氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座.pptx

第五章 氨基酸和蛋白质提取工艺特征l第二节 氨基酸提取工艺特征氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第1页一、氨基酸特征l因氨基酸分子较小，且有羧基、氨基，同时含有碱因氨基酸分子较小，且有羧基、氨基，同时含有碱性和酸性极性基团较多，所以性和酸性极性基团较多，所以它极性较大，能溶于它极性较大，能溶于水，不溶于有机溶剂。水，不溶于有机溶剂。因同时含有羧基和氨基，有因同时含有羧基和氨基，有酸碱两性性质，能与酸和碱形成不一样盐。当溶液酸碱两性性质，能与酸和碱形成不一样盐。当溶液pH发生改变时，溶液中离子状态也发生了改变。在发生改变时，溶液中离子状态也发生了改变。在电场中酸性溶液氨基酸则向阴极电泳，而在碱性溶电场中酸性溶液氨基酸则向阴极电泳，而在碱性溶液中则向阳极电泳，当溶液液中则向阳极电泳，当溶液pH值达一定时，氨基酸值达一定时，氨基酸不向任何电极移动，此时溶液不向任何电极移动，此时溶液pH值就是该氨基酸等值就是该氨基酸等电点。不一样氨基酸有不一样等电点，电点。不一样氨基酸有不一样等电点，在等电点时在等电点时氨基酸溶解度最低氨基酸溶解度最低，依据这种性质能够用电泳法分依据这种性质能够用电泳法分离氨基酸。离氨基酸。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第2页l氨基酸在适当条件下，能进行有机胺或有机酸几乎氨基酸在适当条件下，能进行有机胺或有机酸几乎全部反应。与普通酸和碱可生成稳定盐，大部分均全部反应。与普通酸和碱可生成稳定盐，大部分均能溶于水，但与重金属如铜、银、汞等制成络合物能溶于水，但与重金属如铜、银、汞等制成络合物不溶于水，也可利用这种性质来分离氨基酸。不溶于水，也可利用这种性质来分离氨基酸。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第3页二、氨基酸浸出二、氨基酸浸出l水浸出法：水浸出法：将中草药以粉碎机粉碎，装入将中草药以粉碎机粉碎，装入逆流浸出罐组每一个浸出罐中。用水做浸出逆流浸出罐组每一个浸出罐中。用水做浸出溶剂，最好在有搅拌条件下，加热进行逆流溶剂，最好在有搅拌条件下，加热进行逆流浸出。浸出。l稀乙醇浸出法：稀乙醇浸出法：将生药粉末装入逆流渗滤将生药粉末装入逆流渗滤浸出罐组每一个浸出罐中。以浸出罐组每一个浸出罐中。以70%乙醇进行乙醇进行渗滤浸出，先浸出溶液浓度较大，后浸出溶渗滤浸出，先浸出溶液浓度较大，后浸出溶液浓度较低。最好采取逆流渗漉浸出法，把液浓度较低。最好采取逆流渗漉浸出法，把出液系数控制在出液系数控制在5，能够得到很好浸出效果。，能够得到很好浸出效果。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第4页三、氨基酸分离三、氨基酸分离l水浸出液或稀乙醇减压浓缩后水溶液往往含有几水浸出液或稀乙醇减压浓缩后水溶液往往含有几个或十几个氨基酸，所以所得是总氨基酸，必须个或十几个氨基酸，所以所得是总氨基酸，必须进行分离纯化。普通采取以下纯化方法：进行分离纯化。普通采取以下纯化方法：l离子交换法离子交换法:这是分离氨基酸惯用方法。可直这是分离氨基酸惯用方法。可直接将水或稀乙醇提取物经过装有离子交换树脂交接将水或稀乙醇提取物经过装有离子交换树脂交换柱，带正荷氨基酸与树脂上换柱，带正荷氨基酸与树脂上-SO基吸附。因基吸附。因为氨基酸带正电荷随溶液为氨基酸带正电荷随溶液pH发生改变，同一氨发生改变，同一氨基酸在不一样基酸在不一样pH缓冲溶液中，以及不一样氨基缓冲溶液中，以及不一样氨基酸在同一酸在同一pH环境中，所带正电荷各不相同，与环境中，所带正电荷各不相同，与磺酸基吸附强弱也对应不一样。能够借助这种差磺酸基吸附强弱也对应不一样。