流式细胞术的基本原理与应用简介.pptx

流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介第1页流式细胞术流式细胞术n流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry）就是对处于快）就是对处于快速直线流动状态中单列细胞或生物颗粒进行逐速直线流动状态中单列细胞或生物颗粒进行逐一、多参数、快速定性、定量分析或分选技术。一、多参数、快速定性、定量分析或分选技术。Injector TipFluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeamSheath fluid流式细胞术的基本原理与应用简介第2页流式细胞仪工作原理示意图流式细胞术的基本原理与应用简介第3页流式细胞仪可提供信息流式细胞仪可提供信息n物理信息：经过散射光信号反应物理信息：经过散射光信号反应n荧光信息：经过荧光信号反应荧光信息：经过荧光信号反应流式细胞术的基本原理与应用简介第4页散射光信号产生散射光信号产生n488nm激光产生散射光激光产生散射光SSCFSC流式细胞术的基本原理与应用简介第5页前向角散射光信号（前向角散射光信号（FSC）流式细胞术的基本原理与应用简介第6页侧向角散射光信号（侧向角散射光信号（SSC）流式细胞术的基本原理与应用简介第7页利用散射光信号对混合细胞分群利用散射光信号对混合细胞分群n红细胞裂解全血红细胞裂解全血流式细胞术的基本原理与应用简介第8页荧光信号产生荧光信号产生流式细胞术的基本原理与应用简介第9页荧光信号表示方法荧光信号表示方法双参数点图双参数点图单参数直方图单参数直方图流式细胞术的基本原理与应用简介第10页一个完整流式试验流程一个完整流式试验流程样品准备荧光标识选择对照设置仪器条件确实定数据分析流式细胞术的基本原理与应用简介第11页样品准备血液或骨髓标本体液、灌洗液、悬浮培养细胞贴壁细胞组织标本单细胞悬液，浓度单细胞悬液，浓度5 105 1 106/mL流式细胞术的基本原理与应用简介第12页样本流速选择n高流速：普通用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，但分辨率低高流速：普通用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，但分辨率低.n低流速：普通用于对分辨率要求较高分析，如低流速：普通用于对分辨率要求较高分析，如DNA分析。分析。（注：依据制备样本浓度随时调整流速）（注：依据制备样本浓度随时调整流速）流式细胞术的基本原理与应用简介第13页荧光标识抗体选择尽可能使用直标抗体多色标识时应该增加各种抗体用量或适当延长反应时间依据流式细胞仪类型及荧光素光谱选择荧光抗体依据检测物（抗原）表示量选择荧光染料使用双标以上抗体需要做荧光赔偿流式细胞术的基本原理与应用简介第14页流式细胞仪流式细胞仪n型号：型号：BD FACSCanto IIn光学信号产生：光学信号产生：n激光（激光（488nm，633nm）n光学信号搜集：光学信号搜集：n光学滤片光学滤片n光电倍增管（光电倍增管（PMT）：将光信号转换成电信号）：将光信号转换成电信号流式细胞术的基本原理与应用简介第15页FACSCantoII光学滤片光学滤片长通滤片长通滤片（Longpass，LP）带通滤片带通滤片（Bandpass，BP）LP500500/50流式细胞术的基本原理与应用简介第16页750-810nm650-670nmFACSCantoII信号检测组件信号检测组件流式细胞术的基本原理与应用简介第17页常见荧光染料发射波长常见荧光染料发射波长荧光强度：荧光强度：APCPEPE-Cy7FITCAPCPEPE-Cy7FITC每个通道只能选择一个荧光素每个通道只能选择一个荧光素各个通道之间荧光素能够随意搭配各个通道之间荧光素能够随意搭配搭配荧光素之间发射光谱重合尽可能小搭配荧光素之间发射光谱重合尽可能小流式细胞术的基本原理与应用简介第18页流式细胞术的基本原理与应用简介第19页对照设置对照设置n阴性对照阴性对照n阳性对照阳性对照n赔偿对照赔偿对照流式细胞术的基本原理与应用简介第20页阴性对照空白对照：即不进行任何标识细胞。