miR-92a-3p在小鼠胚胎神经管闭合中的作用及机制.pdf

发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4241miR-92a-3p 在小鼠胚胎神经管闭合中的作用及机制张燕秋付佳琳黄琬淇袁正伟顾卉（中国医科大学附属盛京医院卫生部小儿先天畸形重点实验室，辽宁沈阳110004）论著【摘要】目的 探讨 miR-92a-3p 与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）之间的相互作用，以及两者在神经管畸形（neural tube defect，NTD）中对细胞迁移的影响。方法实验动物采用 C57BL/6J 小鼠，孕鼠随机分为 NTD 组与对照组，每组 30 只，NTD 组采用全反式维 A 酸（all-trans retinoic acid，ATRA）诱导 NTD 模型，于 E9.5 采集胚胎样本。实验所用细胞系为小鼠神经干细胞 C17.2，转染 NOX4 过表达质粒、miR-92a-3p 模拟物/抑制剂、模拟物对照/抑制剂对照。采用实时定量 PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测胚胎和C17.2 细胞中 miR-92a-3p 表达，采用蛋白质印迹法检测 NOX4 的表达。通过双荧光素酶报告基因实验明确 miR-92a-3p 对 NOX4 的结合及靶向调控关系。采用细胞划痕实验与 Transwell 实验观察 miR-92a-3p 和NOX4 对细胞迁移活动的影响。统计学方法采用单因素方差分析、独立样本 t 检验。结果NTD 组胚胎 miR-92a-3p 表达低于对照组（0.7530.052 与 1.0060.126，t=3.212，P=0.033），NOX4 蛋白表达高于对照组（0.8700.039 与 0.6880.056，t=4.621，P=0.010）。在转染 NOX4 3 端非翻译区（3 untranslated regions，3 UTR）荧光素酶报告基因的 C17.2 细胞中，共转染 miR-92a-3p 模拟物组的荧光素酶活性低于模拟物对照组（0.3680.102 与 1.0000.149，t=5.530，P=0.005）；共转染 miR-92a-3p 抑制剂组的荧光素酶活性高于抑制剂对照组（1.2540.080 与 1.0000.129，t=2.899，P=0.044）。C17.2 细胞转染 miR-92a-3p 模拟物组，NOX4 的蛋白表达低于模拟物对照组（1.0770.142 与 1.4320.300，t=2.396，P=0.044）；转染 miR-92a-3p 抑制剂组，NOX4 的蛋白表达高于抑制剂对照组（1.4430.054 与 1.2490.090，t=3.709，P=0.010）。细胞划痕的实验结果表明，转染 NOX4 质粒后，细胞伤口愈合的速度低于对照组 （8.86.5）%与（44.16.8）%，t=6.513，P=0.003，然而当过表达 NOX4 的同时转染 miR-92a-3p，与转染 NOX4 组比较，细胞伤口愈合速度加快 （37.211.7）%与（8.86.5）%，t=3.680，P=0.021。Transwell 实验发现，转染 NOX4 质粒后，迁移的细胞数量低于对照组 （102.74.5）与（133.011.8）个，t=4.162，P=0.014，而共转染 NOX4 与 miR-92a-3p 后，与转染 NOX4 组比较，发生迁移的细胞明显增多（176.011.0）与（102.74.5）个，t=10.680，P0.001。结论小鼠 NTD 模型中，异常低表达的 miR-92a-3p 能够通过上调 NOX4 的表达，阻碍小鼠胚胎神经管闭合过程中细胞的迁移活动，最终导致 NTD的发生。【关键词】神经管畸形；细胞迁移；miR-92a-3p；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 4Effect and mechanism of miR-92a-3p on neural tube closure in mouse embryosZhang Yanqiu,Fu Jialin,Huang Wanqi,Yuan Zhengwei,Gu Hui(Key Laboratory of Health Ministry for Congenital Malformation,Shengjing Hospital of China Medical University,Liaoning,Shenyang 110004,China)DOI：10.3969/j.issn.2095-5340.2023.04.001基金项目：国家自然科学基金（81771595；82271730）通信作者：顾卉（Email：）242发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4Corresponding author:Gu Hui (Email:)【Abstract】Objective To investigate the interaction of miR-92a-3p and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4(NOX4),and the impact of them on cell migration in neural tube defect(NTD).MethodC57BL/6J mice were used as the test subjects and pregnant mice were randomly divided into NTD group and control group with 30 mice in each group.NTD model was