能够借助这种差异，使氨基酸相互分离。异，使氨基酸相互分离。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第5页l成盐分离法成盐分离法:利用一些酸性氨基酸与一些金属利用一些酸性氨基酸与一些金属化合物，如氢氧化钡、氢氧化钙生成难溶性盐，化合物，如氢氧化钡、氢氧化钙生成难溶性盐，或某碱性氨基酸与普通酸生或某碱性氨基酸与普通酸生 成盐，从而与其它未成盐，从而与其它未成盐氨基酸分离。如南瓜子中南瓜子氨基酸是经成盐氨基酸分离。如南瓜子中南瓜子氨基酸是经过与过氯酸生成结晶性盐而分出。过与过氯酸生成结晶性盐而分出。l晶析法晶析法:利用不一样氨基酸等电点不一样，进利用不一样氨基酸等电点不一样，进行晶析结晶分离。比如在含有亮氨酸、异亮氨酸行晶析结晶分离。比如在含有亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸溶液，其和缬氨酸溶液，其pH值为值为1.52.0时，浓缩先晶时，浓缩先晶析出亮氨酸，它母液加盐酸后再浓缩晶析出异亮析出亮氨酸，它母液加盐酸后再浓缩晶析出异亮氨酸，最终母液中回收缬氨酸。氨酸，最终母液中回收缬氨酸。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第6页l四、氨基酸、肽判别反应四、氨基酸、肽判别反应l茚三酮茚三酮(Ninhydrin)反应：反应：全部全部a-氨基酸及含有氨基酸及含有a-氨基酸肽类和蛋白质都能和该试剂反应展现兰氨基酸肽类和蛋白质都能和该试剂反应展现兰色或兰紫色。必要时加热，反应可在滤纸上进行。色或兰紫色。必要时加热，反应可在滤纸上进行。l(2)吲哚醌吲哚醌(Isatin）试剂反应：）试剂反应：不一样氨基酸与不一样氨基酸与吲哚醌试剂反应，能显示不一样颜色。因为试剂吲哚醌试剂反应，能显示不一样颜色。因为试剂配制方法不一样，对同一个氨基酸所显示颜色也配制方法不一样，对同一个氨基酸所显示颜色也往往有差异。吲哚醌不但可用于氨基酸显色，而往往有差异。吲哚醌不但可用于氨基酸显色，而且从其颜色区分，能够帮助识别氨基酸。显色不且从其颜色区分，能够帮助识别氨基酸。显色不稳是其特点，氨对显色无干扰。稳是其特点，氨对显色无干扰。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第7页第二节第二节 蛋白质提取工艺特征蛋白质提取工艺特征 l一、不一样结构蛋白质及其溶解性质一、不一样结构蛋白质及其溶解性质l蛋白质按蛋白质按其功效其功效可分为可分为活性蛋白和非活性蛋白活性蛋白和非活性蛋白二类；二类；l按按结构结构又可分为又可分为简单蛋白和结合蛋白简单蛋白和结合蛋白二类：二类：l再一个分类是依据蛋白质再一个分类是依据蛋白质溶解度差异溶解度差异而分为水而分为水溶性蛋白、醇溶性蛋白等，还有一类硬蛋白，溶性蛋白、醇溶性蛋白等，还有一类硬蛋白，不溶于水、稀酸、稀碱和有机溶剂，遇强酸、不溶于水、稀酸、稀碱和有机溶剂，遇强酸、强碱水解。强碱水解。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第8页蛋蛋 白白 质质 类类 别别溶溶 解解 性性 质质简单蛋白质简单蛋白质1.白蛋白白蛋白2.球蛋白球蛋白 a.真球蛋白真球蛋白 b.拟球蛋白拟球蛋白3.醇溶蛋白醇溶蛋白4.谷蛋白谷蛋白5.精蛋白精蛋白6.组蛋白组蛋白1、溶溶于于水水及及稀稀盐盐、稀稀酸酸、稀稀碱碱溶溶液液，可可被被50%饱饱和和度度硫硫酸酸铵铵析析出出。2、a.普普通通在在等等电电点点不不溶溶于于水水，但但加加入少许盐、碱则可溶解。入少许盐、碱则可溶解。b.溶于水，可为溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出。饱和度硫酸铵析出。3、溶于、溶于7080%乙醇中，但不溶于水及无水乙醇。乙醇中，但不溶于水及无水乙醇。