开启HPLC系统各个设备的电源2.准备流动相3.色谱泵排气泡4.流动相平衡色谱系统5.准备样品6.编制仪器方法,开始实验1.开启HPLC系统各个设备的电源2.准备流动相3.色谱泵排气泡4.流动相平衡色谱系统5.准备样品6.编制仪器方法,开始实验2开启HPLC系统各个设备的电源开启HPLC系统各个设备的电源确保仪器接地良好电源电压稳定确保仪器接地良好电源电压稳定按各部件功率大小顺序开机各部件完成自检后，打开计算机，启动色谱工作站。色谱工作站与各色谱仪部件建立正常通信、管理系统色谱工作站正常通信管理色谱工作站正常通信管理3流动相制备流动相制备色谱柱对流动相的要求色谱柱对流动相的要求 过滤除去微粒过滤除去微粒 纯度的要求纯度的要求 超纯水，超纯水，有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含量尽可能低)，有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含量尽可能低)，缓冲液的pH值，在填料的允许范围(一般在pH2-8)内缓冲液的pH值，在填料的允许范围(一般在pH2-8)内 缓冲液（盐）的浓度不要太高(缓冲液（盐）的浓度不要太高(100mM)流动相对样品的溶解度流动相对样品的溶解度 调整有机溶剂和水的比例调整有机溶剂和水的比例 最好用流动相溶样最好用流动相溶样过滤去除微粒过滤去除微粒预防：预防：-系统损伤系统损伤-系统堵塞 压力过高系统堵塞 压力过高4过滤膜选择与使用过滤膜种类：过滤膜种类：水膜：醋酸纤维、纤维素,不适用于有机溶剂不适用于有机溶剂有机膜：聚四氟乙烯滤膜：疏水性膜，耐强酸、强碱性溶液化学兼容性好，适用于所有溶剂，甲醇活化后可用少量水相甲醇活化后可用少量水相尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺不适用于二甲基甲酰胺过滤膜规格过滤膜规格孔径：0.22m 0.45 m尺寸：样品过滤：13mm 30mm 溶剂过滤：60mm过滤器：过滤器：溶剂过滤器样品过滤器C18柱硅胶基质碱性溶解柱硅胶基质碱性溶解硅胶快速溶解硅胶快速溶解严重的柱失效严重的柱失效柱寿命短暂柱寿命短暂5调整有机溶剂和水的比例调整有机溶剂和水的比例溶剂组成每变化溶剂组成每变化1%，保留时间变化，保留时间变化5%到到15%有机相比例高运行时间短有机相比例低运行时间长有机相比例高运行时间短有机相比例低运行时间长40ml水水60ml甲醇甲醇流动相：流动相：V/V：60/40甲醇水配制甲醇水配制溶解样品最好用流动相溶解样品最好用流动相6液相色谱仪器对流动相的要求液相色谱仪器对流动相的要求 与检测器匹配与检测器匹配 脱气脱气 避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统）避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统）防止细菌的生长防止细菌的生长1%0.075%0.2%0.0019.999042P1201压力波动压力波动流量精确度流量精确度流量准确度流量准确度流量范围流量范围（mL/min）压力范围压力范围型号型号P1201液相色谱系统液相色谱系统优异的性能指标优异的性能指标优异的性能指标优异的性能指标流量偏差流量偏差0.5%，峰面积偏差，峰面积偏差2%流动相脱气 一流动相脱气 一-确保流量稳定必不可少的措施确保流量稳定必不可少的措施7流动相脱气 二流动相脱气 二基线漂移与基线噪音基线漂移与基线噪音-确保信号稳定必不可少的措施确保信号稳定必不可少的措施-确保分析灵敏度必不可少的措施确保分析灵敏度必不可少的措施MinutesColumn-Waters