m6A-SAC-seq在单核苷酸分辨率水平检测RNAm6A修饰.pdf

复旦学报（医学版）Fudan Univ J Med Sci2023 May，50（3）m6A-SAC-seq在单核苷酸分辨率水平检测RNA m6A修饰孟瀚哲1，2 何维志2 胡璐璐1，2（1复旦大学生物医学研究院 上海 200032；2复旦大学肿瘤研究所 上海 200032）【摘要】目的建立 m6A 特异性烯丙基标记测序（m6A-selective allyl chemical labeling and sequencing，m6A-SAC-seq）实验方法体系，在单核苷酸分辨率水平对 RNA 的 N6-甲基腺苷（m6A）修饰进行检测。方法m6A 烯丙基标记测序（m6A-SAC-seq）使用特异性甲基转移酶 MjDim1对 m6A 添加烯丙基标记成为 N6-烯丙基-甲基腺苷（am6A），使用 I2处理产生 N1，N6-环化腺苷（A）产物，在逆转录时引入突变，从而实现在单核苷酸分辨率水平的检测。通过HPLC 法纯化甲基转移酶 MjDim1，使用探针及液相色谱-质谱联用系统（LC-MS/MS）检测 m6A 的转换率，计算MjDim1活性作为质控。提取样品 RNA，用烯丙基标记 m6A，并用 m6A-SAC-seq技术构建文库，测序后通过数据分析得到 m6A 位点信息，通过标准曲线校准计算得到 m6A 的含量。结果m6A-SAC-seq处理后，HIV 逆转录酶识别环化的 am6A 位点，引入突变，但附近未修饰位点不发生突变。通过特定的 A 突变成 T/C的突变位置（A to T/C）来识别 m6A 位点，并添加内参探针，用标准曲线来定量 m6A 含量。结论m6A-SAC-seq 技术仅需 30 ng 的 mRNA 或去除了 rRNA的总 RNA样本就可以实现 m6A位点在单核苷酸分辨率水平的检测。【关键词】RNA甲基化；m6A甲基化；单核苷酸分辨率；m6A-SAC-seq；测序方法【中图分类号】Q3-3 【文献标志码】A doi：10.3969/j.issn.1672-8467.2023.03.017m6A-SAC-seq method detecting RNA m6A modification at single nucleotide resolution levelMENG Han-zhe1，2，HE Wei-zhi2，HU Lu-lu1，2（1Institutes of Biomedical Sciences，Fudan University，Shanghai 200032，China.；2Fudan University Shanghai Cancer Institute，Shanghai 200032，China）【Abstract】Objective To establish a step-by-step protocol of m6A-selective allyl chemical labeling and sequencing（m6A-SAC-seq）for detection of N6-methyladenosine（m6A）modifications of RNA at single nucleotide resolution level.Methods m6A-SAC-seq used specific methyltransferase MjDim1 to add allyl group to m6A，generating am6A.Then I2 was added to produce N1，N6-cyclized adenine（A）products.Mutations were introduced during reverse transcription to achieve single-nucleotide resolution detection.Methyltransferase MjDim1 was purified by HPLC.The conversion rate of m6A was calculated by probe and liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/MS）to determine the activity of MjDim1 as quality control.Sample RNA was extracted and m6A sites were labeled with allyl group.The DNA library was constructed with m6A-sac-seq technology and sent for high-throughput sequencing.After sequencing，m6A sites were inferred via data analysis.The stoichiometry of m6A was calculated by standard curve calibration.Results After m6A-SAC-seq treatment，HIV reverse transcriptase recognized the cyclized am6A sites and introduced mutations during reverse transcription while the unmodified sites nearby remain