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淡水渔业，2 0 2 3，53(4）：7 2-8 1Freshwater Fisheries2023年7 月Jul.2023不同浓度硫酸新霉素对生物絮团氨氮转化速率及抗生素抗性基因的影响杨逸尊，罗国芝1.2.3，谭洪新1.2.3（1.上海海洋大学，上海水产养殖工程技术研究中心，上海2 0 130 6；2.上海市水产动物良种创制与绿色养殖协同创新中心，上海2 0 130 6；3.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海2 0 130 6)摘要：为探究不同浓度硫酸新霉素对于生物絮团处理氨氮及抗生素抗性基因的影响，本实验对生物絮团水质及絮团指标、水体中抗生素含量和生物絮团中6 种抗生素抗性基因的含量进行了检测。结果显示：在氨氮转化的速率上，初次加药连续监测显示未添加组（A组）、0.5mg/L硫酸新霉素组（B组）、1mg/L硫酸新霉素组（C组）和3mg/L硫酸新霉素组（D组）的氨氮去除速率分别为（3.8 8 0.0 2）mgTAN/（g T SSh）、（2.2 2 0.0 3）mgTAN/(g TSSh)、（2.17 0.0 4）m g T A N/(g T SSh)和(1.7 2 0.0 2）mg TAN/(g TSSh)，氨氮去除速率A组B组 C组 D组。而间隔一个休药期(50 0 d）的第二次加药连续监测显示4个组的氨氮去除速率分别为(2.99 0.08)mg TAN/(g TSS h)、（2.98 0.0 3)m g T A N/(g T SS h)、（2.97 0.0 8)m g T A N/(g T SS h)和（5.10 0.0 3）m g T A N/（g T SSh），氨氮去除速率D组 A组 B组 C组。对水体抗生素检测发现，两次检测都未能测出水体中硫酸新霉素的存在。对抗生素抗性基因检测发现硫酸新霉素对于aph(3）-Ia、a p h(3）-a、a a c(6 ）Ib、a a c(3）I这四种基因具有较大的选择和富集的能力。但B组的各抗生素抗性基因的拷贝数均为最低。实验结束后对4个实验组的异养菌菌落数量进行检测，发现了B组的菌群群落数量相较其他3组有明显提升。比较结果表明硫酸新霉素在第一次加药时随着浓度提高，对氨氮转化速率的影响越大。但在第二次加药时，添加的硫酸新霉素浓度对氨氮转化速率无负面影响，而高浓度的硫酸新霉素可以促进生物絮团氨氮的转化，但会显著增加抗生素抗性基因的拷贝数。关键词：生物絮团；氨氮转化速率；硫酸新霉素；抗生素抗性基因中图分类号：S949文献标识码：A文章编号：10 0 0-6 90 7-(2 0 2 3)0 4-0 0 7 2-10近几年来，抗生素抗性基因引起了越来越多的关注1,2 ，而水产养殖行业被越来越多地认为是抗生素抗性细菌的重要来源和抗生素抗性基因的贮存库3。宏基因组学分析表明，抗生素选择压力显著影响了抗生素抗性基因谱的组成，显著促进了抗生素抗性基因的富集，包括相应的和非相应的抗生素抗性基因类型4。形成各种抗生素抗性基因的共存组合，共同选择多种抗生素耐药性。ZHAO等5 发现在同一种抗生素选择压力下，非对应抗生素抗性基因的丰度也升高，表明抗生素具有显著的共选择效应，表现出抗生素的特异型生物絮凝技术（biofloc technology,BFT）作为一种新兴的养殖技术，其主体生物絮团主要是水体中的大量微生物、饲料粪便残渣、有机碎屑和一些聚合物通过复杂作用相互絮凝而成的细菌团6 。目前，国内外对于抗生素在生物絮凝养殖技术中的使用研究较少，而硫酸新霉素在各种养殖及水处理系统中的使用也鲜有关注，故本实验选取了硫酸新霉素这种常用渔药，来探究不同浓度硫酸新霉素对生物絮团水质处理能力及抗生素抗性基因的影响。水体中细菌对硫酸新霉素产生耐药性共有三种途径7 ，其中最具普适性的就是由细菌自身产生修饰氨基糖苷类抗生素的酶，而这种修饰氨基糖苷类的酶又可以细分为三种，一种是以aph基因为代表的对氨基糖苷磷酸转移酶进行编码的抗生素抗性基因，一种是以aac基因为代表的对氨基糖苷乙酰转收稿日期：2 0 2 2-0 6-2 2；修订日期：2 0 2 3-0 3-17资助项目：上海市科学技术委员地方院校能力提升项目（2 30 10 50 2 30 0）第一作者简介：杨逸尊（1997），男，硕士研究生，专业方向为零交换水养殖系统研究。