白杨素通过下调Annexin A3逆转人肺腺癌A549_DDP细胞顺铂的耐药性.pdf

基础研究白杨素通过下调 逆转人肺腺癌 细胞顺铂的耐药性刘晖杰，彭荣，许华（湖北文理学院附属襄阳市中心医院 肿瘤科，湖北 襄阳 ；宜城市人民医院 肿瘤科，湖北 襄阳 ；湖北文理学院附属襄阳市中心医院 审计处，湖北 襄阳 ）摘要目的观察白杨素对肺腺癌顺铂（）耐药性细胞 耐药敏感性的影响。方法取 和 细胞，及 法检测膜联蛋白 （）基因及蛋白表达，法测不同浓度白杨素（、）干预后细胞生存率；将 细胞分为 组、白杨素组（）、过表达组（组）、阴性对照组（）、白杨素 组，另取 细胞正常培养作为空白对照组；法检测细胞对 的半数生存浓度（）及耐药指数；和 法检测 基因和蛋白表达水平，流式细胞义监测细胞凋亡率，小鼠荷瘤实验检测移植瘤体积。结果不同浓度的白杨素均能时效依赖性和剂量依赖性降低 、细胞生存率（），选取 为实验浓度作用细胞 ；与 细胞比较，细胞 及蛋白表达、对 的 、耐药指数均升高，凋亡率降低（）；与 组比较，白杨素组细胞 、耐药指数、及蛋白表达降低，细胞凋亡率升高（），组细胞 、耐药指数、及蛋白表达升高，细胞凋亡率降低（）；基因高表达可减弱 细胞对白杨素的敏感性，降低细胞凋亡率（）；小鼠荷瘤实验证实，与单独的 治疗组比较，白杨素与 联合治疗可显著降低小鼠 移植瘤瘤体体积（），基因高表达的小鼠逆转白杨素与 联合治疗效果（）。结论白杨素可能通过下调 表达，逆转 细胞对 的耐药性。关键词肺腺肿瘤；白杨素；膜联蛋白 ；顺铂耐药；细胞 中图分类号 文献标识码 文章编号 （）：，（，；，；，）（）（）；（，），（），（），第 卷第 期 年 月贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目 湖北省自然科学基金（）引用本文：刘晖杰，彭荣，许华 白杨素通过下调 逆转人肺腺癌 细胞顺铂的耐药性 贵州医科大学学报，（）：（），（）；（），（），（），（），（），（）；肺癌发病率和死亡率在所有癌症中居首位，肺腺癌是肺癌的一种，属于非小细胞癌类型，多发生于女性 。大多数肺腺癌患者在无法进行手术治疗的情况下，均以顺铂药物（）进行化疗治疗 ，但患者在长期使用 时，会产生耐药性，使得治疗效果显著降低 ，因此，改善和扭转癌细胞对 的耐药性，是目前临床研究的重点。膜联蛋白 （）与肿瘤的发生、浸润、转移、血管形成及耐药性等功能有密切关系 ，且已发现其在肺腺癌、卵巢癌、胃癌等多种肿瘤细胞中呈较高表达 。近来研究发现，有学者已将 作为卵巢癌铂类耐药的标记蛋白 ，但 是否也与肺腺癌铂类耐药性有关，目前仍未见报道。白杨素是一种天然黄酮类药物，具有抗肿瘤、抗炎等作用，其衍生物可抑制人肺腺癌 细胞生长 ，但其对肺腺癌细胞 耐药性的作用并不清楚。因此本研究通过观察白杨素对肺腺癌 耐药性细胞 对 敏感性的影响，并初步探讨其机制，以期为临床治疗 耐药型肺癌提供参考。材料与方法 细胞来源及主要试剂人肺腺癌细胞 （）及人肺腺癌 耐药细胞株 （）购自上海君润生物，只 小鼠购自西安迪乐普生物医学有限公司 许可证号 （陕），白杨素（）购自上海酶研生物科技有限公司，胎牛血清、胰酶、培养基购自上海语纯生物科技有限公司，、反转录病毒试剂盒购自南京锐真生物技术有限公司，试剂盒（）、反转录试剂盒（）、蛋白提取试剂盒（）、试剂盒（）购自赛默飞世尔中国公司，反转录试剂盒、检测试剂盒、引物序列购自日本 公司，兔抗人 抗体购自美国 公司，兔抗 美国 ，标记的羊抗兔 购自中国中杉金桥公司，化学发光剂试剂盒（）购自上海期刘晖杰等白杨素通过下调 逆转人肺腺癌 细胞顺铂的耐药性碧云天生物技术有限公司。