PAH Column,27 CEluent A:WaterEluent B:AcetonitrileGradient:60%B to 100%B usingcurve 9 in 12 minutesHold 11 minutesBack to initial conditionsFlow Rate 1.2 ml/minInjection:20ulTime programmedwavelength changes20.521.022.01000 MV脱气未脱气脱气未脱气Breeze with Fluorescence1231.Benzo(b)flouranthene 400 ppb2.Benzo(k)fluoranthene-200 ppb3.Benzo(a)pyrene-200 ppb流动相脱气 三流动相脱气 三8柱头形成死体积-Channeling填料塌陷填料塌陷-保护色谱柱必不可少的措施保护色谱柱必不可少的措施流动相脱气 四流动相脱气 四等度分离条件下的等度分离条件下的“不明不明”宽峰也可能来自于样品中氧气和甲醇的复合物(特别是在210nm条件下)，如果脱气充分的流动相则不会发生这种问题宽峰也可能来自于样品中氧气和甲醇的复合物(特别是在210nm条件下)，如果脱气充分的流动相则不会发生这种问题-防止鬼峰产生防止鬼峰产生复合物复合物流动相脱气 五流动相脱气 五9常用流动相脱气的方法一常用流动相脱气的方法一超声波振荡超声波振荡 简单，效果不够理想简单，效果不够理想 每次脱气有效时间每次脱气有效时间4小时小时 不方便不方便脱气方法：脱气方法：溶剂瓶放入超声波脱气槽溶剂瓶放入超声波脱气槽纯溶剂超声纯溶剂超声20分钟分钟混合溶剂超声混合溶剂超声5分钟或更短分钟或更短常用流动相脱气的方法二常用流动相脱气的方法二氦气喷雾脱气氦气喷雾脱气 脱气效果好，流动相获得惰性气体保护，可保持在线连续脱气，多用于低压梯度脱气效果好，流动相获得惰性气体保护，可保持在线连续脱气，多用于低压梯度 但成本高但成本高脱气方法：脱气方法：在溶剂中置入氦气喷雾器，仪器控制氦气流量100ml/min 15分钟，以30ml/min流量维持。甲醇水梯度分析推荐50ml/min在溶剂中置入氦气喷雾器，仪器控制氦气流量100ml/min 15分钟，以30ml/min流量维持。甲醇水梯度分析推荐50ml/min10常用流动相脱气的方法三常用流动相脱气的方法三在线脱气机（in-line degasser)在线脱气机（in-line degasser)智能控制，无需额外操作、很方便，成本低，脱气效果明显优于其它方法，适用于多元低压梯度体系。智能控制，无需额外操作、很方便，成本低，脱气效果明显优于其它方法，适用于多元低压梯度体系。方法：方法：开机，真空泵指示灯呈绿色后，用新流动相替换脱气机中旧液体，流动相流量为0，保持10分钟即可。开机，真空泵指示灯呈绿色后，用新流动相替换脱气机中旧液体，流动相流量为0，保持10分钟即可。色谱泵的排气操作色谱泵的排气操作执行排气泡操作：每次开机泵压力跳动超过50-100Psi，怀疑有气泡更换新流动相方法：方法：泵输液管路与系统断开，大流量冲洗置换泵内液体11P1201泵正面图泵正面图放空阀放空阀泵头泵头泵杆清洗泵杆清洗VFD真空数码管真空数码管实验样品的制备实验样品的制备 液相色谱对样品(包括标样)制备的要求:液相色谱对样品(包括标样)制备的要求:必须能溶于流动相必须能溶于流动相样品溶液要过滤除去微粒及杂质样品溶液要过滤除去微粒及杂质了解样品对色谱柱的基质/填料是否有破坏作用了解样品对色谱柱的基质/填料是否有破坏作用12塔板数是反映色谱柱及仪器性能状态的关键参数塔板数是反映色谱柱及仪器性能状态的关键参数A