E-mail：8 2 0 7 9447 0 q q.c o m通讯作者：罗国芝。E-mail：g z h lu o s h o u.e d u.c n第4期移酶进行编码的抗生素抗性基因，最后一种就是以ant 基因为代表的对氨基糖苷核苷转移酶进行编码的抗生素抗性基因。本实验选取了5种硫酸新霉素抗性基因，包含了三种类别的氨基糖苷修饰基因，为用药后抗性基因的积累给出数据支持，也为抗生素在生物絮凝养殖技术中的使用提供参考。1材料与方法1.1实验装置与材料实验在上海海洋大学循环水养殖与工程实验室内进行，实验室为封闭空间，温度设定为2 5。反应容器为10 L透明圆柱形塑料桶，使用功率为37 0W的气泵（森森集团股份有限公司，型号：HG370）进行曝气，气石为球形石英曝气石，置于反应容器中心使水体和空气充分且均匀接触。实验用水经过提前2 4 h充分曝气以去除水中残留氯。絮团取自上海海洋大学循环水养殖与工程实验基地未添加过抗生素的罗非鱼养殖池，养殖密度约为2 0kg/m。添加的碳源为一水合葡萄糖（C,HizO。H,0，分析纯，含碳量为36.4%）；使用的饲料为通威鱼用膨化配合饲料（江苏省宿迁市沭阳县扎下镇，粗蛋白为31.0%，碳含量为37.3%），实验所用氯化铵（分析纯，纯度99.5%）及所有水质检测使用试剂均采购自国药集团化学试剂有限公司，所用抗生素均采购自合肥中龙神力动物药业有限公司。1.2实验设计与管理实验分为4组，每组三个平行，A组作为对照组不添加硫酸新霉素，B组添加0.0 2 g硫酸新霉素（休药期50 0 d），C 组添加0.0 4g硫酸新霉素，D组添加0.12 g硫酸新霉素。添加的药量根据硫酸新霉素的推荐使用量计算，其中B组为推荐使用量的一半，初始浓度为0.50 mg/L，C 组为推荐使用量，初始浓度为1.0 0 mg/L,D组为推荐使用量的3倍，初始浓度为3.0 0 mg/L。4组接种絮团后调节TSS至315 330 mg/L，水体体积为8 L。第一次加药连续检测每组投加10 mg/L氨氮（氯化铵溶液），实验期间反应器加盖并及时补充因蒸发流失的少量水分。实验开始时水体碱度为355375mg CaCOg/L，当低于150 mg CaCOg/L时添加适量小苏打以维持碱度。当所有组氨态氮以及亚硝态氮浓度降低并维持在0.5mg/L以内时视为第一次连续监测实验结束。维持系统培养直到休药期结束，加药进行第二次连续监测。杨逸尊等：不同浓度硫酸新霉素对生物絮团氨氮转化速率及抗生素抗性基因的影响1.3水质及絮团指标的检测方法水质指标检测先用注射器取10 mL絮团水样，再通过0.2 2 m针头滤器（上海航欧机电设备有限公司,型号：CollinsMCE0.22m）过滤后进行检测。检测方法见表1，检测仪器为分光光度计（上表1水质指标检测方法Tab.1 Water quality index detection method指标DO温度pHTANNO,-NNO;-NTSSVSSDOCTNDTNFV30 min碱度粗灰分粗脂肪粗蛋白73第二次加药连续检测每组投加10 mg/L氨氮（氯化铵溶液），实验期间反应器加盖并及时补充因蒸发流失的少量水分。实验开始时水体碱度为265285 mg CaCOg/L，当低于150 mg CaCO,/L时添加适量小苏打以维持碱度。当所有组氨态氮以及亚硝态氮浓度降低并维持在0.5mg/L以内时视为实验结束。絮团扩培实验前测定絮团的总悬浮固体（T SS）、30 分钟沉降体积（FV30min）、碱度、总氨氮（T A N）、亚硝态氮（NO,-N）、硝态氮（NO;-N）、溶氧（DO）、p H、温度、溶解性有机碳（DOC）、挥发性悬浮物（VSS）、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪等指标。实验开始后每两日测定所有组中 TAN、NO,-N、NO；-N和DOC 的浓度。