unmutated.m6A sites could be identified by the specific mutation of A to T/国家重点研发计划（2021YFA1100400）Corresponding author E-mail： 网络首发时间：2023-05-09 14 46 50 网络首发地址：https：/ 5月，50（3）C.Stoichiometry of m6A could be quantified by addition of spike-in probes and calibrating the mutation rate with the standard curve.Conclusion By using m6A-SAC-seq method，only 30 ng of mRNA or rRNA depleted total RNA samples and is capable to detect RNA m6A sites at single-nucleotide resolution.【Key words】RNA methylation；m6A methylation；single nucleotide resolution；m6A-SAC-seq；sequencing methods*This work was supported by the National Key R&D Program of China(2021YFA1100400).RNA修饰在基因表达调控中扮演重要角色，哺乳动物中最丰富的 mRNA内部修饰是 m6A修饰。m6A修饰参与RNA的转录、加工、剪切、翻译和降解过程1-4，研究显示m6A RNA甲基化与多种癌症的发生发展以及人类多种复杂疾病密切相关5-7。在近年的研究中，最常用的鉴定 m6A 甲基化方法 是 m6A 免 疫 沉 淀 测 序（methylated RNA immunoprecipitation sequencing，MeRIP-Seq）和 免疫沉淀定位法（m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation，miCLIP）8-9。然而，这些基于抗体的方法有一些显著的局限性，包括重复性不高10、分辨率较低、需要大量样本以及在不同条件下比较 m6A 甲基化的能力有限，无法精确检测 m6A甲基化的变化。为了在单核苷酸分辨率上检测和量化转录组中m6A的水平，本文根据参考文献11进行改进，建立了m6A特 异 性 烯 丙 基 化 学 标 记 测 序（m6A-selective allyl chemical labeling and sequencing，m6A-SAC-seq）体系，并且保持较好的稳定性和重复性。该方法使用甲基转移酶MjDim1，替换常规的辅酶S-（5-腺苷）-L-同型半胱氨酸（S-（5-Adenosyl）-L-homocysteine，SAM）为烯 丙 基-S-（5-腺 苷）-L-同 型 半 胱 氨（allyl-S-（5-Adenosyl）-L-homocysteine，Allyl-SAM），从而将RNA m6A加上烯丙基，成为am6A，通过I2处理将am6A进行环化，成为N1，N6环化A衍生物，HIV逆转录酶识别该环化产物并在逆转录时引入突变，构建文库，进行高通量测序后通过数据分析来鉴定 m6A位点。材 料 和 方 法合成 Allyl-SAM 向 100 mg SAM 中加入 1 mL乙酸、1 mL 甲酸、52.0 mg 高氯酸银和 2.125 mL 烯丙基溴，20 搅拌 8 h。加入 20 mL 0.1%三氟乙酸，使反应淬灭。转移水相，用乙醚洗涤，使用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）（型号：176803000，美国 Waters公司）纯化 Allyl-SAM，-80 保存。m6A RNA 探针混合液的制备 设计和合成修饰含有 m6A 修饰的内参 RNA 探针。该内参探针由上 海 捷 瑞 生 物 工 程 有 限 公 司 合 成，序 列 中 含 有NNm6ANN（N 为 A，U，C 和 G 的混合物）的核心基序，以及特定的 8个核苷酸序列构成的“条形码”，分别代表 m6A 含量为 0、25%、50%、75%和 100%。由含有 m6A 修饰的 RNA 探针和相同序列的未修饰的RNA探针按照特定比例混合而成（附件：表 1）。甲基转移酶 MjDim1 的制备 合成 MjDim1 并将其克隆到 pET-His-SUMO 质粒载体中，转化到T7 感受态细胞（编号：C2566I，美国 New England BioLabs 公司）中，活化菌种过夜，将活化的菌种接种到灭菌的 2YT培养基中，37 C培养 4 h，降温到16，继续培养 2 h，加入终浓度为 0.1 mmol/L 的IPTG 诱导表达，16 培养 1618 h。收集细胞，在裂解缓冲液（1PBS+150 mmol/L NaCl）中，用高压细菌破碎仪裂解细胞。使用镍柱亲和纯化后加Ulp1 酶，4 C 过夜，以去除 SUMO 标签。用洗脱缓冲 液 含20 mmol/L Tris-HCl（pH=7.5）、150 mmol/L NaCl和 20 mmol/L 咪唑 洗脱 MjDim1酶。使用 AKTA 蛋白纯化仪，经阴离子交换色谱（型号：Source15-Q，美国 General Electri 公司）和阳离 子 交 换 色 谱（型 号：Source15-S，美 国 General Electric公司）纯化，将蛋白梯度洗脱，采集蛋白峰并浓缩至 1.22.0 mmol/L，加入终浓度为 30%的甘油，于80 分装保存。