Box-behnken响应面法优选肾风止痒方提取工艺研究.pdf

第18 卷第2 期2023年6 月贵阳学院学报（自然科学版）（季刊）JOURNAL OF GUIYANG UNIVERSITY Natural Sciences(Quarterly)Vol.18No.2Jun.2023Boxb e h n k e n 响应面法优选肾风止痒方提取工艺研究熊成欢12,曹佩雪3,屈相玲12*，陈礼大,张雪，张方文（1.贵州中医药大学第二附属医院药学部，贵州贵阳550 0 0 1；2.医院制剂研发中心，贵州贵阳550 0 0 1；3.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳550 0 14)摘要：以没食子酸和盐酸小檗碱含量的综合评分为评价指标，在单因素实验基础上，采用Box-Behnken响应面法考察肾风止痒方最佳提取工艺。最佳提取工艺为：7 5%乙醇为溶媒，液料比12:1（mL/g），常温浸泡96小时。验证试验综合评分95.0 2，与优选工艺相对误差为0.19%。本法简单，预测性良好，提取工艺稳定，为肾风止痒方的研究开发奠定基础。关键词：肾风止痒方；响应面法；工艺优化中图分类号：R284.2Optimization of the extraction process of compound preparation ofShen Feng Zhi Yang by Box-behnken Design-response SurfaceXIONG Cheng-huan-CAO Pei-xue,QU Xiang-ling-2,Chen Li-da,ZHANG Xue,ZHANG Fang-wen(1.Dept.Of Pharmacy,the Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550001,Guizhou,China;2.Hospital Preparation Research&Development Centre,Guiyang 550001,Guizhou,China;3.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and ChineseAbstract:Taking the contents of gallic acid and berberine hydrochloride as response values,On the basis of single-fac-tor experiments,Box-Behnken response surface method was used to predict the best alcohol extraction process of Shen-feng Zhiyang Recipe.The optimal conditions were as fllows:ethanol concentration of 85%,liquid-solid ratio of 12.5:1(mL/g),extraction time of 4.60 days at room temperature.It was demonstsrated that the average comprehensivescore was 95.02 by the verified experient.The relative error was 0.19%compared with the predicted value.The extrac-tion process is simple,stable and predictable,which lays the foundation for the research and development of ShenfengZhiyang Recipe.Key words:Shen Feng Zhi Yang preparation;Central composite design-response surface methodology;Process optimi-zation肾风止痒方是由五倍子、黄柏、地肤子等中药组成的临床验方，具有清热利湿、祛风止痒功效，临床主要用于维持性血液透析合并皮肤瘙痒患者的治疗,对慢性肾病患者尿毒症性引起的皮肤瘙痒症具有较好的止痒作用，且疗效显著，使用安全。