实验结束后测定絮团TSS、FV30 mi n、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪、VSS 和水体中总异养细菌数量测量方法WTW全自动检测仪WTW全自动检测仪WTW全自动检测仪水杨酸钠法8 茶乙二胺法8 硫酸肼还原法8 重量法8 重量法9非色散红外线吸收法过硫酸钾氧化法8 过硫酸钾氧化法8 英霍夫管沉降酸碱指示剂滴定法重量法10 Floch 萃取法 元素分析仪74海优尼科仪器有限公司，型号：UV2000），总有机碳分析仪（岛津制作所,型号：TOC42 0 0），多参数手提测试仪（德国WTW，型号：Multi3430），105电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），碳氮元素分析仪（德国ElementarvariomaxCNS），马弗炉（协郝上海仪器科技有限公司，型号：SX2-4-10Y)。1.4石硫酸新霉素的检测水体中硫酸新霉素在第一次休药期结束和第二次加药3d后从各组实验水体中均匀抽取50 mL水样，通过0.2 2 m针头滤器过滤后通过冰袋运送至上海微谱化工技术有限公司进行检测。硫酸新霉素含量检测方法由LC-MS/MS外标法测定。液相型号为：Waters 1Cl a s s；质谱型号为：WatersTQS；色谱柱为：ACQUITY UPLcr HSS T3 1.8 m;柱温：35；进样量：5L；流动相为：0.1%甲酸水溶液和乙腈；流速：0.4mL/min。1.5生物絮团中抗生素抗性基因的采集与测定在第二次连续监测实验结束后从各组实验水体基因引物(5-3)F:GGCTTCGTGATGCCTGCTTint I 1R:CATTCCTGGCCGTGGTTCTF:ATGGACACAACGCAGGTCACaadBR:TTAGGCCGCATATCGCGACCF:ATGGGCTCGCGATAATGTCaph(3)-I aR:CTCACCGAGGCAGTTCCATF:TCTGAAACATGGCAAAGGTAGaph(3)-II aR:AGCCGTTTCTGTAATGAAGGAF:TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTAaac(6)-I bR:CTCGAATGCCTGGCGTGTTTF:TGAAACGCTGACGGAGCCTCaac(3)-IIR:GTCGAACAGGTAGCACTGAG1.7氨氮去除效率和氨氮去除速率及抗生素使用量计算公式NHt-N去除效率计算公式：R=100%(C;-C)/C;式中，R为NH-N的去除效率（%）；C;为初始的NHt-N质量浓度（mg/L)；C。为终末的NHt-N 质量浓度(mg/L)。NHt-N去除速率率计算公式：S=(C;-Cc)/(Tt)淡水渔业中均匀抽取150 mL水样，通过0.2 2 m滤膜抽滤后，将抽滤在滤纸上的絮团放进10 mL透明无菌离心管中，用干冰保存第一时间送至上海生工生物工程股份有限公司进行抗生素抗性基因的检测，实验所用引物通过PrimerPremier5.0软件设计，表2 为所用目的基因引物。1.6生物絮团中异养细菌的生物群落估算用稀释平板计数法来测定生物絮团中的异养细菌的群落数量。在对接种絮团扩培之前及扩培实验结束之后采集絮团水样。在无菌操作台中，取1mL均匀水样，根据菌群的大致数量用合适倍数的无菌生理盐水进行稀释。将各组稀释后的菌液用杀菌消毒后的干净三角玻棒均匀涂布在大豆酪蛋白琼脂培养基上（杭州百思生物技术有限公司）。将均匀涂布后的平板放入恒温生化培养箱中（上海精宏实验设备有限公司，型号：SHP-250），设定温度为35，培养时间为2 4h。最后对培养之后的菌落进行计数，菌落数（CFU/mL）为平板上所有菌落数量再乘以稀释倍数进行计算。表2 本实验所研究基因参考引物Tab.2 Reference primers for genes studied in this labTSSh)；C,为初始的NH-N质量浓度（mg/L)；C。为终末的NHt-N质量浓度（mg/L)；T 为絮团的TSS 浓度（mg/L)；t 为氨氮变化的时间（h）。抗生素使用量计算公式：M=pVM,/k式中，M为使用药物的质量（g）；p 为养殖水体密度（kg/m）；V为实验水体体积（L)；M 为抗生素药物使用剂量（g）；k 为药物有效成分含2023年长度/bp参考文献1461253413600582482370式中，S为 NHt-N的去除速率mg TAN/（g14第4期量(%）。