DDR1对结直肠癌侵袭和上皮细胞间质转化的影响.pdf

分子诊断与治疗杂志2023年7月第15卷第7期J Mol Diagn Ther,July 2023,Vol.15No.7论著作者单位：1.日照市人民医院生殖医学科，山东，日照 2768002.日照市人民医院检验科，山东，日照 2768003.日照市妇幼保健院产科，山东，日照 276800通信作者：孙良臣，Email：DDR1对结直肠癌侵袭和上皮细胞间质转化的影响任清霞1田斌2苏彤2孙良臣3摘要 目的探究盘状结构域受体 1（DDR1）对结直肠癌侵袭、上皮间质转化（EMT）的影响及机制。方法收集 2018 年 1 月至 2021 年 1 月在日照市人民医院进行外科手术肿瘤切除治疗的 60 例结直肠癌癌组织及其癌旁组织。免疫组化检测结直肠癌组织和癌旁组织中 DDR1 蛋白表达水平。体外培养人结肠上皮细胞和结直肠癌细胞，Western blot 检测 DDR1蛋白表达水平。随后结直肠癌上皮细胞分为转染 DDR1 阴性干扰片段组（DDR1NC）、转染 DDR1 干扰片段组（DDR1siRNA）、过表达 DDR1 无关片段组（OVENC）和过表达 DDR1 组（OVEDDR1），Western blot 检测 DDR1、IL6、pSTAT3 和 EMT 相关蛋白表达变化。Trasnswell 检测结直肠癌细胞侵袭情况。结果与癌旁组织相比，结直肠癌组织 DDR1蛋白阳性表达率明显增加，差异有统计学意义（c2=20.979，P0.05）。与人结肠上皮细胞相比，结直肠癌细胞DDR1蛋白表达明显增加差异有统计学意义（t=2.970、8.398、4.977、5.253，P0.05）。与 DDR1NC 组相比，DDR1siRNA 组细胞 DDR1、IL6、pSTAT3 蛋白表达降低，差异有统计学意义（t=3.533、4.021、3.864，P0.05），结直肠癌细胞侵袭能力降低，差异有统计学意义（t=6.695，P0.05）、EMT 进程被抑制。与 OVENC组相比，OVEDDR1 组细胞 DDR1、IL6、pSTAT3 蛋白表达升高，差异有统计学意义（t=4.752、6.759、4.896，P0.05），结直肠癌细胞侵袭能力增加，差异有统计学意义（t=4.181，P0.05），促进 EMT 进程。结论DDR1在结直肠癌细胞中表达升高，其能够通过调控IL6/STAT3信号促进结直肠癌细胞侵袭和EMT。关键词 结直肠癌；盘状结构域受体 1；侵袭；上皮间质转化；IL6/STAT3 信号Effect of DDR1 on invasion and epithelialmesenchymal transition of colorectal cancerREN Qingxia1，TIAN Bin2，SU Tong2，SUN Liangchen3（1.Department of Reproductive Medicine，Rizhao Peoples Hospital，Rizhao，Shandong，China，276800；2.Department of Clinical Laboratory，Rizhao Peoples Hospital，Rizhao，Shandong，China，276800；3.Department of Obstetrics and Gynecology，Rizhao Maternal and Child Health Hospital，Rizhao，Shandong，China，276800）ABSTRACTObjectiveTo investigate the effect and mechanism of discoid domain receptor 1（DDR1）on invasive epithelialmesenchymal transition（EMT）in colorectal cancer.MethodsFrom January2018 to January 2021，60 cases of colorectal cancer and their paracancerous tissues underwent surgical tumorresection in Rizhao Peoples Hospital were collected.Immunohistochemistry was used to detect the expressionlevel of DDR1 protein in colorectal cancer and adjacent tissues.Human colon epithelial cells and colorectal cancer cells were cultured in vitro，and the expression level of DDR1 protein was detected by Western blot.Colorectal cancer epithelial cells were then divided into DDR1negative interfering fragment group（DDR1NC），DDR1 