MjDim1 活性测试 将 3 L 20 mmol/L Allyl-SAM，0.6 L 1 mol/L Tris HCl（pH=8.3）和 3 L 纯水混匀，配置成中和Allyl-SAM。用1结合/清洗缓冲液 含 10 mmol/L Tris-HCl（pH=7.5）、1 mmol/L EDTA 和 2 mol/L NaCl，清 洗 并 重 悬 磁 珠（Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads）（美 国Thermo Fisher Scientific 公司），混匀后对照组和实验组每管分装 50 L。440孟瀚哲，等.m6A-SAC-seq在单核苷酸分辨率水平检测 RNA m6A修饰在实验组中，4 L 中和 Allyl-SAM、1 L m6A RNA 探针混合液（30 ng RNA）、4 L RNA 酶抑制剂（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）、2 L 10 MjDim1反应缓冲液 含 400 mmol/L HEPES（pH=8.0）、400 mmol/L NH4Cl 和 40 mmol/L MgCl2、4 L MjDim1 酶和 7 L 纯水配置成 20 L 反应体系，放 入 PCR 仪 中，50 C 反 应 1 h。期 间 每 隔20 min，在实验组中加入 2 L 10MjDim1 反应缓冲液、2 L RNA 酶抑制剂、8 L 纯水、4 L Ally-SAM 和 4 L MjDim1酶，50 C反应 1 h。在 对 照 组 中，将 1 L m6A RNA 探 针 混 合 液（30 ng RNA）、5 L RNA 酶 抑 制 剂、5 L 10MjDim1反应缓冲液和 39 L纯水配置成 50 L反应体系，50 反应 2 h。每 组 加 入 1 L 100 U/L 核 酸 酶（美 国 New England BioLabs 公司）、2 L 10核酸酶缓冲液和14 L纯水，37 反应过夜。再加入 2 L 1 U/L碱性磷酸酶（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）和2.4 L 10 CIP 脱磷酸缓冲液，37 反应 2 h。使用 LC-MS/MS质谱系统进行活性测试。构建文库 提取样品 mRNA 对于细胞系和新鲜冷冻的组织样本，用 Trizol法或提取试剂盒纯化全转录组RNA。用 Dynabeads mRNA DIRECT 试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific 公司）提取 mRNA，用于检测 mRNA m6A修饰。拆卸 Poly A 并连接接头片段 用 oligo-dT 与RNA 样本的 poly A 尾巴进行退火，用 RNase H（美国 New England BioLabs 公司）消化，去除 poly A 尾巴，然后用 DNase （美国 New England BioLabs公司）去除多余的 oligo-dT，用 RNA 纯化试剂盒（美国Zymo Research 公司）纯化。纯化后超声将 RNA 片段化，37 下用 PNK酶（美国 New England BioLabs公司）末端修复 RNA 30 min，释放 3 羟基，以便下一步进行连接反应。在反应中加入 m6A RNA 探针混合液。使用截短型 T4 RNA 连接酶 2（美国 New England BioLabs公司），25 下将 RNA 片段与 3 接头（附件：表 1）连接。在混合液中添加 1 L 5 去腺苷化酶（美国 New England BioLabs 公司），30 反应 1 h，去掉多余 3 接头上的腺苷化修饰，添加 1 L RecJf（美国 New England BioLabs 公司），37 孵育1 h，消 化 剩 余 的 RNA 接 头 片 段。加 入 1 L 50 mol/L 逆 转 录 引 物（附 件：表 1），75 退 火 5 min，37 退火 15 min，25 退火15 min。标记 m6A位点并进行逆转录 在反应溶液中加入 15 L 磁珠纯化 RNA。洗净磁珠，用 6 L H2O 重悬，RNA 在 70 30 s变性后 4 冷却，消除 RNA 二级结构。添加 2 L 10MjDim1 反应缓冲液（含2 L RNA 酶 抑 制 剂、6 L Allyl-SAM 和 4 L 1.44 mmol/L MjDim1酶），50 反应 1 h。取上清，加入 4 L H2O、1 L 10MjDim1反应缓冲液、1 L RNA酶抑制剂、2 L Allyl-SAM和2 L酶，50 孵育20 min。重复以上步骤7次，标记大多数m6A位点。用 25 L水清洗并重悬，在反应体系中加入 1 L 125 mmol/L I2，充分混合。室温暗反应 1 h后，加入 1 L 40 mmol/L Na2S2SO3，使 I2淬灭。用9 L纯水清洗并重悬，加入 2 L 10AMV-RT缓冲液（美国New England BioLabs公司）、2 L 10 mmol/L dNTP 2、2 L 25 mmol/L MgCl2、1.25 L 0.1 mol/L DTT、2 L RNA 酶抑制剂、2 L HIV-RT 酶（美国Worthington Biochemical公司），37 进行3 h的逆转录反应（图1）。