1.8数据统计分析实验数据通过Excel2017软件进行记录和统计，由Origin Pro 2021和Graphpad Prism 9.0软件绘制相关图表。实验数值用平均值(MeanSD)形式表示，采用SPSS22统计软件对数据进行ANO-VA单因素方差分析，P0.05为差异性显著。Tab.3 Average,minimum and maximum values of water quality indicators in 4 groups before dosing水质指标DO/(mg/L)T/TAN/(mg/L)NO,-N/(mg/L)NO;-N/(mg/L)TN/(mg/L)TSS/(mg/L)FV 30mi/(mL/L)碱度/(mg CaCO,/L)注：同行数据上标不同表示组间存在显著差异（P B组 C组 D组。A组与其他三组去除速率有显著差异，B组和C组的去除速率无显著差异，D组与其他三组去除速率有显著差异。实验期间4个组亚硝氮的浓度变化如图1（b）杨逸尊等：不同浓度硫酸新霉素对生物絮团氨氮转化速率及抗生素抗性基因的影响实验期间水质及絮团变化在探究不同浓度硫酸新霉素对生物絮团氨氮转化速率和抗生素抗性基因累积的效果前，对各个实验组的水质指标进行检测并无显著差异，如表3所示。表3加药之前4个组水质指标平均值、最小值和最大值AC8.11 0.01 a8.12 0.01 a8.10、8.128.11、8.1325.30 0.10a25.40 0.10a25.20、2 5.4025.30、2 5.500.01 0.00a0.00a0.01、0.0 1 0.00、0.0 0 0.00a0.01 0.00 a0.00、0.0 00.01、0.0 196.12 1.86a92.88 1.89a93.50、9 7.6 590.75、95.35135.70 0.80a130.57 3.21 a134.78、136.7 2126.06、133.2 2315.00 3.00a315.00 2.00a312.00、318.0 0313.00、317.0 026.50 1.50a26.50 1.00a25.00、2 8.0 024.50、2 7.50355.00 12.50a373.00 11.50a343.00、36 7.0 0360.00、38 3.0 0所示，4个组的亚硝氮浓度变化趋势总体一致，在实验前4h处于上升阶段且在第4h达到峰值，第4h后A组和B组亚硝氮在第12 h下降到0.1mg/L的低浓度水平，C组和D组亚硝氮分别在第16和18 h下降到0.1 mg/L的低浓度水平。实验期间4个组硝态氮的浓度变化如图1（c）所示，4个组的硝态氮浓度在实验结束后的浓度较实验开始时均有下降，除C组外其余3组下降幅度不大，均在3.0 0 mg/L以内。实验期间4个组DOC浓度变化如图1（d）所示，4个组的DOC均呈现下降趋势，且总消耗量752结果与分析2.1BD8.11 0.01 a8.14 0.01 a8.10、8.128.13、8.1525.30 0.10a25.60 0.10a25.30、2 5.4025.50、2 5.7 00.01 0.00a0.00a0.01、0.0 1 0.00、0.0 00.01 0.00a0.00*0.01、0.0 10.00、0.0 0104.63 2.76 a93.57 1.33 a100.75、10 6.9091.80、9 5.0 0129.46 2.02 a133.39 0.54a127.61、132.2 8132、7 2、134.0 6325.00 2.00a315.00 1.00a323.00、32 7.0 0314.00、316.0 026.50 1.20a26.50 0.00a24.80、2 7.7 026.50、2 6.50356.00 7.50a369.00 5.50a348.00、36 7.0 0365.00、37 4.0 076均在96.0 0 至99.0 0 mg/L之间，各组无显著差异。