induced by all-trans retinoic acid(ATRA).Embryo samples were collected at E9.5.The miR-92a-3p mimic/inhibitor,mimic control/inhibitor control,and NOX4 high-expression plasmids were transfected into the mouse neural stem cell C17.2 cell line.Real-time quantitative PCR(RT-qPCR)was used to detect the expression of miR-92a-3p and Western blotting was used to detect the expression of NOX4 in embryos and C17.2 cells,respectively.The binding and targeting relationship of miR-92a-3p to NOX4 was clarified by double luciferase.Finally,the effect of miR-92a-3p and NOX4 on cell migration activity was observed using cell scratch assay and Transwell assay.One-way ANOVA and independent sample t-test were used for statistical analysis.ResultThe expression of miR-92a-3p in NTD group was lower than that in control group(0.7530.052 vs 1.0060.126,t=3.212,P=0.033),and NOX4 protein expression was higher than that in control group(0.8700.039 vs 0.6880.056,t=4.621,P=0.010).In C17.2 cells transfected with the 3 untranslated regions(3 UTR)luciferase reporter gene,the luciferase activity of co-transfected miR-92a-3p mimics was lower than that of the control group(0.3680.102 vs 1.0000.149,t=5.530,P=0.005).The luciferase activity of co-transfected miR-92a-3p inhibitor group was higher than that of inhibitor control group(1.2540.080 vs 1.0000.129,t=2.899,P=0.044).In C17.2 cells transfected with miR-92a-3p mimic,the protein expression of NOX4 was lower than that in the mimic control group(1.0770.142 vs 1.4320.300,t=2.396,P=0.044).On the contrary,after transfected with miR-92a-3p inhibitor,the protein expression of NOX4 was higher than that in the inhibitor control group(1.4430.054 vs 1.2490.090,t=3.709,P=0.010).The results of cell scratch assay showed that the wound healing rate of cells transfected with NOX4 plasmid was lower than that of the control group(8.86.5)%vs(44.16.8)%,t=6.513,P=0.003.However,when co-transfected with NOX4 and miR-92a-3p,cell wound healing rate increased compared with NOX4 group(37.211.7)%vs(8.86.5)%,t=3.680,P=0.021.Transwell assay found that the number of migrating cells transfected with NOX4 plasmid was less than that of the control group(102.74.5)vs(133.011.8),t=4.162,P=0.014.However,after co-transfected with NOX4 and miR-92a-3p,the number of migrating cells increased significantly compared with NOX4 group(176.011.0)vs(102.74.5),t=10.680,P0.001.Conclusion In mouse models of NTD,downregulated miR-92a-3p can inhibit cell migration during neural tube closure in mouse embryos through increasing the expression of NOX4,and ultimately induce NTD.