4、在在等等电电点点不不溶溶于于水水，也也不不溶溶于于稀稀盐盐酸酸，易易溶溶于于稀稀酸，稀酸，稀 碱溶液。碱溶液。5、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。6、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。硬蛋白质硬蛋白质不溶于水、盐、稀酸、稀碱不溶于水、盐、稀酸、稀碱结结合合蛋蛋白白质质(包包含含磷磷蛋蛋白白、粘粘蛋蛋白白、糖糖蛋蛋白白、核核蛋蛋白白、脂脂蛋蛋白白、血血红红蛋蛋白白、金金属属蛋蛋白白、黄黄素素蛋蛋白白等等)这这类类蛋蛋白白质质溶溶解解度度性性质质随随蛋蛋白白质质与与非非蛋蛋白白结结合合部部分分不不一一样样而而异异，除除脂脂蛋蛋白白外外，普普通通可可溶溶于于稀稀酸酸，稀稀碱碱及及盐盐溶溶液液中中，脂脂蛋蛋白白如如脂脂质质部部分分露露于于外外，则则脂脂溶溶性性占占优优势势，如如脂脂质质部部分分被被包包围围于于分分子子之之中中，则则水水溶溶性性占优势。占优势。表表表表6-1 6-1 不一样结构蛋白质及其溶解性质不一样结构蛋白质及其溶解性质不一样结构蛋白质及其溶解性质不一样结构蛋白质及其溶解性质氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第9页二、蛋白质及酶普通提取方法二、蛋白质及酶普通提取方法l1.水溶液提取水溶液提取 凡能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱蛋凡能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱蛋白质或酶，普通都可用稀盐溶液或缓冲溶液进行提白质或酶，普通都可用稀盐溶液或缓冲溶液进行提取。稀盐溶液有利于稳定蛋白质结构和增加蛋白质取。稀盐溶液有利于稳定蛋白质结构和增加蛋白质溶解度。加入提取液量要适当，加入量太少提取不溶解度。加入提取液量要适当，加入量太少提取不完全，加量太多，则不利于浓缩，普通用量为原材完全，加量太多，则不利于浓缩，普通用量为原材料料36倍体积左右，可一次提取或分次提取。提取倍体积左右，可一次提取或分次提取。提取时常迟缓搅拌，以提升提取效率。以盐溶液或缓冲时常迟缓搅拌，以提升提取效率。以盐溶液或缓冲液提取蛋白质和酶时，常综合考虑以下原因：液提取蛋白质和酶时，常综合考虑以下原因：氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第10页l(1)盐浓度：盐浓度：提取蛋白质盐浓度，普通在提取蛋白质盐浓度，普通在0.020.2M范围内。惯用稀溶液和缓冲液范围内。惯用稀溶液和缓冲液有有0.020.05M磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，0.090.15M氯化钠溶液。氯化钠溶液。l(2)pH值：值：蛋白质和酶所用提取液蛋白质和酶所用提取液pH值普值普通选择在被提取蛋白质等电点两侧稳定区通选择在被提取蛋白质等电点两侧稳定区内。内。l(3)温度：温度：蛋白质和酶普通都不耐热，所蛋白质和酶普通都不耐热，所以提取时通常要求低温操作。以提取时通常要求低温操作。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第11页2.有机溶剂提取有机溶剂提取l一些和脂质结合比较牢靠或分子中非极性侧链较多一些和脂质结合比较牢靠或分子中非极性侧链较多蛋白质和酶，蛋白质和酶，难溶于水、稀盐、稀酸和稀碱，惯用难溶于水、稀盐、稀酸和稀碱，惯用有机溶剂提取。如丙酮、异丙醇、乙醇、正丁醇等，有机溶剂提取。如丙酮、异丙醇、乙醇、正丁醇等，均可溶于水或部分溶于水，这些溶剂都同时有亲脂均可溶于水或部分溶于水，这些溶剂都同时有亲脂性和亲水性。其中正丁醇有较强亲脂性，也有一定性和亲水性。其中正丁醇有较强亲脂性，也有一定亲水性，在亲水性，在0时于水中有时于水中有10.5溶解度。