淡水渔业2023年(a)10元手(1/)/8(b)0.5(1/8)/0.4T64120.3T0.240.1002110(c)105959085T800Fig.1 Changes of tristate nitrogen(a,b,c)and dissolved organic carbon(d)in the four groups during the first dosing.在第一次连续监测前对4个组的TSS 浓度进行了检测，4组浓度分别为（315.0 0 3.0 0）mg/L、(315.002.00）m g/L、（32 5.0 0 2.0 0）m g/L和（315.0 0 1.0 0）mg/L。各组无显著差异，连续监测结束后4组TSS浓度如图2 所示，各组TSS浓度较实验开始前均有所下降，A组降至（2 10.0 0 14.51）mg/L；B组降至（2 43.3318.93）mg/L;C组降至（2 52.0 0 2 6.7 3）mg/L；D 组降至(238.6714.64）m g/L。下降量A组 D组 B组 C组，A组与其余3组有显著性差异。第二次加药连续检测水质变化如图3所示,其中各组氨态氮变化如图3（a)所示。4个组的氨态氮去除效率分别为99.7 0%、99.6 8%、99.7 3%和99.79%。4个组的氨态氮去除速率分别为（2.990.08)mg TAN/(g TSSh)、(2.98 0.0 3)m g T A N/0.046248101214 161820时间/h3100F806040120068101214161820时间/hA组无添加图1第一次加药时4个组中三态氮(a,b，c）及溶解性有机碳(d)的变化图C组D组图2第一次加药结束4个组TSS浓度变化图Fig.2Changes of TSS concentration in 4 groupsat the end of the first dosing0120+(d)024B组 0.5 mg/L C组 1.0 mg/L一A组对照组B组 0.5 mg/L300C组 1.0 mg/LD组 3.0 mg/L(1/Bu)/SS2001000A组B组2468101214161820时间/h168101214161820时间/hD组 3.0 mg/L第4期(a)10#8(/B)6420065(c)60O4540350Fig.3 Changes of tristate nitrogen(a,b,c)and dissolved organic carbon(d)in the four groups during the second dosing(g TSS h)、(2.97 0.0 8)m g T A N/(g T SS h)和（5.10 0.0 3）mg T A N/（g T SSh），氨态氮去除速率D组 A组 B组 C组。D组与其他三组去除速率有显著差异，A组、B组和C组的去除速率无显著差异。实验期间4个组亚硝氮的浓度变化如图3（b）所示，4个组的亚硝氮浓度变化趋势总体一致，在实验前4h处于上升阶段且在第4h达到峰值，在第10 h下降到0.0 2 mg/L以下的低浓度水平。4个组硝态氮的浓度变化如图3（c）所示，4个组的硝态氮浓度在实验结束后的浓度较实验开始时均有下降，但下降幅度均在2.0 0 mg/L以内。实验期间4个组DOC浓度变化如图3（d）所示，4个组的DOC均呈现下降趋势，且总消耗量均在90.0 0 94.0 0 mg/L之间，各组无显著差异。在第二次连续监测前对4个组的TSS浓度进行了检测，4组浓度分别为（331.30 7.59）mg/L、杨逸尊等：不同浓度硫酸新霉素对生物絮团氨氮转化速率及抗生素抗性基因的影响24时间/h24时间/h一A组无添加图3第二次加药时4个组中三态氮(a,b,c)及溶解性有机碳(d)的变化图B组 0.5 mg/LC组 1.0 mg/LD组 3.0 mg/L300(1/8)/XSSL2001000图4第二次加药结束4个组TSS浓度变化图Fig.4 Changes of TSS concentration in 4groups at the end of the second dosing770.357(b)0.30(1/)/0.250.20F0.150.100.050.00元6868B组 0.5 mg/L10100120(d)(1/)/1008060402000C组 1.0 mg/L(329.00 3.27）m g/L、（32 7.0 0 3.56）m g/L和（32 3.30 3.30）m g/L。