【Key words】Neural tube defect;Cell migration;miR-92a-3p;Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4神经管畸形（neural tube defect，NTD）是由于早期胚胎发育中神经管闭合不完全引起的中枢神经系统疾病1。在神经管的发育过程中，细胞发生迁移是必不可少的2，本课题组前期研究已证明，在全反式维A酸（all-trans retinoic acid，ATRA）诱导的NTD模型中，细胞迁移能力减弱3。本研究将使用ATRA构建的NTD动物模型探究神经管闭合过程中细胞迁移能力减弱的影响因素。MicroRNA（miRNA）可靶向结合mRNA 3端非翻译区（3 untranslated regions，3UTR）抑制靶基因的翻译，从而抑制其蛋白的表达4。miR-92a-3p在癌症的发展中起重要作用，能够加速上皮间质转化过程，促进直肠癌的转移5。然而，miR-92a-3p在NTD中的作用尚不清楚。烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 磷 酸 氧 化 酶 4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）能够作为第二信使，在多种生物学过程中扮演重要角色5-8。有研究者发现，外源发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4243性NOX4抑制肌成纤维细胞的迁移9，近期也有研究结果显示过表达NOX4抑制了肝癌细胞的增殖和迁移10，但NOX4在NTD中对细胞迁移的影响尚未有报道。本课题组前期研究已证实NOX4在NTD中对凋亡与增殖的重要作用11-13，通过对生物信息学网站TargetScan预测分析，发现NOX4可能会被miR-92a-3p所调控，这表明miR-92a-3p有可能成为NOX4的潜在靶点，但miR-92a-3p在NTD中的作用尚未有报道。本研究探讨miR-92a-3p与NOX4之间的相互作用，以及两者在NTD中对细胞迁移的影响，为研究神经管缺陷的病理机制、早期诊断及治疗提供新的思路。1 材料与方法1.1研究材料1.1.1实验动物与细胞实验动物采用810周龄的C57BL/6J小鼠（北京华阜康生物科技股份有限公司），饲养于中国医科大学附属盛京医院本溪培训基地无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级实验动物房，已通过中国医科大学附属盛京医院实验动物伦理审批（批号：2021PS831K）。实验所用细胞系为小鼠神经干细胞C17.2（北京北纳创联生物技术研究院）。1.1.2主要试剂ATRA（美国Sigma公司）；含L-谷氨酰胺最低必需培养基（minimal essential medium，MEM）（北京中生奥邦生物科技有限公司）；MEM非必需氨基酸（non-essential amino acids，NEAA）（美国Gibco公司）；胎牛血清（浙江硕华生命科学研究股份有限公司）；青霉素-链霉素双抗溶液（北京索莱宝科技有限公司）；NOX4质粒（plasmid）（上海吉凯基因化学技术有限公司）；miR-92a-3p模拟物（mimics）/抑制剂（inhibitor）、模拟物对照（mimics NC）/抑制剂对照（inhibitor NC）（广州锐博生物科技有限公司）。双荧光素酶报告基因检测试剂盒翌圣生物科技（上海）股份有限公司）；JetPRIME Trasfection Reagent（法国PolyPlus-transfection公司）；miRNeasy Mini Kit（美国Oiagen公司）；miRNA第1链cDNA合成试剂盒（上海生工生物工程有限公司）；TB Green Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）；二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒宝生物工程（大连）有限公司；NOX4抗体（11 000，美国ROCKLAMD公司）；-actin抗体（13 000）、山羊抗兔/抗小鼠IgG二抗（15 000）（武汉三鹰生物技术有限公司）。1.1.3主要仪器小型垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司），多功能酶标仪-M200Pro（瑞士TECAN公司），480实时荧光定量PCR仪（美国Thermofisher公司），荧光显微镜（日本Nikon公司），体视显微镜-M165FC（德国Leica公司）。1.2方法1.2.1小鼠NTD模型制备与胚胎样品收集雌鼠和雄鼠以21的比例于前一晚合笼，第2天早上检查雌性小鼠是否存在阴道栓，将有阴道栓的雌鼠单独放1笼，记为0.5 d（E0.5），在E8.5将孕鼠随机分为NTD组与对照组，每组30只，NTD组小鼠通过灌胃给予溶于橄榄油的维A酸（70 mg/kg），对照组小鼠通过灌胃给予相同体积的橄榄油。于E9.5处死小鼠，剖宫取出胚胎，利用体视显微镜观察NTD组胚胎是否出现NTD表型，观察对照组胚胎形态是否正常，进行拍照后，留取小鼠胚胎样品置于-80 保存备用。1.2.2细胞的培养与转染使用含10%血清、1%MEM NEAA以及1%双抗的MEM培养C17.2细胞，然后将其置于5%CO2、37 的孵箱中。将细胞接种至12孔板中，然后在转染前进行24 h的培养。使用JetPRIME作为转染试剂，向C17.2细胞中转染NOX4过表达质粒、miR-92a-3p模拟物/抑制剂、模拟物对照/抑制剂对照。