不同比例TNBS诱导Balb_c小鼠克罗恩病模型的建立及评价.pdf

药理不同比例 诱导/小鼠克罗恩病模型的建立及评价陈泽鸿余深翼陈小鹰曾晓萍(福建医科大学基础医学院福建福州 福建省妇幼保健院福建医科大学妇儿临床医学院药剂科福建福州)摘要:目的 不同三硝基苯磺酸()比例诱导/小鼠克罗恩病()模型的建立及评价方法 以完全随机区组化的方法将 只/小鼠分为 组按水无水乙醇 比值分为模型 组()、模型 组()及模型 组()每组 只 另 只健康小鼠作为对照组以小鼠一般情况、体质量变化、结肠长度变化、粪便性状、结肠组织病理学评分等为指标评价不同比例 诱导的小鼠 模型进展并计算小鼠生存率 于建模后第 天取材进行结肠组织病理学检查及组织病理评分取小鼠血清检测炎性细胞因子 水平同时测量小鼠结肠长度结果 模型 组小鼠生存率低整个实验周期体质量持续下降建模第 天即出现严重腹泻、便血等症状 天后结肠长度显著缩短()组织损伤严重组织病理学评分及 水平均显著升高()模型 组小鼠第 天情况与模型 组相似体质量在第、天显著下降()后有所回升第 天镜下检查结肠组织损伤及炎症情况轻结肠长度并无显著缩短模型 组小鼠体质量、结肠长度及 水平变化情况与模型 组相似炎性细胞浸润及结肠局部损伤有大量炎性细胞浸润结论 模型 组(体积比)小鼠生存率高炎症轻重程度适中病理变化情况稳定是一种 研究较好的模型制备方法关键词:/小鼠克罗恩病三硝基苯磺酸中图分类号:文献标识码:文章编号:()作者简介:陈泽鸿男()学历:硕士 职称:助理实验员 研究方向:药理学通讯作者:曾晓萍女()学历:硕士 职称:药师 研究方向:药学基金项目:福建省教育厅中青年科研基金(项目编号:)福建省妇幼保健院科研计划基金资助项目(项目编号:妇幼)/():()/()/()()()()()()():/克罗恩病()是一种病因未明的慢性胃肠道炎症性疾病可能由个体遗传易感性、自身免疫、肠道菌群与环境因素之间复杂的相互作用引起 的特点是反复肠道病变包括反复腹痛、腹泻、乳糜泻、肠梗阻和肛周病变并伴有肠道炎症性损伤 自 年以来全球范围内的 病人日渐增多西方国家约每 人中就有 人为研究 发病机制理想的动物模型不可或缺 三硝基苯磺酸()诱导的肠炎动物模型能够较好的模拟 发病机制是研究 理想的动物模型之一 是一种经典的表皮致敏剂当应用于表皮时可使机体蛋白质与其三硝基苯()基团结合形成半抗原化合物 当 经直肠内灌注给敏感小鼠时半抗原化合物可诱导 细胞介导结肠黏膜的免疫反应在这种情况下导致以密集浸润为特征的大量黏膜炎症聚集从而导致炎症性肠炎的产生虽然 是优秀的肠炎模型诱导剂但不同 比例建立的动物模型动物状态、疾病严重程度、动物存活率等各不相同 鉴此本文以/小鼠为对象观察不同比例 诱导对小鼠结肠的影响以期为 提供稳定死亡率低的 模型制备方法 材料与方法 实验动物 级/小鼠 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司许可证号:(沪)实验前于福建医科大学实验动物中心屏障内适应性饲养 实验动物中心使用许可证号:(闽)光暗周期/(光照时间 )下恒温()、恒湿()环境下饲养自由饮水饮食 所有针对小鼠的操作均遵守国际和本地实验动物使用和保护委员会颁布的条例并通过本校伦理审查编号():实验药品及试剂 溶液购自美国 公司分析级无水乙醇购自美国 公司 试剂盒购自南京建成生物科技有限公司小鼠 试剂盒购自北京达科为生物技术公司 实验仪器 切片机 脱水机 包埋机高速低温离心机为美国 公司产品倒置显微镜为日本 公司产品酶标仪为美国伯腾仪器有限公司产品 建立 诱导的/小鼠 模型 制备不同比例 溶液:取 支 离心管使用移液枪按比例于离心管中加入超纯水、无水乙醇、溶液(比例分别为模型 组、模型 组、模型 组)而后将离心管涡旋即可得到混合后的 溶液 建立不同比例 诱导的/小鼠 模型:造模前禁食 (不禁水)麻醉后轻按小鼠后臀部或用棉签刺激小鼠肛门去除直肠内残余粪便然后将用石蜡油润滑后的自制塞肛器导管轻轻由小鼠的肛门送入结肠中若发现肠道阻滞感时应将导管取出重新润滑后送入不可强行插入造成肠道器质性损伤 