研究方法 细胞培养及分组将 细胞、细胞快速解冻，并离心收集细胞，用含 胎牛血清的完全培养基悬浮细胞并接种于细胞皿中，置恒温培箱中进行常规传代培养并计数。取对数期 细胞、细胞，以每孔 密度种植于 孔板中适应性培养 后，用 及 法测膜联蛋白 （）基因及蛋白表达。收集对数期 细胞、细胞，以每孔 密度种植于六孔板中，在培养基中分别加入终浓度为 、及 的白杨素干预培养 、，用 法检测 细胞、细胞存活情况，筛选出毒性较低（细胞活性 ）的白杨素浓度，作为实验时浓度。取 细胞，以每孔 密度种植于 孔板中，设置为 组、白杨素组（）、过 表 达 组（组）、阴性对照组（）及白杨素 组；另取 细胞作为 组，每组设置 个复孔。组选用 细胞进行干预培养，白杨素组加入终浓度为 白杨素，组及 组按转染试剂盒说明书方法转染 及 试剂，白杨素 组转染 的同时、加入终浓度为 的白杨素进行干预培养。检测收集各组细胞，加入胰蛋白酶消化，按照 试剂盒说明书步骤对细胞进行处理，用酶标仪检测 波长下吸光值，细胞生存率（）（药物处理组吸光值 空白组吸光值）。细胞半数生存浓度（）及耐药指数检测上述细胞加入终浓度为（、）继续干预培养 ，按 法测细胞在 波长下的吸光值，绘制生存曲线，取细胞生存率为 时的浓度为 ，根据公式，耐药指数 给药组 空白组 ，计算各组细胞的耐药指数。荧光实时定量 （）取细胞，弃去培养基，离心后收集细胞，用 试剂盒抽提细胞总 ，反转录合成 ，反应体系为 （，逆转录酶，样品），置于 、，下 灭活逆转录酶活性；将 稀释 倍按照实时荧光定量 试剂盒对 进行扩增。反应体系为 ，正向引物、反向引物各 ，去离子水 。反应条件：，预热 ，上述 步骤 次循环，终止反应。以 为内参基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用 算法计算 相对表达量，实验重 复 次。正 向 引 物 ，反向引物 ；正 向 引 物 ，反向引 物 。蛋白质免疫印迹取各组细胞，弃去培养基，加入 裂解液裂解后提取总蛋白，用 试剂盒测定总蛋白浓度后，转移至 膜上，加入适宜浓度的兔抗人一抗 （），孵育 、洗涤后加入 标记的二抗（羊抗兔 ），室温孵育，洗涤，以 为内参，通过 显影，凝胶成像系统照相并分析灰度值。试验重复 次。流式细胞仪监测细胞凋亡取培养 后的各组细胞，加入终浓度为 培养 后，参照文献 收集细胞，重悬制成单细胞悬液，加入 异硫氰酸荧光素和碘化丙啶试剂各 染色，用流式细胞仪检测细胞凋亡。小鼠荷瘤实验验证白杨素对细胞耐药性的影响取（）的 小鼠 只，分为 组、组、白杨素组（）、过表达组（组）、阴性对照组（）及白杨素 组，每组 只，组小鼠经皮下注射 只（个 ）的 细胞；后，给予 腹腔注射 ，次 ；组小鼠除注射细胞为 细胞外，其余同 组；白杨素组小鼠皮下注射等量 细胞后 ，给予 腹腔注射的同时注射白杨素（，只）进行干预治疗；组及 组小鼠分别皮下注射转染 及 的 细胞（只，个 ）后 ，给予相同剂量的 进行干预贵 州 医 科 大 学 学 报 卷治疗；白杨素 组小鼠在 组基础上给予白杨素（，只）进行干预治疗。