A12,00012,000相同色谱柱相同色谱柱仪器仪器A：谱带展宽较小（谱带展宽较小（70L）测出的塔板数较高（）测出的塔板数较高（12,000）仪器仪器B：谱带展宽较大（谱带展宽较大（130L）测出的塔板数较低（）测出的塔板数较低（7,000）塔板数：柱效测定结果塔板数：柱效测定结果70007000谱带展宽谱带展宽连接适当连接不妥色谱柱连接不当引起谱带展宽连接不妥，造成漏液色谱柱连接不当引起谱带展宽连接不妥，造成漏液色谱柱安装不当死体积增大色谱柱安装不当死体积增大130.0090.0090.0200.0200.0400.040 连接管线的内经对系统谱带展宽的影响 注：过长的管线亦会造成较大的谱带展宽样品谱带在管线内发生了扩散色谱柱连接不当死体积增大色谱柱连接不当死体积增大用0.04内径的管路连接时测柱效的色谱图：柱效：柱效：4000用0.009内径的管路连接时测柱效的色谱图：柱效：柱效：1,1000注：使用相同色谱柱注：使用相同色谱柱小的连接管内径获得高柱效小的连接管内径获得高柱效 在色谱柱与进样器之间使用不同内径的管线14通用色谱柱接头正确使用将刃环拉后足够距离将刃环拉后足够距离进样器的使用进样器的使用 进样器的种类:进样器的种类:手动进样器7725i手动进样器7725i 自动进样器。自动进样器。进样器与系统的连接：进样器与系统的连接：0.02吋吋0.007吋吋2315正确的进样方式正确的进样方式1 进样阀在进样状态进样状态(INJECT)将微量进样器插入进样阀的导针孔.2 将进样阀手柄转到取样状态取样状态(LOAD),推进样品.观察工作站准备就绪,3 将进样阀手柄转到进样状态进样状态(INJECT).4 拔出微量进样器.注：注：使用专用的液相注射器进样使用专用的液相注射器进样22号针外径号针外径 0.7mm，长，长5.1cm（2吋），平头。吋），平头。LoadInject部分进样法与完全进样法部分进样法与完全进样法16进样针与进样阀的清洗进样针与进样阀的清洗每次进样前应将微量注射器清洗干净每次进样前应将微量注射器清洗干净,防止样品间交叉污染防止样品间交叉污染,影响实验结果影响实验结果根据需要清洗进样阀：根据需要清洗进样阀：进样进样10-20次清洗次清洗每天工作结束要清洗每天工作结束要清洗流动相含盐，用水冲洗进样口，同时转动进样阀数次，每次数毫升。流动相含盐，用水冲洗进样口，同时转动进样阀数次，每次数毫升。检测器的启动操作检测器的启动操作 连通流路：连通流路：色谱柱出口接检测器入口色谱柱出口接检测器入口 用细管(0.007)无死腔体积连接用细管(0.007)无死腔体积连接检测器出口用适当的管路(内径,长度)通向废液瓶检测器出口用适当的管路(内径,长度)通向废液瓶 开启电源开关后,需待检测器通过自检后,才能被软件控制开启电源开关后,需待检测器通过自检后,才能被软件控制 通流动相平衡至少30分钟后才能正常工作通流动相平衡至少30分钟后才能正常工作17检测器的使用和保养检测器的使用和保养 如长时间不用检测器可以关掉光源灯(UV,FL)如长时间不用检测器可以关掉光源灯(UV,FL)仅在4小时以上不用时,才需关灯仅在4小时以上不用时,才需关灯频繁开关灯也会影响灯寿命频繁开关灯也会影响灯寿命 不要让缓冲液长期停滞在检测池内不要让缓冲液长期停滞在检测池内用纯水冲洗用纯水冲洗保存在纯甲醇中保存在纯甲醇中 示差检测器及荧光检测器若与其它检测器串联使用,应将此两种检测器串在其它检测器的后面示差检测器及荧光检测器若与其它检测器串联使用,应将此两种检测器串在其它检测器的后面