以本方为原料制成的剂，具有存在久置产生沉淀，患者涂用后乙醇挥发致皮肤干燥等缺点，影响其使文献标识码：A文章编号：16 7 3-6 12 5（2 0 2 3）0 2-0 0 7 7-0 4Academy of SciencesPharmacy,Guiyang 550014,Guizhou,China)用和药效发挥。为符合临床用药需要，扩大临床应用，拟将其改制成分布均匀、稠度适宜、易于涂布、便于携带的乳膏剂1.2】,降低药物刺激性,提升润肤性,延长作用时间。原酊剂作用物质为醇浸物，为保证乳膏剂与原酊剂药效物质一致，本试验仍采用醇浸渍法提取复方药效成分，以没食子酸和盐酸小檗碱二者含量响应值折算后的综合评分作为评收稿日期：2 0 2 3-0 3-0 8基金项目：2 0 19年度贵阳市科技计划“抗尿毒症性皮肤瘙痒的医院制剂肾风止痒乳膏的研究与开发”（项目编号：筑科合同(2 0 19）-9-4-13）作者简介：熊成欢，女，贵州开阳人。主要研究方向：药事管理及医院制剂开发。*通讯作者：屈相玲，女，山东平邑人，硕士研究生。主要研究方向：医院制剂的研究开发。一7 7 一贵阳学院学报（自然科学版）价指标，采用单因素实验结合响应面法优化并预测(1)提取工艺参数3.4,确定提取条件，旨在控制乳膏剂研究的首要环节,为乳膏剂的有效性提供物质基础保障。1材料1.1仪器ME104E万分之一电子天平（METTLERTO-LEDO）,M SX（SG EE）百万分之一电子天平（MadeinGermany）,FW 10 0 高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）,HC2 0 6 6 高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），MINGC H E2 4U VMillipore 纯水系统（Made in France）,H P110 0 高效液相色谱仪（美国惠普）。1.2材料处方药材及药用乙醇均由贵州中医药大学第二附属医院提供,药材均为中国药典（2 0 2 0 年版一部)收载的法定品种。没食子酸对照品（中国药品生物制品检定所，纯度91.5%，批号110 8 31-201906），盐酸小碱对照品（中国药品生物制品检定所，纯度8 6.8%，批号110 7 13-2 0 16 13），磷酸、三乙胺、乙腈均为色谱级,水为超纯水。供试品溶液制备：药材分别粉碎过四号筛，混合，置有盖容器中,加入规定浓度的乙醇,加盖，搅拌或振摇，浸渍一定时间，分取药液。取药液适量，加浸泡所用同种溶剂稀释成药材含量为0.0 1g/mL的溶液,离心5min（10 0 0 0 r p m）,取上清液作为供试品溶液。对照品溶液制备：精密称取没食子酸和盐酸小檗碱对照品适量，加50%乙醇溶解配制成浓度分别为0.10 mg/mL和0.2 5mg/mL的溶液,作为对照品溶液。2方法与结果2.1包色谱条件及评价方法色谱条件色谱柱：CAPCELLPAKMGIIC18（4.6 2 50 m m,5m）；柱温：30。盐酸小檗碱色谱条件：流动相乙腈水三乙胺磷酸（30：7 0:0.035:0.035）；检测波长2 6 5nm；流速1.0 mL/min;进样体积10 L。没食子酸色谱条件：流动相乙水-磷酸（5:95:0.0 5）；检测波长2 16 nm；流速0.9 mL/min;进样体积5L。在相应色谱条件下，被测组分均实现基线分离（图1）。一7 8 一(季刊）02(2)50403020100(3)1300(4)14011201000注：（1）没食子酸对照品溶液；（2）供试品溶液（测没食子酸）；（3）盐酸小檗碱对照品溶液；（4）供试品溶液（测盐酸小檗碱）。图1肾风止痒方指标成分高效液相色谱图2.2评价方法采用熵权法优选最佳影响因素水平，以综合评分高者为佳。综合评分=1（没食子酸含量/没食子酸最高含量）50%+（盐酸小檗碱含量/盐酸小檗碱最高含量）50%10 02.3单因素实验考察乙醇浓度、浸泡时间、液料比对指标成分没食子酸、盐酸小檗碱含量的影响，以综合评分结果确定各因素最佳水平,实验结果见表1。以液料比（5:1），常温浸泡2 4h，考察不同浓度乙醇对没食子酸和盐酸小檗碱含量的综合评分影响。结果显示：8 5%乙醇与7 5%乙醇提取综合评分较优，但7 5%乙醇提取没食子酸含量相对分值较高达9 4.14%，可有效提出没食子酸。经对二者提取盐酸小檗碱含量进行组间比较，显示二者无显著差异（P0.05），故选择7 5%乙醇为提取溶剂，可有效提取没食子酸和盐酸小檗碱。以7 5%乙醇为提取溶剂，液料比（5：1），考察不同浸泡时间对没食子酸和盐酸小檗碱含量的综合评分影响。优选得最佳浸泡时间为4天。以7 5%乙醇为提取溶剂,浸泡时间4天,考察不同液料比对没食子酸和盐酸小檗碱含量的综合评分的影响。