它在水溶解度。它在水和脂分子间起着类似去污剂作用，取代蛋白质与脂和脂分子间起着类似去污剂作用，取代蛋白质与脂质重新与蛋白质结合，使原来蛋白质在水中溶解度质重新与蛋白质结合，使原来蛋白质在水中溶解度大大增加。丁醇在水溶液及各种生物材料中解离脂大大增加。丁醇在水溶液及各种生物材料中解离脂蛋白能力极强，是其它有机溶剂所不及。我国生化蛋白能力极强，是其它有机溶剂所不及。我国生化工作者曾用此法成功地提取了琉拍酸脱氢酶，对于工作者曾用此法成功地提取了琉拍酸脱氢酶，对于碱性磷酸醋酶提取效果也十分显著。碱性磷酸醋酶提取效果也十分显著。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第12页l有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于一定百分比有机溶剂。在这么情能溶于一定百分比有机溶剂。在这么情况下，采取稀有机溶剂提取经常是为预况下，采取稀有机溶剂提取经常是为预防水解酶破坏，并兼有除杂和提升纯化防水解酶破坏，并兼有除杂和提升纯化效果作用。效果作用。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第13页3 3、从细胞膜上提取水溶性蛋白质方法、从细胞膜上提取水溶性蛋白质方法l膜上蛋白质或酶普通有两种存在状态，一是在膜膜上蛋白质或酶普通有两种存在状态，一是在膜表面上，与膜成份联络比较松；第二是膜内在成表面上，与膜成份联络比较松；第二是膜内在成份之一，或与膜成份结合较紧。蛋白质与膜成份份之一，或与膜成份结合较紧。蛋白质与膜成份结合可经过脂质形成复合物，也能够经过金属离结合可经过脂质形成复合物，也能够经过金属离子与膜成份结合，或与膜其它蛋白质形成复合物。子与膜成份结合，或与膜其它蛋白质形成复合物。与膜成份结合较松蛋白质或酶，经过充分破碎细与膜成份结合较松蛋白质或酶，经过充分破碎细胞，在一定胞，在一定pHpH范围用稀盐溶液即可提取分离。但范围用稀盐溶液即可提取分离。但一些与膜成份结合较牢或属于膜组成蛋白质，提一些与膜成份结合较牢或属于膜组成蛋白质，提取则比较困难，须用超声波、去污剂或其它比较取则比较困难，须用超声波、去污剂或其它比较强烈化学处理，才能从膜上分离出来。主要方法强烈化学处理，才能从膜上分离出来。主要方法有：有：氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第14页l(1)(1)浓盐或尿素等溶液提取浓盐或尿素等溶液提取 如如NaClONaClO4 4、尿素、肌、尿素、肌盐酸等溶液都有些人应用于提取膜蛋白，当以上溶盐酸等溶液都有些人应用于提取膜蛋白，当以上溶液浓度到达液浓度到达2mol/L2mol/L时，可提取时，可提取2727以上膜蛋白，但以上膜蛋白，但使用这么条件易引发蛋白质和酶变性。使用这么条件易引发蛋白质和酶变性。l(2)(2)碱溶液提取碱溶液提取 碱性条件也能够解离与膜上成碱性条件也能够解离与膜上成份结合蛋白质。在份结合蛋白质。在pH8-10pH8-10范围内，一些膜蛋白伴随范围内，一些膜蛋白伴随pHpH提升而溶解度大大增加，至提升而溶解度大大增加，至pHllpHll时，有时，有40%-5040%-50膜蛋白被抽出，但碱提取法也轻易引发蛋白质和酶膜蛋白被抽出，但碱提取法也轻易引发蛋白质和酶失活，应用上不广。失活，应用上不广。l(3)(3)加人金属鳌合剂加人金属鳌合剂 蛋白质经过金属离子与膜蛋白质经过金属离子与膜成份结合时，加人金属鳌合剂如成份结合时，加人金属鳌合剂如EDTAEDTA可使蛋白质释可使蛋白质释放出来。用此法曾成功地提取了膜上放出来。用此法曾成功地提取了膜上ATPATP酶偶联因酶偶联因子子I I。EDTAEDTA与超声波联合处理抽提膜上磷酰转移酶与超声波联合处理抽提膜上磷酰转移酶效果更加好。效果更加好。