流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相.pptx

流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相期时相流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第1页一、试验目标一、试验目标1、了解流式细胞术（FCM，Flow Cytometry）基础原理。2、了解流式细胞术分析细胞凋亡检测方法。3、了解流式细胞术分析细胞群体DNA含量分布 基础方法。流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第2页二、试验原理二、试验原理 细胞凋亡细胞凋亡(Apoptosis)(Apoptosis)是指细胞基因调控一个自主性自杀现象。或者说在一定生理或病理条件下，细胞遵照本身程序，自我结束生命死亡方式。因为这种死亡方式是由基因调控死亡过程，所以又称之为程序性细胞死亡(Programmed Cell Death)。细胞凋亡有别于细胞坏死（necrosis）。流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第3页二、试验原理二、试验原理（continued）流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第4页细胞凋亡形态学特征细胞凋亡形态学特征二、试验原理二、试验原理（continued）流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第5页细胞凋亡检测方法细胞凋亡检测方法基于形态学观察染色法基于形态学观察染色法基于基于DNA 片断化检测法片断化检测法膜联蛋白检测法膜联蛋白检测法Caspase酶分析法酶分析法流式细胞仪定量分析法流式细胞仪定量分析法二、试验原理二、试验原理（continued）流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第6页 流式细胞术（流式细胞术（FCM，Flow Cytometry）：）：是对单个 细胞或其它生物微粒进行快速定性,定量分析与分选 一门技术。FCM是利用流式细胞仪(Flow Cytometer)分析在高压 高速下经过样品孔径单个细胞,在激光束照射下 发出散射光和与细胞表面结合荧光标识单抗 荧光信号。二、试验原理二、试验原理（continued）流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第7页 细胞内DNA含量随细胞周期进程发生周期性改变，如 G0/G1期DNA含量为2n，而G2期DNA含量是4n。利用 PI标识方法，经过流式细胞仪对细胞内DNA相对含量 进行测定，可分析细胞周期各时相百分比。流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第8页流式细胞仪流式细胞仪-Guava Easycyte 8HT二、试验原理二、试验原理（continued）流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第9页二、试验原理二、试验原理（continued）流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第10页二、试验原理二、试验原理（continued）流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第11页二、试验原理二、试验原理（continued）流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第12页二、试验原理二、试验原理（continued）流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第13页二、试验原理二、试验原理（continued）流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第14页二、试验原理二、试验原理（continued）流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第15页二、试验原理二、试验原理（continued）流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第16页二、试验原理二、试验原理流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第17页二、试验原理二、试验原理流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第18页二、试验原理二、试验原理流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第19页仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱材料：材料：Hep-2Hep-2细胞，离心管，封口膜，微量移液器，细胞，离心管，封口膜，微量移液器，TipsTips试剂：试剂：7070乙醇（保留于乙醇（保留于44），），RNase-A RNase-A（10mg/ml,-10mg/ml,-20 20保留），保留），PI PI（650g/ml650g/ml，避光保留于，避光保留于-20-20），），PBS(pH 7.4 PBS(pH 7.4，保留于，保留于4)4)三、仪器、材料与试剂三、仪器、材料与试剂流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第20页1.搜集对数生长久细胞接种于6孔培养板中，每孔1.9mL（含4105细胞）。2.培养过夜后，加入不一样浓度药液100L，对照组加入同体积高糖DMEM液。3.作用不一样时间后，离心搜集细胞，PBS洗涤2次，体积分数为0.70乙醇-20固定24h以上。4.离心洗去乙醇，细胞重悬于PBS中，1,500r/min，离心5min去PBS后加PI染色液，室温下避光染色30min。5.400目筛网过滤，采取Guava Easycyte 8HT流式细胞仪，以氩离子激光器为激发光源，激发波长为488nm，测定数据输入计算机，用Multicycle软件分析细胞DNA含量。四四、试验、试验步骤步骤流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第21页五五、试验、试验结果结果流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第22页五五、试验、试验结果结果流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第23页五五、试验、试验结果结果流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相第24页