确定最佳液料比10:1。18卷4624242486868681011021021012minminmin12min2期分项55650.9533(92.97)乙醇浓度750.9653(94.14)(%）850.8953(87.31)950.7301(71.20)11.7971(82.12)21.8759(85.72)浸泡时间32.003(91.53)(d)452.0783(94.97)61.8444(84.28)2.51.3219(63.71)5.02.0575(99.16)液料比7.52.0026(96.51)(mL/g)10.02.0750(100)12.52.0536(98.97)2.41Box-behnken响应面实验设计在单因素实验基础上，分别选取乙醇浓度（A）、液料比（B）、浸泡时间（C）为自变量，运用Design Expert 8.0.6软件中Box-behnken 响应面实验设计方法，以没食子酸含量和盐酸小檗碱含量为因变量，依据其综合评分Y优选最佳醇提工艺参数5,因素水平及试验设计与结果见表2、表3。对表中实验数据进行多元线性和非线性回归分析,得到综合评分（Y）对乙醇浓度（A）、液料比（B）、浸泡时间（C)的二次多项式回归方程：Y=109.64092-0.22924 A-0.89516 B-1.59606 C+0.079886 AB+0.33041 AC+0.048877 BC-0.013410 A 0.22082 B?-2.94319 C。方差分析及回归系数（见表4）显示响应面回归模型显著(P0.05）,表明具有良好的拟合性。自变量B、A C、C2对响应值影响显著（P 乙醇浓度（A）浸泡时间（C）,结合回归方程绘制所得各因素交互作用的响应面及等高线图，等高线图呈椭圆型表示两因素交互作用较强，圆形则表示交互作用较弱；响应面图越陡峭则两因素交互作用越强，反之,则越弱，具体见图2。由DesignExpert8.0.6软件预测最佳醇提工艺为：8 5%乙醇，液料比12.5：1，浸泡110小时,综合评分94.8 4。熊成欢，等Box-behnken响应面法优选肾风止痒方提取工艺研究表1肾风止痒方单因素考察结果2.5模型验证试验含量mg/g复方(相对分值)综合没食子酸盐酸小檗碱评分1.0254(100)1.3628(50.93)2.1545(80.51)2.4311(90.85)2.6760(100)1.8373(68.66)1.9763(84.39)2.3023(98.31)2.2431(95.79)2.1884(100)2.2677(96.84)2.3418(100)2.0847(89.02)1.7430(67.66)2.4115(93.61)2.4990(97.00)2.5762(100)2.4950(96.85)结合实际生产情况，可将按最佳醇提工艺参数调整为7 5%乙醇，液料比12:1,浸泡96 小时，并进75.46行三批验证实验，综合评分平均值为9 5.0 2,RSD86.74为0.15%，与预测值（94.8 4）较接近，表明该优化92.4993.6669.9383.2692.0293.6698.4297.4886.6565.6896.3896.7610097.91醇提取工艺稳定、重复性好、可操作性强。表2 因素水平表编码水平因素-1A乙醇浓度（%）B液料比(mL/g)C浸泡时间(d)表3响应面设计方案及实验结果A乙醇B液C浸含量(mg/g药材)编号浓度料比泡时没食盐酸小(%）(mL/g)间(d)子酸碱评分16528536548556568576588597510751175127513751475157516751775来源平方和自由度均方F值P值显著性模型166.70A-乙醇浓度11.56B-液料比38.32C-浸泡时间0.13AB15.95AC43.67BC0.060A27.57B28.02C236.47残差25.64失拟项19.43纯误差6.21总和192.35(注：*P0.05,差异显著)065757.510347.542.03957.541.891812.542.003512.541.88971032.16961031.91341052.02391051.91697.531.881312.531.95937.551.943412.552.05151042.00401042.15961042.06031042.06061042.0158表4方差分析结果918.525.060.0220111.563.150.1190138.3210.460.014410.130.0360.8556115.954.360.0753143.6711.920.010710.0600.0160.902017.572.070.193718.022.190.1825136.479.960.016073.6636.484.170.100641.551618512.55综合2.425192.012.266385.662.464591.912.694193.552.433395.162.263486.102.106085.732.462989.892.254985.202.406889.822.344288.292.485193.402.558093.662.460595.432.486293.622.423592.472.472092.33*一7 