各组干预治疗 后测量并计算瘤体体积。统计学分析实验数据采用 软件进行分析，计量资料符合正态分布的数据均以均数 标准差（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（两组间比较采用 检验），计数资料用 表示，采用 检验，表示差异有统计学意义。结果 白杨素对 、细胞毒性的影响随着白杨素浓度的上升，、细胞生存率逐渐降低、且白杨素 、组呈时效依赖性和剂量依赖性；用 白杨素处理 时，、细胞生存率分别为 、，接近 ，因此将 作为白杨素毒性适宜浓度，作为最佳处理时间用于下游试验。见图 。图 白杨素对 、的 细胞毒性 、基因及蛋白表达和 的 与 细胞组比较，细胞组 基因及蛋白表达、对 的 升高，差异有统计学意义（）。见图 。注：（）与 细胞组比较，。图 两种细胞对 的 、基因及蛋白表达 、细胞耐药性对 的影响与 组比较，组细胞 及耐药指数升高（）；与 组比较，白杨素组 及耐药指数降低（）；组细胞 及耐药指数进一步升高（）；与白杨素组比较，白杨素 组细胞 及耐药指数升高（）。见表 。表 各组细胞的 及耐药指数（）（）组别 （）耐药指数 组 组 （）（）白杨素组（）（）（）组 （）（）（）（）白杨素 组 （）（）组 （）（）注：（）与 组比较，；（）与 组比较，；（）与白杨素组比较，。期刘晖杰等白杨素通过下调 逆转人肺腺癌 细胞顺铂的耐药性 及蛋白表达与 组比较，组细胞 及蛋白表达升高（）；与 组比较，白杨素组细胞 及蛋白表达降低（）；细胞 及蛋白表达进一步升高（）；与白杨素组比较，白杨素 组细胞 及蛋白表达升高（）。见图 。注：（）与 组比较，；（）与 组比较，；（）与白杨素组比较，。图 各组细胞 及蛋白表达 细胞凋亡率与 组比较，组细胞凋亡率降低（）；与 组比较，白杨素组细胞细胞凋亡率升高（）；组细胞凋亡率进一步降低（）；与白杨素组比较，白杨素 组细胞细胞凋亡率降低（）。见图 、表 。图 各组细胞凋亡检测 贵 州 医 科 大 学 学 报 卷表 各组细胞凋亡率比较（）（）分组凋亡率 组 组 （）白杨素组（）（）组 （）（）白杨素 组 （）组 （）注：（）与 组比较，；（）与 组比较，；（）与白杨素组比较，。荷瘤小鼠瘤体体积 干预治疗后，与 组比较，组小鼠瘤体体积增大（）；与 组比较，白杨素组小鼠瘤体体积减少（）；组小鼠瘤体体积增大（）；与白杨素组比较，白杨素 组小鼠瘤体体积增大（）。表 各组荷瘤小鼠瘤体体积 分组瘤体体积 组 组 （）白杨素组（）（）组 （）（）白杨素 组 （）组 （）注：（）与 组比较，；（）与 组比较，；（）与白杨素组比较，。讨论肺腺癌是非小细胞型肺癌中发病率和死亡率最高的一类恶性肿瘤性疾病，目前，化疗仍是治疗肺腺癌的主要手段，然而 耐药问题越来越明显，逐渐成为导致肺腺癌治疗失败的主要原因，大部分肺腺癌患者死亡与肿瘤细胞耐药有着重要关系，因此如何解决肿瘤细胞对 药物的耐药性，提高化疗药物的疗效，是国内外研究的热点和难点问题 。白杨素为蜂胶中主要成分，也是一种天然的植物黄酮类化合物，具有抗肿瘤抑制芳香酶活性、抗炎、抗氧化等多种药理作用 ，其能够抑制肺癌、肝癌、乳腺癌等多种癌细胞的增殖而受到国内外研究的重视 。