用8 L纯水清洗并重悬。m6A-SAC-seq utilizes MjDim1 and Allyl-SAM as a co-factor to convert m6A to am6A，followed by cyclization upon I2 treatment.Mutations are introduced upon reverse transcription at m6A sites.We could identify m6A sites by specific A to C/T mutation locations and the stoichiometry could be quantified by addition of spike-in calibration probes.图 1m6A-SAC-seq实验原理图Fig 1Schematic diagram of m6A-SAC-seq441复旦学报（医学版）2023年 5月，50（3）连接 cDNA 3接头片段和构建文库 将 1 L RNase H 缓冲液和 1 L RNase H 加入逆转录产物中，37 恒温反应 30 min。清洗反应液体，用不含核酸酶的 H2O 重悬，95 反应 10 min 洗脱 cDNA。用 DNA 纯 化 试 剂 盒（型 号：D4030，美 国 Zymo Research 公司）纯化到 10 L。向 cDNA 溶液中添加2 L 10T4 RNA 连接酶缓冲液、2 L 10 mmol/L ATP、10 L 50%PEG8000、1 L 50 mol/L cDNA 3 接头片段（附件：表 1）和 1 L T4 RNA 连接酶 1（美国 New England BioLabs 公司），25 C 反应过夜（12 h）。用 DNA 纯化试剂盒纯化 cDNA，用 21 L H2O洗脱 cDNA。取 1 L cDNA 溶液用于 qPCR 检测，取 15 L cDNA 溶 液 用 作 建 立 文 库。qPCR 反 应 体 系：1.25 L 10 mol/L Universal PCR 引物（美国 New England BioLabs 公 司），12.5 L 10 mol/L PCR Index 引 物，1 L cDNA 溶 液，1 L 25SYBR Green ，12.5 L 2NEB Next Ultra Q5 Master Mix（美国 New England BioLabs公司），加纯水补至25 L。PCR 反应条件：98 30 s；98 C 10 s，65 75 s，40个循环；65 5 min；恢复至 4。通过qPCR的 Ct值确定最佳建库周期数。用于建立文库的 50 L PCR 反应体系：5 L 10 mol/L Universal PCR 引 物，5 L 10 mol/L PCR Index引物，15 L 纯化后的 cDNA 溶液，25 L 2NEB Next Ultra Q5 Master Mix。PCR 反应条 件：98 30 s；98 10 s，65 75 s，循 环 数 由qPCR结果决定；65 5 min；恢复至 4。使 用 AMPure XP 磁 珠（型 号：A63880，美 国Beckman 公 司）纯 化 DNA 文 库，按 照 Illumina HiSeq X Ten with paired-end 2150 bp 标准（美国Illumina公司）进行测序。数据处理 原始序列数据的准备和质量控制 从 UCSC基 因 组 浏 览 器（https：/hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/）下载人类 hg38参考基因组和转录组文件，从 UCSC 基因组数据库（https：/genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables）下载 ncbiRefSeq GTF 文件，建立参考基因组（附件：数据 1）。从GitHub（https：/ FASTQC 检查原始 FASTQ 文件的质量（附件：数据 2）。通过内参探针的标准曲线来换算 m6A含量 根据内参探针的 m6A 含量和测序得到的突变率计算标准曲线（附件：数据 3）。换算得到转录组中 m6A的 含 量，检 测 每 个 样 本 的 碱 基 突 变 率（附 件：数据 4）。预处理和序列比对 使用 Trimmomatic拆卸低质量的接头和碱基，删除无接头的序列（附件：数据5）。将序列比对到参考基因组，质检后删除低质量序列（附件：数据 6）。突变调用和 m6A 位点识别 通过 SAMtools 和VarScan调用每个 BAM 文件的突变（附件：数据 7）。从 VarScan 的输出中，通过确定最大背景突变率、P值、最小突变率和覆盖率参数来识别 m6A 位点（附件：数据 8）。结 果甲基转移酶 MjDim1的制备 用 HPLC 法纯化MjDim1 蛋白，经过离子交换柱 Source-15 Q 柱后，使 用 Source-15 S 柱 纯 化，收 集 MjDim1 蛋 白 峰（图 2）。SDS-PAGE 电泳凝胶显示的纯化蛋白的条带大小符合 MjDim1 的相对分子质量（32 000，图 3）。最 终 得 到 蛋 白 浓 度 为 1.44 mmol/L 的MjDim1酶。MjDim1 活性测试结果 m6A探针经过 MjDim1酶在20 L反应体系中进行烯丙基标记后，生成am6A。