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第15页l(4）有机溶剂抽提）有机溶剂抽提 使用乙醇、吡啶、叔戊醇、正使用乙醇、吡啶、叔戊醇、正丁醇等溶剂抽提及用冷丙酮做成丙酮粉，是提取丁醇等溶剂抽提及用冷丙酮做成丙酮粉，是提取膜上与脂质结合脂蛋白或膜内脂蛋白组分最惯用膜上与脂质结合脂蛋白或膜内脂蛋白组分最惯用也较有效方法，其中叔戊醇及正丁醇用于膜内脂也较有效方法，其中叔戊醇及正丁醇用于膜内脂蛋白效果尤佳。前已提到正丁醇可在广泛蛋白效果尤佳。前已提到正丁醇可在广泛pH(pH3-10)和温度范围（和温度范围（-240）内使用。用有）内使用。用有机溶剂结合其它方法已成功地提取了各种膜上蛋机溶剂结合其它方法已成功地提取了各种膜上蛋白质和酶，如白质和酶，如NPDH脱氢酶、唬珀酸脱氢酶、细脱氢酶、唬珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、碱性磷酸酯酶、胆碱酯酶等。胞色素氧化酶、碱性磷酸酯酶、胆碱酯酶等。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第16页l(5)(5)去垢剂处理去垢剂处理 去垢剂处理是当前广泛应去垢剂处理是当前广泛应用于提取膜上水溶性蛋白和脂蛋白方法，惯用用于提取膜上水溶性蛋白和脂蛋白方法，惯用去垢剂有弱离子去垢剂脱氧胆酸盐、胆酸盐，去垢剂有弱离子去垢剂脱氧胆酸盐、胆酸盐，强离子型去垢剂十二烷基磺酸钠强离子型去垢剂十二烷基磺酸钠(SDS(SDS）和非离）和非离子型去垢剂子型去垢剂Triton X-100Triton X-100和和Tween,LubrolTween,Lubrol和和BrijBrij等。等。l去垢剂处理膜蛋白时浓度通常为去垢剂处理膜蛋白时浓度通常为1 1左右，用此左右，用此法提取膜蛋白和酶有细胞色素法提取膜蛋白和酶有细胞色素BSBS、胆碱醋酶、胆碱醋酶、细胞色素氧化酶、细胞色素氧化酶、DPNHDPNH氧化酶、氧化酶、ADP/ATPADP/ATP载体蛋载体蛋白等。白等。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第17页l用去垢剂分离膜蛋白时，选择去垢剂首先考虑：用去垢剂分离膜蛋白时，选择去垢剂首先考虑：去垢剂溶解能力；去垢剂溶解能力；去垢剂温和性。强离子型去垢剂温和性。强离子型去垢剂（如去垢剂（如SDS)普通含有很好溶解能力，但温和普通含有很好溶解能力，但温和情况不理想，轻易引发蛋白质变性。弱离子型或情况不理想，轻易引发蛋白质变性。弱离子型或非离子型去垢剂对蛋白质变性影响较小，而溶解非离子型去垢剂对蛋白质变性影响较小，而溶解能力差。去垢剂溶解能力与溶液离子强度大小相能力差。去垢剂溶解能力与溶液离子强度大小相关。普通来说，离子强度增加，去垢剂溶解能力关。普通来说，离子强度增加，去垢剂溶解能力也随之增大。所以使用去垢剂溶解膜蛋白时，须也随之增大。所以使用去垢剂溶解膜蛋白时，须考虑各种条件。依据考虑各种条件。依据Klingenberg等经验，分离线等经验，分离线粒体膜粒体膜DP/ATP载体蛋白，选取载体蛋白，选取Triton X100比用比用Lubrol,Brij和和Aminoxide等去垢剂效果更加好，等去垢剂效果更加好，所得所得ADP/ATP载体蛋白含有较高天然活性。但主载体蛋白含有较高天然活性。但主要缺点是要缺点是riton X100在在280nm处有强紫外吸收，干处有强紫外吸收，干扰用紫外法测定蛋白质含量。扰用紫外法测定蛋白质含量。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第18页l(6)(6)加人脂酶或磷酸酯酶水解蛋白质一脂加人脂酶或磷酸酯酶水解蛋白质一脂质复合物质复合物 从蛇毒中提取磷酸醋酶从蛇毒中提取磷酸醋酶A A主主要作用于磷脂，最适要作用于磷脂，最适pHpH为为6-86-8。从胰脏中。