1.2.3实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）用miRNeasy Mini试剂盒从小鼠胚胎样品和C17.2中提取总RNA，用miRNA First Strand cDNA Synthesis反转录RNA。以U6为内参，用TB Green Premix Ex Taq 试剂244发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4盒进行RT-qPCR。引物序列如下：miR-92a-3p F链为TATTGCACTTGTCCCGGCC，R链为GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC；U6 F链为CTCGCTTCGGCAGCACA，R链为AACGCTTCACGAATTTGCGT。1.2.4双荧光素酶报告基因实验通过TargetScan发现miR-92a-3p与NOX4的3UTR区存在潜在的结合位点，构建NOX4 3UTR荧光素酶报告基因质粒，分别与miR-92a-3p模拟物/抑制剂、模拟物对照/抑制剂对照共转染至C17.2细胞，在转染48 h后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒与多功能酶标仪来检测不同组的荧光素酶活性。1.2.5蛋白质印迹法从E9.5小鼠胚胎样品和转染48 h后的C17.2细胞中，用细胞裂解液提取蛋白质。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胚胎和细胞样品中的蛋白，然后电转印至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂牛奶室温下封闭2 h。加入一抗NOX4、-actin，4 摇床孵育1216 h后用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液加吐温室温洗膜3次（10 min/次），然后在室温下与二抗孵育2 h，增强型化学发光试剂发光。1.2.6细胞划痕实验转染24 h后，用1 000 l的无菌枪头进行划痕，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤3次后加入无血清培养基进行培养，并且在伤口形成后的0 h和48 h使用显微镜拍照（40），随机选取3个视野进行统计学分析。1.2.7Transwell实验将12孔板中转染36 h后的细胞饥饿12 h后，用胰酶消化后离心，留下细胞沉淀，用PBS将细胞洗涤离心后，用不含血清的培养基重悬细胞，将细胞以2105个/孔的密度接种于24孔Transwell小室的上室内，在下室中添加300 l含20%血清的培养基，孵箱中培养1224 h后取出小室倒掉剩余培养基后，使用甲醇室温静置固定30 min，将小室适度干燥；在室温下使用结晶紫进行46 h的染色，用棉签在上室内进行轻轻擦拭，除去没有发生迁移的细胞，PBS洗涤3次后在倒置显微镜下（200）观察，随机选取3个视野观察计数。1.3统计学分析用GraphPad 8.0进行统计与分析，计量资料以xs表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1miR-92a-3p与NOX4在小鼠胚胎中的表达在体视显微镜下观察E9.5小鼠胚胎，对照组小鼠胚胎发育正常，神经管闭合完全；NTD组小鼠胚胎神经管形态异常，呈现未闭合状态（图1A）。RT-qPCR结果显示，NTD组小鼠胚胎miR-92a-3p表达低于对照组（表1）。蛋白质印迹法结果显示，NTD组小鼠胚胎NOX4表达高于对照组（表1和图1B）。提示miR-92a-3p与NOX4均可能影响小鼠NTD的形成。表 1miR-92a-3p 与 NOX4 在 E9.5 小鼠胚胎中的相对表达水平（xs）组别胚胎数miR-92a-3p RNANOX4 蛋白NTD组90.7530.0520.8700.039对照组91.0060.1260.6880.056t 值3.2124.621P 值0.0330.010注：NOX4：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4）；NTD：神经管畸形（neural tube defect）。图1E9.5小鼠胚胎形态及NOX4蛋白表达 注：N O X 4：烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 磷 酸 氧 化 酶 4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4）；NTD：神经管畸形（neural tube defect）。A：体视显微镜下小鼠胚胎形态；B：蛋白质印迹法检测NOX4蛋白表达。A B发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.42452.2NOX4是miR-92a-3p的靶基因TargetScan网站预测结果显示，NOX4 3UTR存在3个miR-92a-3p的结合位点。为了确定NOX4是否为miR-92a-3p的靶基因，将NOX4 mRNA的3UTR序列克隆到荧光素酶报告基因载体上，生成NOX4 3UTR荧光素酶报告基因（图2）。在转染NOX4 3UTR荧光素酶报告基因的C17.2细胞中，共转染miR-92a-3p模拟物组的荧光素酶活性低于模拟物对照组；共转染miR-92a-3p抑制剂组的荧光素酶活性高于抑制剂对照组；miR-92a-3p模拟物/抑制剂对共转染pmirGLO空载体的细胞荧光素酶活性均无明显影响，见表2。提示荧光素酶活性的变化是由miR-92a-3p引起的，并且miR-92a-3p与NOX4之间通过3UTR中的结合位点存在相互作用。2.3miR-92a-3p抑制靶基因NOX4的表达为了进一步确定miR-92a-3p对NOX4的调节作用，将miR-92a-3p模拟物/抑制剂转染到C17.2细胞中，检测NOX4的蛋白表达。