近来研究报道白杨素可增强卵巢癌细胞对放射治疗的感性 ，基于其抗肿瘤及放射增敏作用，本研究认为用白杨素改善肺腺癌细胞对 的耐药性，可能是解决肺腺癌铂类耐药问题的潜在药物。细胞是一种 耐药细胞，本研究发现，白杨素不同浓度可呈剂量依赖性和时效性抑制 、细胞的增殖能力，且用 浓度的白杨素处理 细胞后，细胞对 的 由 左右降至为 ，耐药指数由 左右降至 左右，提示白杨素可显著降低 细胞对 的耐药性。是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白 ，研究发现，其不仅可调控细胞增殖、凋亡而参与多种癌细胞的恶性生物学过程 ，还可通过凋亡途径调控癌细胞对 的敏感性 。孙佳等 发现 基因可在结肠癌细胞中有较高表达，而下调 基因表达后可抑制结肠癌的增殖、迁移过程，证实了 与肿瘤恶性生物学关系密切。等 发现下调大肠癌耐药细胞株中 表达可显著降低耐药细胞株的存活，本研究发现 细胞耐药性高于 细胞的同时，其 基因及蛋白表达也明显高于 细胞。用白杨素干预处理后，细胞对 的 及耐药指数降低的同时，基因及蛋白表达也显著降低，提示白杨素降低 细胞对 耐药性作用，可能与下调 基因及蛋白表达有关。为了进一步探究白杨素降低 细胞对 耐药性作用，本研究上调 中 基因表达后，发现 细胞对 的耐药性及耐药指数进一步升高，白杨素促进 凋亡、降低 细胞对 的耐药性作用也明显被削弱，提示 基因高表达，可能是 细胞耐药性升高的关键机制。基因过表达可逆转白杨素的降低 细胞对 的耐药性作用。另外小鼠体内试验，也证实一定浓度的 治疗后，再进行白杨素干预治疗，小鼠瘤体体积增长明显低于单独用 治疗组，转染 基因高表达的 细胞，再经白杨素及 治疗，其瘤体体积增长仍然加快，进一步证实，白杨素降低 细胞对 的耐药性作用，可能与抑制 表达有关。期刘晖杰等白杨素通过下调 逆转人肺腺癌 细胞顺铂的耐药性综上所述，白杨素可能通过下调 的表达，降低 细胞对 的耐药性，为治疗 耐药型肺癌提供方向。然而 细胞耐药性升高的作用，也可能与机体免疫逃逸的发生有关，白杨素也可能通过调节免疫来降低 细胞对 耐药性，这有待后续进一步探究。参考文献 ，（）：宋捷，邱峰，刘宇，等顺铂联合吉西他滨支气管动脉灌注治疗非小细胞肺癌的 分析 中国医院药学杂志，（）：，（）：，：，：袁梦，韩波，马洁韬，等不可手术局部晚期非小细胞肺癌放化疗安全性及疗效分析 中国医科大学学报，（）：，（）：刘道真，郑敏云 与锌指蛋白 在卵巢癌组织表达与铂类药物耐药的关系 江西医药，（）：，（）：孔令米，刘会，李俊雅，等中国蜂胶及其主要组分对两种肺癌细胞作用及机制研究 中国蜂业，（）：陈建军，刘世喜，李启军，等 阿糖胞苷与顺铂联用对耐药鼻咽癌细胞的生长抑制作用增强且细胞凋亡增加 细胞与分子免疫学杂志，（）：，（）：王京，王杨，杨杰，等 白杨素的结构修饰及其衍生物的生物活性研究进展 化学试剂，（）：，：熊康萍，刘宏，季可非，等 乏氧对黄酮类化合物放射增敏作用的实验性研究 中国药师，（）：，（）：，（）：，（）：孙佳，肖海娟，闫克敏，等下调 基因对结肠癌 细胞生物学特性影响 中华肿瘤防治杂志，（）：，（）：（收稿，修回）中文编辑刘平英文编辑冉海勇贵 州 医 科 大 学 学 报 卷