从胰脏中提取醋酶作用于单、二、三甘油醋，酶作提取醋酶作用于单、二、三甘油醋，酶作用最适用最适pHpH为为7-8o7-8o醋酶和磷酸醋酶均需要醋酶和磷酸醋酶均需要Ca Ca 2 2激活。用酶法处理提取膜蛋白及酶有细激活。用酶法处理提取膜蛋白及酶有细胞色素胞色素C C、a-a-磷酸甘油脱氢酶、磷酸甘油脱氢酶、TPNH-TPNH-细细胞色素胞色素C C还原酶等。还原酶等。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第19页三、蛋白质纯化方法三、蛋白质纯化方法l1.1.依据蛋白质等电点不一样来纯化蛋白质依据蛋白质等电点不一样来纯化蛋白质 蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质，在一蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质，在一定定pHpH环境中，某一个蛋白质解离成正、负离子趋势环境中，某一个蛋白质解离成正、负离子趋势相等，或解离成两性离子，其净电荷为零，此时环相等，或解离成两性离子，其净电荷为零，此时环境境pHpH值即为该蛋白质等电点。在等电点时蛋白质性值即为该蛋白质等电点。在等电点时蛋白质性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、粘度、质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等皆最小，所以能够利用蛋白质等电点时溶渗透压等皆最小，所以能够利用蛋白质等电点时溶解度最小特征来制备或沉淀蛋白质。解度最小特征来制备或沉淀蛋白质。等电点沉淀等电点沉淀 等电点除杂等电点除杂氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第20页2.依据蛋白质分子形状和大小不一样来纯化依据蛋白质分子形状和大小不一样来纯化蛋白质蛋白质 蛋白质一个主要特点是：分子大，而蛋白质一个主要特点是：分子大，而且不一样种类蛋白质分子大小也不相等。且不一样种类蛋白质分子大小也不相等。由此能够用凝胶过滤法、超滤法、离心法由此能够用凝胶过滤法、超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其它小分子物质分及透析法等将蛋白质与其它小分子物质分离，也可将大小不一样蛋白质分离。离，也可将大小不一样蛋白质分离。凝胶过滤层析凝胶过滤层析氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第21页3.3.依据蛋白质溶解度不一样来纯化蛋白质依据蛋白质溶解度不一样来纯化蛋白质 蛋白质溶解度受溶液蛋白质溶解度受溶液pHpH、离子强度、溶剂电解、离子强度、溶剂电解质性质及温度等各种原因影响。在同一特定条件下，质性质及温度等各种原因影响。在同一特定条件下，不一样蛋白质有不一样溶解度，到达分离目标。盐不一样蛋白质有不一样溶解度，到达分离目标。盐溶与盐析，结晶，低温有机溶剂沉淀法。如溶与盐析，结晶，低温有机溶剂沉淀法。如:盐析盐析和有机溶剂分级分离法。和有机溶剂分级分离法。4.4.依据蛋白质电离性质不一样来纯化蛋白质依据蛋白质电离性质不一样来纯化蛋白质 离子交换剂作为一个固定相，本身含有正离子离子交换剂作为一个固定相，本身含有正离子或负离子基团，它对溶液中不一样带电物质展现不或负离子基团，它对溶液中不一样带电物质展现不一样亲和力，从而使这些物质分离提纯。一样亲和力，从而使这些物质分离提纯。蛋白质、蛋白质、多肽或氨基酸含有能够离子化基团。多肽或氨基酸含有能够离子化基团。对蛋白质对蛋白质离子交换层析离子交换层析，普通多用离子交换纤，普通多用离子交换纤维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶为骨架离子交换剂。主要是取得其有较大蛋白质吸为骨架离子交换剂。