转染miR-92a-3p模拟物后，miR-92a-3p的表达显著增加，而NOX4的蛋白表达受到了抑制；转染miR-92a-3p抑制剂后，miR-92a-3p表达水平下降，而NOX4的蛋白水平显著升高，图3和见表3。提示miR-92a-3p可通过与NOX4 mRNA结合并阻止其翻译，从而抑制NOX4蛋白的表达。2.4miR-92a-3p/NOX4对细胞迁移的影响进一步探究miR-92a-3p/NOX4对细胞生物学功能的影响。细胞划痕的实验结果表明，转染NOX4质粒后，细胞伤口愈合的速度减慢，然而当过表达NOX4的同时转染miR-92a-3p，细胞伤口愈合速度表 2荧光素酶活性相对表达水平（xs）组别NOX4 3UTRpmirGLO 空载体miR-92a-3p模拟物组0.3680.1020.9640.031模拟物对照组1.0000.1491.0000.035t 值5.5301.348P 值0.0050.249图2miR-92a-3p靶向结合NOX4的mRNA 注：N O X 4：烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 磷 酸 氧 化 酶 4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4）；3 UTR：3 端非翻译区（3 untranslated regions）；CR：翻译区（translated regions）；pmirGLO：双荧光素酶报告基因载体；Luc：荧火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）；hRLuc：海肾荧光素酶基因（renilla luciferase）。A：NOX4 3UTR的潜在miR-92a-3p结合位点示意图；B：NOX4荧光素酶报告质粒示意图。A B图3转染48 h后C17.2细胞中NOX4蛋白表达水平 注：N O X 4：烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 磷 酸 氧 化 酶 4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4）。A：转染miR-92a-3p模拟物和模拟物对照；B：转染miR-92a-3p抑制剂和抑制剂对照。A BmiR-92a-3p 抑制剂组1.2540.0801.0460.001抑制剂对照组1.0000.1291.0000.077t 值2.8991.038P 值0.0440.358表 3转染 miR-92a-3p 模拟物/抑制剂 48 h 后 C17.2 细胞的miR-92a-3p 与 NOX4 相对表达水平（xs）组别miR-92a-3p RNANOX4 蛋白miR-92a-3p模拟物组3 628.000215.4001.0770.142模拟物对照组 1.0010.0651.4320.300t 值29.1702.396P 值0.0010.044miR-92a-3p抑制剂组0.1280.0071.4430.054抑制剂对照组1.0010.0571.2490.090t 值26.3003.709P 值0.0010.010246发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4加快（表4、图4A）。进一步的Transwell实验发现，转染NOX4质粒后，迁移的细胞数量减少，而共转染NOX4与miR-92a-3p后，发生迁移的细胞明显增多（表4、图4B）。提示miR-92a-3p能够通过抑制NOX4表达促进细胞迁移。3讨论NTD是一种严重的中枢神经系统先天畸形，以脊柱裂、无脑畸形和脑膨出为代表14-15。作为环境与遗传因素共同影响的复杂疾病，NTD的发病机制仍未得到充分了解。多年来人们对于NTD发病机制的研究多集中在细胞凋亡和增殖上，NTD中细胞迁移功能变化的相关报道比较少。本研究首次发现miR-92a-3p在ATRA诱导的小鼠NTD模型中的表达异常下调，并抑制小鼠胚胎神经管闭合过程中细胞的迁移活动。在小鼠神经干细胞中，miR-92a-3p能够通过靶向结合NOX4 3UTR抑制NOX4表达，从而调控细胞迁移。细胞迁移是胚胎发育过程中必不可少的生物学过程，从最开始原肠胚的形成到后来各大器官的发育都涉及细胞迁移16。在神经系统发育阶段，神经细胞需要经过一段距离的迁移才能到达特定的部位发挥相应的功能，例如神经嵴细胞需要从神经上皮和外胚层迁移到神经褶皱内，参与神经管闭合过程17。有实验证明，E-Cadherin上调会阻碍上皮间质转化过程以及细胞迁移，从而影响了神经管的闭合，导致发育畸形18。此外，本课题组前期已证实在ARTA构建的小鼠NTD模型中，细胞迁移活动减少3。miRNA是一类内源性的非编码单链小RNA分子，具有负调控靶基因表达的功能，并且miRNA具有作为疾病产前诊断标志物的可能19-20。近年来，已有报道多种miRNA与NTD的形成有关，但所涉及的生物学过程多集中在细胞凋亡、自噬与增殖方面11,21-22，关于miRNA在NTD中调控细胞迁移过程的研究相对较少。有文献资料表明，miR-92a-3p在多种肿瘤中参与细胞迁移活动的调控。例如miR-92a-3p能够通过调控磷酸酯酶与张力蛋白同源物促进食管鳞状细胞癌细胞迁移23；在肝内胆管癌中，肾母细胞瘤过表达基因（nephrbl astoma overexpressed gene，NOV）通过调控miR-92a-3p促进细胞迁移24；miR-92a-3p通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶点（phosphatidyl inositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）加速肝癌细胞的迁移25。但miR-92a-3p是否参与小鼠神经管闭合过程中的细胞迁移过程尚未有报道。