interfering fragment transfecting group（DDR1siRNA），DDR1overexpressing irrelevant fragment group（OVENC），and DDR1overexpressing group（OVEDDR1），Western blot was used to detectthe expression changes of DDR1，IL6，STAT3 and EMTrelated proteins.The invasion of colorectal cancercells was detected by Trasnswell.ResultsCompared with adjacent tissues，the expression of DDR1 proteinin colorectal cancer tissues was significantly increased（P0.05）.Compared with human colon epithelial cells，the expression of DDR1 protein in colorectal cancer cells was significantly increased（P0.05）.Compared with 1182分子诊断与治疗杂志2023年7月第15卷第7期J Mol Diagn Ther,July 2023,Vol.15No.7DDR1NC group，the expression of DDR1，IL6 and pSTAT3 proteins in DDR1siRNA group decreased（P0.05），the invasive ability of colorectal cancer cells was decreased（P0.05），and the EMT process was inhibited.Compared with the OVENC group，the expression of DDR1，IL6 and pSTAT3 proteins were increased（P0.05），the invasive ability of colorectal cancer cells was increased（P0.05），and the EMT process was promoted in the OVEDDR1 group（P0.05）.ConclusionThe expression of DDR1 is increased in colorectal cancer cells，and it can promote colorectal cancer cell invasion and EMT by regulating IL6/STAT3 signaling.KEY WORDSColorectal cancer；Discoid domain receptor 1；Invasion；Epithelialmesenchymaltransition；IL6/STAT3 signaling结直肠癌是临床上常见的恶性肿瘤，具有发病隐匿、预后差等特点，严重的威胁了患者的生命健康。2020年全球癌症发病数据显示，我国癌症新发病例 457 万，其中结直肠癌位居第二。癌症病死例300 万，结直肠癌位居第五位1，但是有关其发病机制尚不清楚。盘状结构域受体 1（discoid domain receptor 1，DDR1）是受体酪氨酸蛋白激酶家族成员之一，参与了肿瘤细胞的生物学行为，包括增殖、凋亡、侵袭以及上皮间质转化（epithelialmesenchymaltransition，EMT）等23。新近研究发现 DDR1 蛋白表达水平与结直肠癌细胞的迁移密切相关，抑制DDR1 表达能够减弱结直肠癌细胞迁移能力4，表明DDR1可能是结直肠癌的新的潜在表达分子。EMT 是肿瘤细胞具有侵袭和转移的必要条件之一，在结直肠癌组织和细胞上皮标志性蛋白E钙黏蛋白（Ecadherin）表达下调，间质样 N钙粘蛋白（Ncadherin）和波形蛋白（Vimentin）表达上调5，提示 EMT 与结直肠癌进展密切相关。因此，通过调节结直肠癌细胞 EMT 对于改善疾病进展具有重要意义。IL6/STAT3 信号通路活化是肿瘤细胞发生间质转化和血管新生的重要因素6。新近研究发现抑制 IL6/STAT3 信号通路活化能够抑制结直肠癌细胞 EMT 进程7。但是有关 DDR1对结直肠癌细胞侵袭和 EMT 的影响是否与调控IL6/STAT3 信号通路尚不清楚。为此，本研究拟通过组织层面和细胞功能层面探究 DDR1 对结直肠癌细胞侵袭和 EMT 的影响及机制，以期为结直肠癌治疗的潜在生物靶点提供依据。1材料与方法1.1材料1.1.1临床资料收集 2018 年 1 月至 2021 年 1 月在日照市人民医院行结直肠癌手术切除患者 60 例，且所有患者均经病理医生确诊。结直肠癌组织及癌旁组织于液氮内或福尔马林中保存。纳入标准：患者为首次发现、且术前未接受过放、化疗。排除标准：伴有肿瘤病灶转移，且存在其他恶性肿瘤患者。