主要是取得其有较大蛋白质吸附容量、较高流速和分辨力。附容量、较高流速和分辨力。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第22页5.5.依据蛋白质功效专一性不一样来纯化蛋白质。依据蛋白质功效专一性不一样来纯化蛋白质。主要伎俩是主要伎俩是亲和层析法亲和层析法，即利用蛋白质分子能与，即利用蛋白质分子能与其对应配体进行特异性、非共价键可逆性结合而到达其对应配体进行特异性、非共价键可逆性结合而到达纯化目标。纯化目标。固相化金属亲和层析固相化金属亲和层析IMACIMAC是新发展一个亲和层析是新发展一个亲和层析技术。蛋白质分子中咪唑基和巯基可与一些金属元素技术。蛋白质分子中咪唑基和巯基可与一些金属元素（如（如CuCu2+2+,Zn,Zn2+2+)形成配位结合，使蛋白质得到分离纯形成配位结合，使蛋白质得到分离纯化。化。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第23页6.依据蛋白质疏水基团与对应载体基团结合来纯化依据蛋白质疏水基团与对应载体基团结合来纯化蛋白质蛋白质 蛋白质上有疏水区，它们主要由酪氨酸、蛋白质上有疏水区，它们主要由酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极性亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极性侧链密集在一起，并暴露于分子表面。这些疏水侧链密集在一起，并暴露于分子表面。这些疏水区能够与吸附剂上疏水性基团结合，在经过降低区能够与吸附剂上疏水性基团结合，在经过降低介质离子强度和极性等方法将蛋白质洗脱下来。介质离子强度和极性等方法将蛋白质洗脱下来。如如疏水相互作用层析疏水相互作用层析7.依据蛋白质在溶剂系统中分配不一样来纯化蛋白依据蛋白质在溶剂系统中分配不一样来纯化蛋白质质 逆流分配色谱逆流分配色谱氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第24页8.依据蛋白质受物理、化学等作用原因影依据蛋白质受物理、化学等作用原因影响来纯化蛋白质。响来纯化蛋白质。蛋白质易受蛋白质易受pH、温度、酸碱、金属、温度、酸碱、金属离子、蛋白质沉淀剂，络合剂等影响，离子、蛋白质沉淀剂，络合剂等影响，用于各种蛋白质都存在差异，可利用这用于各种蛋白质都存在差异，可利用这种差异来分离纯化蛋白质。种差异来分离纯化蛋白质。如：电泳法、结晶纯化如：电泳法、结晶纯化氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第25页9.9.依据蛋白质选择性吸附性质来纯化蛋白质依据蛋白质选择性吸附性质来纯化蛋白质 在蛋白质分离中，最广泛使用吸附剂在蛋白质分离中，最广泛使用吸附剂有结晶磷酸钙，磷酸钙凝胶，硅胶，皂土、有结晶磷酸钙，磷酸钙凝胶，硅胶，皂土、沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭等。如：吸附层析性炭等。如：吸附层析10.10.依据酶对蛋白质作用来纯化蛋白质依据酶对蛋白质作用来纯化蛋白质 SOD SOD酶抗蛋白水解酶。酶抗蛋白水解酶。亲和层析亲和层析氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第26页l总之，蛋白质和酶从细胞内提取出来后，总之，蛋白质和酶从细胞内提取出来后，仍处于十分混杂体系中，必须深入纯化。仍处于十分混杂体系中，必须深入纯化。但经过提取除去了大量与制备性质差异较但经过提取除去了大量与制备性质差异较大杂质，只剩下与制备物理性质大致相近大杂质，只剩下与制备物理性质大致相近或类似物质。所以，经过有选择性提取这或类似物质。所以，经过有选择性提取这一步骤，对以后纯化工作创造十分有利条一步骤，对以后纯化工作创造十分有利条件。