本研究发现了在NTD中异常低表达的miR-92a-3p能够抑制神经细胞的迁移，因而在胚图4miR-92a-3p/NOX4对细胞迁移的影响 注：对照组：共转染NOX4对照质粒和模拟物对照；NOX4组：转染烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）过表达质粒；NOX4+miR-92a-3p组：共转染NOX4过表达质粒和miR-92a-3p模拟物。A：细胞划痕实验；B：Transwell实验。表 4细胞划痕和 Transwell 实验结果（xs）组别细胞伤口愈合速度（%）迁移细胞数量（个）对照组a44.16.8 133.011.8NOX4 组b 8.86.5d102.74.5eNOX4+miR-92a-3p 组c 37.211.7 176.011.0F值14.07043.590P 值 0.0050.001注：a对照组：共转染 NOX4 对照质粒和模拟物对照；b NOX4组：转染烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）过 表 达 质 粒；c NOX4+miR-92a-3p 组：共转染 NOX4 过表达质粒和 miR-92a-3p 模拟物。d与对照组（t=6.513，P=0.003）、NOX4+miR-92a-3p 组（t=3.680，P=0.021）比较，差异均有统计学意义；e与对照组（t=4.162，P=0.014）、NOX4+miR-92a-3p 组比较（t=10.680，P0.001），差异均有统计学意义。A B发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4247胎发育早期阻碍了神经管的正常闭合。NOX4是NOX家族的重要成员，其主要作用是在细胞中产生ROS26。NOX4在调节多种细胞生物学过程中发挥重要作用，尤其是在凋亡和迁移方面。在缺氧条件下，抑制NOX4的表达能够促进细胞迁移27。高脂血症患者的内皮祖细胞中NOX4表达上调并伴随着细胞迁移功能障碍28。Toll样受体5通过激活NOX4促进平滑肌细胞迁移，导致新内膜动脉粥样硬化斑块的形成29。本课题组前期已经证明NOX4在NTD中对细胞凋亡的影响，但NOX4是否参与神经管闭合过程中的细胞迁移活动仍未有研究。虽然有许多研究表明NOX4促进细胞迁移29，但也有一些研究表明NOX4抑制细胞迁移27。由此可见，NOX4具有双重功能，在细胞中执行功能取决于细胞类型、细胞环境以及生理状态。本研究观察到了NOX4对神经干细胞迁移的抑制作用，进一步证实了NOX4为miR-92a-3p的直接靶标，miR-92a-3p通过抑制NOX4的表达，促进神经管发育过程中的细胞迁移活动，因此参与NTD的形成。然而NOX4通过何种途径、何种效应分子抑制神经管闭合过程中的细胞迁移活动尚不清楚。有研究证明，ROS能够作为NOX4的效应分子影响细胞迁移活动30。作为多种细胞中ROS主要来源的NOX4是否通过ROS参与神经管闭合过程中细胞迁移活动还需进一步研究。综上所述，小鼠NTD模型中，异常低表达的miR-92a-3p能够通过上调NOX4的表达，阻碍小鼠胚胎神经管闭合过程中的细胞迁移活动，最终导致NTD的发生，这为阐明细胞迁移在NTD中的机制提供了新的见解，其有望成为治疗NTD的新靶点。参考文献1 FORCI K,BOUAITI E A,ALAMI M H,et al.Incidence of neural tube defects and their risk factors within a cohort of Moroccan newborn infants J.BMC Pediatr,2021,21(1):124.2 袁正伟.神经管畸形发病机制研究进展与新策略 J.发育医学电子杂志,2020,8(3):205-207,183.3 黄天楚,黄琬淇,顾卉,等.COLIA1 调控小鼠神经细胞迁移在神经管畸形中的作用 J.中国医科大学学报,2021,50(11):966-969.4 VISHNOI A,RANI S.MiRNA Biogenesis and regulation of diseases:an overview J.Methods Mol Biol,2017,1509:1-10.5 HU J L,WANG W,LAN X L,et al.CAFs secreted exosomes promote metastasis and chemotherapy resistance by enhancing cell stemness and epithelial-mesenchymal transition in colorectal cancer J.Mol Cancer,2019,18(1):91.6 PARK M W,CHA H W,KIM J,et al.NOX4 promotes ferroptosis of astrocytes by oxidative stress-induced lipid peroxidation via the impairment of mitochondrial metabolism in Alzheimers diseasesJ.Redox Biol,2021,41:101947.7 BAE Y S,OH H,RHEE S G,et al.Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling J.Mol Cells,2011,32(6):491-509.8 LASSEGUE B,SAN MARTIN A,GRIENDLING K K.Biochemistry,physiology,and pathophysiology of NADPH oxidases in the cardiovascular system J.Circ Re