9 一贵阳学院学报（自然科学版）(季刊)18卷A1009590858012.5011.2510.00B:液料比8.757.5065.00D5.00综合评分904.504.003.503.00-65.003讨论为确保药效物质的有效提取,选择适宜的评价指标和提取方法尤为关键，单因素考察、正交实验、均匀设计、响应面设计等多种提取方法常应用于复方制剂的工艺制备中。针对中药复方的多成分多指标多靶点特性，在多因素数量处理试验的分析中，响应面法可通过分析试验指标（因变量)与多个试验因素（自变量)间的回归关系,得出合理的回归关系曲线或曲面，最终确定适宜的参数，该方法在中药及食品研究中广泛使用6 本文在单因素实验基础上，选择与复方主治作用密切相关的具有抗炎、抗菌、抗病毒作用的没食子酸及有广谱抗菌、解热作用的盐酸小檗碱为院合评价指标7-8,采用Box-behnken 响应面分析软件筛选肾风止痒方的提取工艺参数，相较于其他方法更具有动态考察意义，也适于观测各因素之间的交互影响。通过Box-behnken响应面法优选肾风止痒方的较佳提取工艺参数为8 5%乙醇，液料比12.5mL/g,浸泡110 小时。因提取溶剂和浸渍时间的响应面模型不够显著，说明两因素单独对提取过程中的指标损失的影响有限,但也应注意二者共同作用却能显著影响指标提取率。故而在响应面法筛选的较佳工艺基础上尝试降低乙醇消耗量和浸泡时间,进而在此工艺基础上尝试降低乙醇消耗量同时适当缩短提取时间，即以7 5%乙醇，液料比12:1（m L/g）,浸泡96 小时为最终提取工艺。通过三批一 8 0 一B12.5011.2510.008.7585.0080.0075.0070.00A:乙醇浓度E1009295509085948090888670.0075.00A:乙醇浓度图2肾风止痒方提取物响应面分析图（A,C,E)及等高线图（B,D,F)宁：辽宁中医药大学，2 0 18.综合评分945。927.5065.005.004.504.0080.0085.00C100959085809088870.0075.00A:乙醇浓度C:浸泡时间3.503.007.508.75验证实验，最终提取工艺与响应面法预测结果相近,说明优化结果可行，降低了乙醇消耗,缩短了提取时间，减少成本,更便于操作，可作为生产提取工艺条件,对肾风止痒乳膏的研制提供科学可靠的提取方案。参考文献：1中国中医药信息学会外治分会.中药乳膏剂临床外用技术规范（草案）J.中国实验方剂学杂志，2 0 2 0,2 6(9):81-83.2中药、天然药物局部刺激性和溶血性研究技术指导原则课题研究组.中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则S.北京：国家食品药品监督管理局药品审评中心.2 0 0 5.3许倩倩，包贝华，张丽，等.响应面法优化乌鼓莓的提取工艺J.药学与临床研究,2 0 19,2 7（4）：2 57-2 6 0.【4侯晓军，唐菱，周芃，等.星点设计-效应面法优化硼酸乳膏基质配方及质量控制J.中国药师,2 0 16,19（5）：879-883.5吴红伟，李东辉,边甜甜，等.基于响应面法结合熵权法多指标优选黄芪药材产地加工炮制一体化工艺J.中草药,2 0 2 1,52(19):58 54-58 6 1.6孙丽娜，杨源涛,王雪怡，等.响应面优化法在药学领域的应用J.科技创新与应用,2 0 17,2 3:36-37.7郑雪花,杨君，杨跃辉.没食子酸药理作用的研究进展J.中国医院药学杂志,2 0 17,3（1)：94-98.8刘彦辰.盐酸小檗碱的抑菌抗炎作用机理研究D.辽责任编辑屏王建蕊5.004.504.0080.0085.00F5.001884.504.00903.5012.5011.2510.00B:液料比85.0080.0075.003.5070.00C:浸泡时间3.0065.00综合评分925。9 4883.007.50A:乙醇浓度8.7510.00B:液料比11.2512.50