各组无显著差异，连续监A组对照组400rA组B组C组D组224时间/h46时间/hD组 3.0 mg/L688101078测结束后4组TSS浓度如图4所示，各组TSS浓度较实验开始前均有所下降，A组降至（2 6 4.6 7 19.62)mg/L；B组降至(30 1.334.99）mg/L；C组降至（2 6 7.335.2 5）mg/L；D 组降至（2 6 2.6 74.99）m g/L。下降量D组 A组 C组 B组,B组与其余3组有显著性差异。各组连续检测后絮团组分如表4所示，絮团VSS/TSS 为 B 组 C 组 A组 D 组,B组与 C组与A、D 组呈显著差异。粗灰分则为D组 A组 C组B组，A组与D组无显著差异，其余各组间均有显著差异。粗蛋白各组无显著差异。粗脂肪 B组 C组 A组 D组，B组与其他各组呈显著差异。表4实验结束时絮团VSS/TSS、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪的含量Tab.4 Contents of floc VSS/TSS,crude ash,crudeprotein and crude fat at the end of the experiment%处理VSS/TSS组A61.25 1.08cB65.76 0.87aC62.76 0.98b 37.24 0.98bD60.98 1.6839.02 1.6829.01 0.78a 3.88 0.77b注：同行数据上标不同表示组间存在显著差异（P0.05）3106r8x105rintllaadB6x105210641051x106210500A组B组C组D组8x105raph(3)-Ila71056x1055x1054x10%L3104210411040淡水渔业2.2水体抗生素含量在休药期结束也就是第二次连续监测前和第二次连续监测结束后3d对水体中的硫酸新霉素进行检测，检测结果如表5所示。4个组前后两次均未在水体中检测到硫酸新霉素的存在，或低于检出值。表5休药期结束时4组水体硫酸新霉素含量Tab.5 The contents of neomycin sulfate in the fourgroups of water at the end of the withdrawal period组别第二次加药后三天A组N.D.B组N.D.C组N.D.D组N.D.注：N.D.表示未检出或低于检测方法最低检出值（D组 A组 B组；4个组 aadB的拷贝数分别为2.86 10 copies/mL、2.13 10 c o p i e s/mL、4.0 310copies/mL和6.17 10 copies/mL，拷贝数 D组 C组 A组 B组；4个组aph(3）-I a 的拷贝数分别为7.10 10 copies/mL、3.6 310 3c o p-ies/mL、3.0 1 10*c o p i e s/mL和1.0 3 10 copies/mL，拷贝数D组 C组 A组 B组；4个组aph(3）a 的拷贝数分别为3.4310 copies/mL、1.8 6 10 3 c o p i e s/mL、2.17 10 4 c o p i e s/mL和6.6 410 copies/mL，拷贝数D组 C组 A组 B组；4个组aac（6 ）I b 的拷贝数分别为5.50 10 copies/mL、3.2 510 c o p i e s/mL、2.3410copies/mL和4.0 0 10 copies/mL，拷贝数 D组 C组 A组 B组；4个组aac(3）的拷贝数分别为7.0 410 3copies/mL、6.0 0 10 3c o p i e s/mL、1.53 10*c o p i e s/mL和1.43 10 copies/mL,拷贝数D组 C组 A组 B组。2.4生物絮团中异养细菌生物群落数量如图6 所示，在连续监测实验结束后4个实验组与初始水样的异养菌生物群落数量相差较大，各组培养后菌群扩增量较大与初始组有显著差异。