am6A的保留时间约为 5.5 min（图 4）。统计峰面积得到碱基含量，计算m6A的转换率。m6A的转换率计算图 2MjDim1酶的 Source 15-S离子交换纯化曲线Fig 2Source 15-S ion exchange purification curve of MjDim1 enzyme442孟瀚哲，等.m6A-SAC-seq在单核苷酸分辨率水平检测 RNA m6A修饰公 式 为：转 换 率=1-（Aream6A，treated/AreaG，treated）/（Aream6A，control/AreaG，control）100%。经过 MjDim1酶处理不同次数后的 m6A 转换率随 MjDim1酶处理次数增加而上升（图 5），经过 4轮MjDim1酶处理，活性检测探针中含有 100%m6A 的转换率为 92.8%（90%），说明 MjDim1 酶的活性处于较高水平，可以在样品反应中使用。测序分析结果 经过 m6A-SAC-seq 处理后，逆转录酶会在 m6A 位点引入突变，但不会在附近的未修饰位点产生突变，可以通过特定的 A 突变成 U 或者 C 的位点来识别 m6A 位点。在 HeLa细胞系中总共检测出 10 958 个 m6A 位点（图 6）。以其中 4 个m6A位点为例，除 m6A位点以外，m6A位点附近碱基均未产生突变，并且可以得到该 m6A 位点的突变率（图 7）。通过 LC-MS/MS 检测不同 RNA 起始量的条MjDim1 was purified by Source 15-S resin.Lane 1：A bclonal RM19001 Protein marker；Lane 2-7：Purified MjDim1 enzyme.图 3纯化 MjDim1酶的 SDS-PAGE凝胶电泳照片Fig 3SDS-PAGE gel electrophoresis map of purified MjDim1 enzymeA：UHPLC-MS/MS quantitation of the m6A probe after allyl labeling using the fresh MjDim1 enzyme.The acquisition time of am6A（N6-allyl，N6-methyladenosine）is around 5.5 min.B：UHPLC-MS/MS quantitation of G after using the fresh MjDim1 enzyme as control.图 4m6A探针的质谱结果检测 MjDim1 活性Fig 4Results of MjDim1 activity measured by UHPLC-MS/MS quantitation of the m6A probeRNA probes with m6A are treated with MjDim1 and Allyl-SAM cofactor for multiple rounds labeling.The conversion rates of m6A to am6A are calculated from three independent biological replicates.图 5经 MjDim1酶处理不同次数后的 m6A转换率Fig 5Results of m6A conversion rate after different rounds of treatments with MjDim1 enzymeA：Numbers of m6A sites between biological repeats identified by m6A-SAC-seq using the same RNA sample from HeLa cells；B：Calibration curve for each GGACU motif is generated by linear regression.Goodness of fit（R2）of linear regression was also shown.图 6m6A-SAC-seq识别 m6A位点并测量 m6A含量Fig 6Identification of m6A site and measurement of m6A fraction using m6A-SAC-seq443复旦学报（医学版）2023年 5月，50（3）件 下，使 用 MjDim1 标 记 HeLa mRNA m6A 效 率（图 8）。RNA 起始量在 30100 ng，检测结果的差异不显著。RNA 起始量低于 30 ng，构建文库需要的 PCR 循环数比较多，测序的冗余度也会比较高。RNA 起 始 量 100 ng，MjDim1 酶 无 法 充 分 标 记RNA样本中的 m6A。m6A-SAC-seq 还可以通过校准探针来量化突变 率，从 而 得 到 该 位 点 m6A 的 含 量。Chr1：28769034+的 YTHDF2 3 UTR 上的 m6A 位点经过m6A-SAC-seq 处 理 后 的 突 变 率 是 17.39%（图 7）。序列中腺嘌呤的突变率和线性相关性可以采用线性回归模型为：Y=aX+b。其中 Y 为观察到的突变率，X为 m6A 含量比例，得到相关系数 R2=0.9726（图6B）。经过标准曲线对照后，可得到该位点 m6A 含量均在 25%以上。综上，m6A-SAC-seq 仅需 30 ng的 mRNA 样本就可以实现 m6A 位点在单核苷酸分辨率上的检测。