研究经院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。1.1.2细胞与主要试剂人 结 肠 上 皮 细 胞（FHC）和 结 直 肠 癌 细 胞（DLD1、SW480、SW620 和 HCT15）购自中科院上海细胞库；免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥公司，货号；SP9001）；DMEM 细胞培养基（美国Gibco 公司）；胎牛血清（Fetal Bovine Serum。FBS）（美国 Gibco 公司）；DDR1 抗体、Ecadherin 抗体、Ncadherin 抗 体、Vimentin 抗 体、IL6 抗 体、pSTAT3 抗 体（美 国 Cell Signaling Technology，货 号：3917、8242、80477、15101、12912、9145）；Transwell 小室（美国 Corning 公司）；Lipofectamine2000 转染试剂盒（广州锐博生物技术有限公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、ECL 发光液、actin小鼠单克隆抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗（上 海 碧 云 天 生 物 技 术 公 司，货 号：P0011、P0018FS、AF5001、A0409、A0413）。1.1.3仪器组织细胞研磨仪（北京博普特科技有限公司，型号：MiniBeadb）；酶标仪（山东恒美科技公司，型号：HMSY96S）；ChemiDoc XRS+成像系统（美国BioRad 公司）；离心机（美国贝克曼库尔特，型号：Optima MAXTL）；荧光显微镜（广州市明慧科技有限公司，型号：NIB620FL）。1.2方法1.2.1免疫组化检测 DDR1 蛋白表达依据免疫组化检测试剂盒进行结直肠癌组织及癌旁组织中 DDR1 蛋白相对表达，DDR1 蛋白染色呈棕色颗粒。以细胞上皮和细胞质无着色或着色面积小于 10%定性为 DDR1 蛋白阴性表达；细胞上皮和细胞质着色大于等于 10%定性为DDR1 蛋白阳性表达。1183分子诊断与治疗杂志2023年7月第15卷第7期J Mol Diagn Ther,July 2023,Vol.15No.7DDR1bactinFHCDLD1SW480SW620CHT15135 kDa42 kDa1.51.00.50.0FHCDLD1SW480SW620CHT15aaaaThe expre ession of DDR1A AB B1.2.2细胞培养、转染过表达人结肠上皮细胞和结直肠癌细胞采用含 10%的胎牛血清 DMEM 培养基，并放置于 37、5%CO2细胞培养箱内培养。当细胞生长融合度到达60%70%时，使用质粒 2000 转染试剂盒分别转染DDR1 无关片段（DDR1NC 组）、DDR1 干扰片段（DDR1siRNA 组），过 表 达 DDR1 无 关 片 段 组（OVENC）和过表达 DDR1 组（OVEDDR1），转染时间为 48 h，Western blot 检测转染效果。依据转染试剂盒说明书进行相关操作。1.2.3细胞侵袭实验Transwell 小室的滤膜采用 ECM gel 覆盖，小室加入 10%FBS 培养基 0.5 mL，上室中加入适当的细胞悬液，200 L/每孔，2106/L，每组设置 3 个复孔。各组细胞常规培养 48 h，4%的多聚甲醛固定，结晶紫染色，400 倍显微镜下随机选取 5 个视野观察穿过膜细胞平均数。1.2.4Western blot 实验人结肠上皮细胞和结直肠癌细胞加入细胞裂解液后于冰上裂解；4，12 000 r/min（离心半径=6 cm），离心 10 min，吸取组织上清液；BCA 法测定蛋 白 质 浓 度；蛋 白 上 样；凝 胶 电 泳；湿 转 法 转膜；5%BSA 室 温 封 闭 2 h；分 别 加 DDR1 一 抗（11 000）、Ecadherin 一抗（1 500）、Ncadherin一抗（1500）、Vimentin 一 抗（11 000）、IL6一 抗（1500）、pSTAT3 一抗（1 1 000）及 actin一抗（1 2 000），4 孵育过夜；加对应的山羊抗兔二抗或者山羊抗鼠二抗（1 5 000），室温孵育 12 h；加吐温 20 磷酸盐缓冲溶液洗涤 3 次，每次 5 min，加入显影液，显影并拍照。1.3统计学分析采用 SPSS 20.0 软件进行数据分析。计量资料以（x s）表示，两组间比较采用 t 检验。以 P0.05 差异有统计学意义。2结果2.1结直肠癌组织中 DDR1 蛋白表达免疫组化检测显示 DDR1 主要定位表达结直肠上皮细胞膜和细胞质中，与癌旁组织相比，结直肠癌组织中 DDR1 蛋白阳性表达率为 75.0%（45/60），显著高于癌旁组织 DDR1 蛋白阳性表达率 33.3%（20/60），差异有统计学意义（c2=20.979，P0.01）。见图 1。2.2结直肠癌细胞中 DDR1 蛋白表达与人正常结肠上皮细胞相比，结直肠癌细胞中DDR1 蛋白表达水平均显著升高，差异有统计学意义（t=2.970、8.398、4.977、5.253，P0.05）。