蛋白质和酶溶剂提取后深入分离纯化件。蛋白质和酶溶剂提取后深入分离纯化惯用方法有以下几个：惯用方法有以下几个：氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第27页l(1)盐析法；盐析法；l(2)等电点沉淀法；等电点沉淀法；l(3)有机溶剂分级分离法；有机溶剂分级分离法；l(4)层析法（凝胶过滤层析、离子交换层析、层析法（凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析）；吸附层析、亲和层析）；l(5)电泳法（等电聚焦电泳、双向凝胶电泳）电泳法（等电聚焦电泳、双向凝胶电泳）l(6)结晶纯化等。结晶纯化等。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第28页l四、蛋白质判别方法四、蛋白质判别方法l双缩脲双缩脲(Biuret）反应：）反应：本试剂为本试剂为1 CuS04和和40%NaOH溶液等量混合。主要是溶液等量混合。主要是Cu+2与蛋白与蛋白质或肽分子中肽键质或肽分子中肽键-CO-NH-络合呈色。蛋白质络合呈色。蛋白质水提液和上述试剂反应，显红紫色。水提液和上述试剂反应，显红紫色。l这是检验双缩脲以及有两个肽键以上化合物一个这是检验双缩脲以及有两个肽键以上化合物一个方法。双缩脲不溶于水，能溶于碱，故反应要在方法。双缩脲不溶于水，能溶于碱，故反应要在碱性条件下进行。碱性条件下进行。CuSO4过量有害，含使溶液过量有害，含使溶液生成生成Cu(NH3)4SO4而变兰，遮盖了特有红紫色。而变兰，遮盖了特有红紫色。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第29页l酸性蒽醌紫酸性蒽醌紫（商品名：（商品名：Solway purple):100ml0.05%酸性蒽醌紫溶液，加酸性蒽醌紫溶液，加0.5ml硫酸即成。硫酸即成。将水提液点在纸片上，就呈紫色。氨基酸、肽均将水提液点在纸片上，就呈紫色。氨基酸、肽均不显色。不显色。l0.1%溴百里兰钠盐溶液：溴百里兰钠盐溶液：将水提液点于纸上，将水提液点于纸上，喷洒上述试剂就呈兰紫色或绿色。若显色不够显喷洒上述试剂就呈兰紫色或绿色。若显色不够显著，稍烘一下即可。背景为黄色。著，稍烘一下即可。背景为黄色。l酰化反应：酰化反应：蛋白质或肽类分子中末端氨基酸氨蛋白质或肽类分子中末端氨基酸氨基，在有基，在有NaHCO3溶液条件，易与溶液条件，易与1-二甲氨基二甲氨基萘萘-5-磺酰氯反应生成对应磺酰胺衍生物，而含有磺酰氯反应生成对应磺酰胺衍生物，而含有强烈黄色荧光。强烈黄色荧光。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第30页l米隆反应：米隆反应：蛋白质与蛋白质与Millon试剂（亚硝酸汞、试剂（亚硝酸汞、硝酸汞、亚硝酸及硝酸混合液）加热显红色或黄硝酸汞、亚硝酸及硝酸混合液）加热显红色或黄色沉淀，此沉淀能溶于硝酸呈红色，表明蛋白质色沉淀，此沉淀能溶于硝酸呈红色，表明蛋白质分子中有酪氨酸组成部分。分子中有酪氨酸组成部分。l Folin-Ciocalteu试剂反应：试剂反应：试剂为试剂为1m10.5%CuSO4H2O加加1%酒石酸钠，再加酒石酸钠，再加50ml2%Na2CO30.1mo1NaOH溶液。蛋白质溶液溶液。蛋白质溶液加上述试剂室温下显红色。（这是肽键反应，游加上述试剂室温下显红色。（这是肽键反应，游离甘氨酸对反应有干扰，无机盐则无影响）。离甘氨酸对反应有干扰，无机盐则无影响）。lSakaguchi反应：反应：在蛋白质水溶液中加在蛋白质水溶液中加a-萘酚稀萘酚稀NaOH溶液，混匀后加数滴次氯酸钠，若出现红溶液，混匀后加数滴次氯酸钠，若出现红色，并有荧光，说明蛋白质分子中含有精氨酸色，并有荧光，说明蛋白质分子中含有精氨酸（Arginine)。氨基酸蛋白质提取工艺特性专家讲座第31页