主要用于确定待测标本基础荧光域值 同型对照：即用同型抗体作平行试验。同型抗体为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清纯化IgG1或IgG2。流式细胞术的基本原理与应用简介第21页阳性对照阳性对照：阳性对照即应用已知表示某种抗原细胞（阳性细胞）进行平行试验。通常见于检测抗体是否有问题或确定试验方法稳定性、准确性流式细胞术的基本原理与应用简介第22页赔偿对照赔偿对照:多色荧光分析，进行荧光赔偿 将用于多色标识各种荧光抗体分别与样本反应，一一进行单色标识，以测定荧光信号重合并做适当调整流式细胞术的基本原理与应用简介第23页仪器条件确实定仪器条件确实定n电压电压n阈值阈值n荧光赔偿（多色分析）荧光赔偿（多色分析）流式细胞术的基本原理与应用简介第24页电压PMT将光信号转换成电信号，调整将光信号转换成电信号，调整PMT电压，信电压，信号强度将随之改变。号强度将随之改变。放大器两种放大方式：线性放大（lin）对数放大（log）光信号光电倍增管（PMT）放大器电信号流式细胞术的基本原理与应用简介第25页线性放大（线性放大（linlin）按光强度线性关系输出信号（FSC、SSC、细胞周期检测等）流式细胞术的基本原理与应用简介第26页对数放大（对数放大（loglog）按光强度对数关系输出信号，用于大多数荧光染色试验流式细胞术的基本原理与应用简介第27页阈值（阈值（threshholdthreshhold）屏蔽噪音信号和碎片信号流式细胞术的基本原理与应用简介第28页荧光赔偿荧光赔偿采取适当方法校正荧光染料之间叠加所造成误差采取适当方法校正荧光染料之间叠加所造成误差流式细胞术的基本原理与应用简介第29页赔偿公式赔偿公式通常干扰光占该染料所发出荧光总量通常干扰光占该染料所发出荧光总量X%。RD1-X%FITC流式细胞术的基本原理与应用简介第30页赔偿模型赔偿模型PE-X%FITC横平竖直流式细胞术的基本原理与应用简介第31页赔偿调整试验过程赔偿调整试验过程样本准备：阴性样本，单阳性样本样本准备：阴性样本，单阳性样本调整：第一步：阴性样本调整全部调整：第一步：阴性样本调整全部PMT 第二步：单阳性样本调整赔偿第二步：单阳性样本调整赔偿自动调赔偿自动调赔偿手动调赔偿手动调赔偿流式细胞术的基本原理与应用简介第32页判断标准：横平竖直判断标准：横平竖直流式细胞术的基本原理与应用简介第33页数据分析数据显示方式：单参数直方图 二维散点图 二维等高线图 假三维图 三维图 列表模式设门：在细胞分布图中指定某一个范围或某一细胞性状细胞群，并对其进行单参数或多参数分析。流式细胞术的基本原理与应用简介第34页单参数直方图单参数直方图 双参数点图双参数点图 二维等高图二维等高图Pseudo 3D Plot3D Plot 密度图密度图 假三维图假三维图 三维图三维图 流式细胞术的基本原理与应用简介第35页设门设定阴性与阳性群体界限确定阳性与阴性细胞群体统计阳性或阴性细胞群体百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数流式细胞术的基本原理与应用简介第36页流式细胞术应用细胞生理学研究（细胞相对大小和颗粒性、胞内pH值检测、Ca2+流动性检测、膜电势检测、细胞活性检测、细胞活力检测）细胞膜表面标识胞内标识细胞周期分析凋亡分析CBA（Cytometric Bead Array）流式细胞术的基本原理与应用简介第37页