见图2。2.3细胞转染效果与 DDR1NC 组相比，DDR1siRNA 组细胞DDR1 蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（t=3.533，P0.05）。与 OVENC 组相比，OVEDDR1组细胞 DDR1 蛋白表达显著增加，差异有统计学意义（t=4.752，P0.05）。见图 3。2.4DDR1 对结直肠癌细胞侵袭的影响与 DDR1NC 组 相 比，DDR1siRNA 组 细 胞侵袭能力显著降低，差异有统计学意义（t=6.695，P0.05）。与 OVENC 组相比，OVEDDR1 组细胞侵袭能力显著增加，差异有统计学意义（t=4.181，P0.05）。见图 4。A AB B注：A，癌旁组织；B，结直肠癌癌组织。图 1结直肠癌组织 DDR1 蛋白表达水平（EnVision，400）Figure 1Expression level of DDR1 protein in colorectalcancer tissue（EnVision，400）注：A 为 DDR1 蛋白条带；B 为 DDR1 蛋白表达定量柱状图。与 FHC 相比，aP0.05。图 2DDR1 蛋白表达水平（xs，n=3）Figure 2The expression of DDR1（xs，n=3）DDR1NCDDR1siRNAOVENCOVEDDR1DDR1bactin135 kDa42 kDa3210The expression of DDR1DDR1NCDDR1siRNAOVENCOVEDDR1abA AB B注：A 为 DDR1 蛋白条带；B 为 DDR1 蛋白表达定量柱状图。与 DDR1NC组相比，aP0.05；与OVENC组相比，bP0.05。图 3Western blot 检测结直肠癌细胞转染后 DDR1 蛋白表达（xs，n=3）Figure 3Western blot detection of DDR1 protein expressionin colorectal cancer cells after transfection（xs，n=3）1184分子诊断与治疗杂志2023年7月第15卷第7期J Mol Diagn Ther,July 2023,Vol.15No.72.5DDR1 对结直肠癌细胞 EMT 进程的影响与 DDR1NC 组 相 比，DDR1siRNA 组 细 胞Ecadherin 蛋白表达显著增加（t=3.012，P0.05），Ncadherin 蛋白和 Vimentin 蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（t=2.993、4.995，P0.05）。与OVENC 组相比，OVEDDR1 组细胞 Ecadherin 蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（t=3.980，P0.05），Ncadherin 蛋白和 Vimentin 蛋白表达显著增加，差异有统计学意义（t=3.264、3.395，P0.05）。见图5。2.6DDR1 对结直肠癌细胞 IL6/STAT3 信号通路的影响与DDR1NC组相比，DDR1siRNA组细胞IL6、pSTAT3 蛋白表达均显著降低，差异有统计学意义（t=4.021、3.864，P0.05）。与 OVENC 组相比，OVEDDR1 组细胞 IL6、pSTAT3 蛋白表达均显著增加，差异有统计学意义（t=6.759、4.896，P0.05）。见图 6。3讨论结直肠癌是消化系统常见的一种恶性肿瘤，临床上主要以手术治疗方式，但是术后复发、转移较高，而 EMT 是结直肠癌发生转移的必要条件8。研究发现通过 EMT，上皮细胞能够转化为具有抗凋亡、降解细胞外基质、促进侵袭和转移等特点的间充质细胞910。近年来，有关 EMT 与结直肠癌侵袭和转移的研究增加，相关研究均已证实抑制 EMT 进程能够有效减弱结直肠癌细胞侵袭和转移，改善肿瘤细胞恶性增殖11。因此，通过调控 EMT 对于结直肠癌的治疗具有重大意义。DDR1 参与细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移以及细胞外基质重塑，在机体多种病理生理过程中发挥重要作用12。伴随分子生物学的发展，众多学者研究发现 DDR1 在胃癌、乳腺癌、肝癌等多发肿瘤中均有不同程度表达，提示与肿瘤的发生发展相关13。新近研究证实 DDR1 在结直肠癌中表达升高，与肿瘤的病理分型、临床特征以及预后相关，提示 DDR1 可能是结直肠癌发生发展的重要潜在靶点14。本实验通过组织和细胞验证发现结直肠癌组织和细胞中 DDR1 蛋白表达明显增加，与Chen 等15研究结果一致。另外，研究已证实通过靶向抑制 DDR1 活性能够改善肿瘤细胞微环境，从而抑制结直肠癌细胞侵袭和转移16。本实验研究发现在结直肠癌细胞中转染 DDR1siRNA 能够抑制细胞侵袭，而过表达 DDR1 能够显著增加结直肠癌细胞侵袭能力，表明 DDR1 可能是结直肠癌的关键靶点。