连续监测实验结束后，4个实验组的异养菌群落数量为B组 C组 D组 A组。其中B组与A组、C组、D组有显著差异，A组、C组和D组无显著差异。A组对照组B组0.5mg/L40C组1.0 mg/LD组3.0 mg/L30F20F100初始组A组B组C组ID组图6 第二次加药后初始和4个实验组的异养菌数量Fig.6The number of heterotrophic bacteria in theinitial and 4 experimental groups after the second dosing杨逸尊等：不同浓度硫酸新霉素对生物絮团氨氮转化速率及抗生素抗性基因的影响793讨论3.1不同浓度硫酸新霉素对生物絮团氨氮转化的影响通过第一次连续监测，直观地看出硫酸新霉素的添加会对水体氨氮处理速率产生影响，硫酸新霉素的浓度越高影响越大，第一次加药后的氨氮处理速率也就越低。但是通过一个休药期的培养后，水体中的菌群对硫酸新霉素有了明显的抗性，同样的浓度再次添加已经无法对氨氮处理速率产生负面的影响，反而在添加了较高浓度硫酸新霉素的D组中，较高浓度的硫酸新霉素在不影响亚硝氮和硝氮转化的情况下，促进了氨氮转化的速率。这和LI等15 使用四环素对生物膜系统对脱氮性能探究的结果相反。据推测，高浓度硫酸新霉素的选择使菌群多样性降低同时也对具有抗生素抗性的细菌大量富集，使之成为新的优势种。在适应高浓度抗生素环境后，相关菌群恢复了其生态功能，且菌群数量较加药前有所提升，最终使生物絮团对氨态氮的转化速率提高。3.2不同浓度硫酸新霉素在生物絮团中累积情况在对第二次连续监测前和第二次连续监测结束后3d的水体进行采集送样检测发现，水体中的抗生素含量低于检测阈值未能检出或者已经被分解甚至转移至絮团内部。这与LIANG等16 在研究通过生物膜法去除抗生素抗性基因的时候对于水体中硫酸新霉素去除率的结果相似。这说明了生物絮团在适应抗生素环境后，能够快速转移和代谢水体中的硫酸新霉素。不过这也反映出，水体中硫酸新霉素并不能维持在所使用浓度条件下。那么在生物絮团中使用抗生素时，浓度的选择要与常规养殖模式有所区别。3.3不同浓度硫酸新霉素对生物絮团抗生素抗性基因的影响在对第二次加药后的生物絮团进行抗生素抗性基因检测后，发现了硫酸新霉素的添加对于aph(3）-I a、a p h(3）-I a、a a c(6 ）-I b、a a c（3）这四种硫酸新霉素抗性基因具有较大的选择和富集的能力，尤其是 aph（3 ）l a、a p h（3）a 和ac(3）这三种基因随着硫酸新霉素浓度的增加，基因拷贝数成倍上涨，呈现显著的正相关。这与ZHAO等17 在活性污泥反应器中使用不同种类抗生素得出的结果相似。但是本实验80中添加了0.5mg/L硫酸新霉素的B组，在实验结束后的所有抗生素抗性基因均低于未添加抗生素的A组，这与ZHAO 等17 和WAN等18 的结论有所差异，推测原因可能是低浓度的硫酸新霉素对于絮团的选择压力较小，而B组的细菌群落数量有大幅增加，使对应的几种抗生素抗性基因相对丰度降低。参考文献：1 MCCOWAN E.Antibiotic resistance genes as emerging contami-nants:Studies in Northern Colorado J.Environmental Science&Technology,2007,41(7):2651-2652.2 GAO H,ZHANG L,LU Z,et al.Complex migration of antibiotic re-sistance in natural aquatic environments J.Environment Pollution.2017,232(1):1-9.3 ALEXANDRA,TOMOVA,LARISA,et al.Antimicrobial resistancegenes in marine bacteria and human uropathogenic Escherichia colifrom a region of intensive 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