讨 论m6A是真核生物中最常见的一种 RNA 修饰，富集在终止密码子附近的 3非翻译区12。近年来，越来越多的研究发现 m6A 与癌症相关，能促进癌细胞增殖，并对放疗或化疗产生耐药性13-15。m6A 甲基化在哺乳动物发育过程中发挥着重要作用，包括胚胎发育、神经发生、性别决定等16-18。m6A-SAC-seq具有以下优势。单核苷酸分辨率，检测精度高 目前普遍使用的 MeRIP-Seq 技术利用特异性抗体选取携带 m6A修饰的 RNA 片段的免疫沉淀来检测 m6A 位点，但MeRIP-seq不能达到单碱基分辨率。m6A-SAC-seq 则能通过特异性甲基转移酶，将样品 mRNA 上的 m6A 标记上烯丙基形成 am6A，通过 I2处理生成 N1，N6环化的 A 的衍生物，通过逆转录引入突变，测序后能在单碱基分辨率水平检测整个转录组中的 m6A 位点，并对其进行定量。相比于依赖抗体的检测方法，m6A-SAC-seq 的分辨率高，图 7使用 m6A-SAC-seq后 m6A位点及其附近碱基的突变率Fig 7Misincorporation rate of specific m6A sites and the adjacent bases with m6A-SAC-seq图 8m6A-SAC-seq使用不同 RNA起始量的 m6A检测效率Fig 8Conversion rate of m6A site using different amounts of input RNA by m6A-SAC-seq444孟瀚哲，等.m6A-SAC-seq在单核苷酸分辨率水平检测 RNA m6A修饰并且可以精确定量。送检样本量要求低，检测样本多样 miCLIP技术是目前常用的达到单核苷酸分辨率水平的检测方法，可通过在结合位点交联抗体，在逆转录过程中诱导突变再测序。但是该方法需要更复杂的操作和更多的测序材料，并且在检测峰值和峰值变化方面的可重复性不高。相比之下，m6A-SAC-seq 只需约 30 ng mRNA或去除了 rRNA 的总 RNA，突破了样本的取样量瓶颈。通过 RNA 内参探针绘制标准曲线，可以准确比较不同条件下的 m6A 含量水平，增加了临床疾病样本取样来源的灵活性。检测步骤简便，重复性良好 PA-m6A-seq19和m6A-CLIP20等多种改良的方法提高了 m6A 位点的检测精度，但上述方法都依赖于 m6A 特异性抗体，灵敏性、重复性和准确性相对较差。m6A-SAC-seq 中建立文库的操作都在磁珠固相上进行，方便进行多次清洗纯化，减少污染概率。m6A-SAC-seq 对 m6A 的标记依赖于酶的特异性识别，比抗体拥有更好的灵敏性、重复性和准确度。然而，m6A-SAC-seq 技术也存在不足和局限性：由 于 MjDim1 酶 偏 向 于 Gm6AC 基 序，对 于Am6AC基序活性较低，未来拟通过改造目前版本的MjDim1 甲基转移酶，以期减少其对特定碱基序列检测时的偏好性。本文描述了 m6A-SAC-seq 技术的实验操作和数据分析流程，m6A-SAC-seq 拥有对各种癌细胞以及临床样本中全转录组 m6A 进行定位和定量的潜力。我 们 认 为 m6A-SAC-seq 将 有 助 于 更 多 RNA m6A 功能方面的研究，并且在临床上对特定基因的m6A修饰含量进行定量检测，为癌症的早期诊断、治疗和预后提供新的研究策略。作者贡献声明孟瀚哲实验操作，数据统计和分析，论文撰写。何维志论文指导和修订。胡璐璐研究构思和设计，论文指导和修订。利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。参 考 文 献1 WANG X，ZHAO BS，ROUNDTREE IA，et al.N（6）-methyladenosine modulates messenger RNA translation efficiency J.Cell，2015，161（6）：1388-1399.2 WANG Y，LI Y，TOTH JI，et al.N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells J.Nat Cell Biol，2014，16（2）：191-198.3 HUANG H，WENG H，CHEN J.The biogenesis and precise control of RNA m6A methylation J.Trends Genet，2020，36（1）：44-52.4 WANG X，LU Z，GOMEZ A，et al.N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stabilityJ.Nature，2014，505（7481）：117-120.5 TONG J，FLAVELL RA，LI HB.RNA m6A modification and its function in diseasesJ.Front Med，2018，12（4）：481-489.6 SUN T，WU R，MING L.The role of m6A RNA methylation in cancerJ.Biomed Pharmacother，2019，112：108613.7 CUI Q，SHI H，YE P，et al.m6A RNA methylation regulates the 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