以往研究证实 DDR1 过表达能够导致 Ecadherin 表达降低，Vimentin 蛋白增加，从而促进裸鼠移植瘤增殖、迁移和侵袭，证实了EcadherinNcadherinVimentinactinDDR1NCOVENCDDR1siRNAOVEDDR1120 kDa140 kDa57 kDa42 kDa2.01.51.00.50.0The expression of Ncadherin（to actin）2.01.51.00.50.0DDR1NCDDR1siRNAOVENCOVEDDR1DDR1NCDDR1siRNAOVENCOVEDDR1DDR1NCDDR1siRNAOVENCOVEDDR1The expression of Ecadherin（to actin）The expression of Vimentin（to actin）2.01.51.00.50.0aabbabbA AB BC CD DDDR1NCDDR1siRNAOVENCOVEDDR124 kDa80 kDa42 kDaIL6pSTAT3bactin2.52.01.51.00.50.0Rclative protein cxpression（normalized to bactin）IL6pSTAT3DDR1NCDDR1siRNAOVENCOVEDDR1bbaaA AB BDDR1NCDDR1siRNAOVENCOVEDDR12.52.01.51.00.50.0Cell number pre field（fold change）DDR1NCDDR1siRNAOVENCOVEDDR1abA AB B注：A 为结直肠癌结晶紫染色（100）；B 为结直肠癌细胞侵袭能力相对定量柱状图。与 DDR1NC 组相比，aP0.05；与 OVENC 组相比，bP0.05。图 4DDR1 对结直肠癌细胞侵袭的影响（xs，n=3）Figure 4The effect of DDR1 on the invasion of colorectalcancer cells（xs，n=3）注：A 为 EMT 相关蛋白条带；BD 为 EMT 相关蛋白定量柱状图。与 DDR1NC 组相比，aP0.05；与 OVENC 组相比，bP0.05。图 5结直肠癌细胞 EMT 相关蛋白表达（xs，n=3）Figure 5Expression of EMTrelated proteins in colorectalcancer cells（xs，n=3）注：A 为 IL6/STAT3 信号通路蛋白条带；B 为 IL6、pSTAT3 蛋白相对定量柱状图。与 DDR1NC 组相比，aP0.05；与 OVENC 组相比，bP0.05。图 6结直肠癌细胞 IL6/STAT3 信号通路相关蛋白表达（xs，n=3）Figure 6Expression of IL6/STAT3 signaling pathwayrelated proteins in colorectal cancer cells（xs，n=3）1185分子诊断与治疗杂志2023年7月第15卷第7期J Mol Diagn Ther,July 2023,Vol.15No.7DDR1 可以通过 EMT 途径促进胃癌的侵袭和转移17。本研究结果显示与 DDR1NC 组相比，DDR1siRNA 组细胞 Ecadherin 蛋白表达显著增加，Ncadherin 蛋白和 Vimentin 蛋白表达显著降低。过 表 达 DDR1 后 结 直 肠 癌 细 胞 Ecadherin蛋白表达显著降低，Ncadherin 蛋白和 Vimentin 蛋白表达显著增加。以上结果证实 DDR1 可以通过调控 EMT 参与结直肠癌细胞侵袭。IL6/STAT3 信号通路可以直接促进肿瘤细胞增殖和存活，被认为是结直肠癌发生的关键通路之一18。研究发现 IL6 能够介导 STAT3 磷酸化促进结直肠癌细胞增殖、侵袭和转移，发挥抗凋亡作用19。IL6/STAT3 信号通路作为结直肠癌细胞EMT 的关键通路之一。IL6 能够介导 STAT3 活化，促进下游因子 Fra1 表达，从而通过 EMT 诱导转录因子和基质金属蛋白酶，增加结直肠癌细胞侵袭能力20。本研究结果显示与 DDR1NC 组相比，DDR1siRNA 组细胞 IL6、pSTAT3 蛋白表达均显著降低。与 OVENC 组相比，OVEDDR1 组细胞 IL6、pSTAT3 蛋白表达均显著增加，表明DDR1 能够通过 IL6/STAT3 信号促进结直肠癌细胞侵袭。综上所述，本研究通过组织层面和细胞功能学实验探究了 DDR1 对结直肠癌细胞侵袭和 EMT的影响。结果显示 DDR1 在结直肠癌细胞中表达升高，其能够通过调控 IL6/STAT3 信号介导 EMT从而促进结直肠癌细胞侵袭。参考文献1Sung H，Ferlay J，Siegel RL，et al.Global Cancer Statistics2020：GLOBOCAN Estimates of Incidence and MortalityWorldwide for 36 Cancers in 185 Countries J.CA Cancer 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