导管成功插入后缓慢注射 的 混合液 灌肠完成后将小鼠倒置抓持保持垂直体位 以防止 混合液漏出 对照组以相同方法注射等体积超纯水 模型评价 一般情况评价:建模第 天开始即观察记录小鼠一般情况:食欲、毛色、活跃度、粪便性状等变化 统计小鼠死亡数量计算小鼠生存率小鼠生存率 (存活小鼠数量/小鼠总数)小鼠体质量及结肠长度变化情况:于建模前及建模后每日测定小鼠体质量实验结束后处死或于小鼠死亡时取小鼠结肠测量长度 苏木素伊红()染色:造模后第 天处死小鼠或于小鼠死亡时取小鼠结肠组织剪取距肛门 处结肠组织放入标记好的包埋盒投入 多聚甲醛固定 酒精脱水后常规石蜡包埋 连续切片以 染色的方法观察小鼠的结肠组织形态学变化 主要步骤包括:将取下的结肠组织泡入 多聚甲醛固定 固定好的结肠组织用 酒精脱水处理脱水后进行修块与石蜡包埋用切片机进行切片厚度为 将切好的的片卷放入 漂片仪进行展片待切片展平后进行裱片并将切片于 温箱中放置 用二甲苯和酒精进行脱水脱蜡而后 染色封片 小鼠结肠组织病理学评分:参照 等标准对小鼠结肠组织进行组织病理学评分具体标准见表 小鼠血清细胞因子 水平检测:在造模后第 天处死小鼠并收集小鼠血清采用酶联免疫吸附法()以小鼠 试剂盒根据其说明书方法检测小鼠 水平具体步骤如下:加入 标准品于空白孔中标记样品编号加入 样品于空白孔中置于 孵育 弃去孔中的液体用洗涤液()清洗 次每次静置 每孔加入 稀释好的 置于 孵育 弃去孔中的液体用洗涤液()清洗 次每次静置 每孔加入 显色剂()置于室温下孵育 每孔加入 海峡药学 年 第 卷 第 期 的终止液()于波长 的酶标仪上读取各孔的 值绘制标准曲线并根据标准曲线算出样品浓度表 组织病理学指数内容项目得分慢性炎性细胞浸润 不增加 轻微但明确的增加 中等增加 明显增加固有层中性粒细胞浸润 无 轻微但明确的增加 中等增加 明显增加上皮层中性粒细胞浸润 无隐窝涉及 隐窝涉及隐窝涉及糜烂或溃疡 没有糜烂溃疡或肉芽组织 正在恢复上皮 邻近的炎症 可能的糜烂局部剥离 明确的糜烂 溃疡或肉芽组织 统计学处理所有数据以均数 标准误()表示对各实验组不同时间点的体质量用重复测量数据的方差分析()进行比较组间两两比较用 检验组织病理学评分组间均数比较采用 秩和检验组内两两比较采用 多重比较检验结肠长度、脾脏指数、小鼠生存率、水平采用单因数方差分析()组间两两比较采用 检验 所有数据均应用 进行统计处理 认为有统计学显著差异 结果 小鼠一般情况整个实验周期空白组小鼠食欲正常毛色顺滑有光泽行动自如活泼有精神反应灵敏粪便为褐色椭圆形颗粒无稀便模型 组、组、组小鼠在造模 后即出现食量减少、活动欲望降低、毛发光泽下降、排便减少且稀便水样便量增多第、天模型 组小鼠有所缓解 组小鼠未见变化 组部分小鼠身体颤抖不止第、天 组部分小鼠活动欲望增加反应灵敏粪便性状恢复正常部分小鼠出现自愈现象 组、组部分小鼠毛发竖直、变脆肛门口出现褐色稀便环上述症状有进行性加重趋势 各组小鼠生存率分别为、(见表)表 各组小鼠生存率()组别小鼠只数小鼠死亡数小鼠存活率()空白组模型 组 模型 组 模型 组 小鼠体质量变化于实验前测定小鼠体质量基础值并于整个实验周期每日测量小鼠体质量以观察模型小鼠体质量变化 结果见图 整个实验周期中空白组小鼠体质量相较基础值有所上升模型 组、组、组小鼠于建模第、天体质量下降最为明显(或 )建模第 天至第 天模型 组小鼠体重逐渐回升模型 组、组小鼠体质量仍进行性下降()图 各组小鼠体质量变化()注:与空白组比较 小鼠结肠长度变化情况于建模第 天处死小鼠或于小鼠死亡时取小鼠结肠测量其长度结果见图 与空白组相比模型、组小鼠结肠长度显著缩短()模型 组结肠长度与空白组对比未见显著性差异图 各组小鼠结肠长度变化情况()注:与空白组比较 小鼠结肠组织病理学检查及评分情况于建模第 天处死小鼠或于小鼠死亡时取小鼠距肛门 处结肠组织进行组织病理学检查 结果显示空白组小鼠可见完整结肠结构隐窝、杯状细胞完好无溃疡及炎性细胞浸润模型 组小鼠结肠结构较为完整偶见杯状细胞、绒毛缺损炎性细胞浸润情况轻模型 组小鼠结肠内侧结构部分缺失隐窝结构破坏局部炎性细胞浸润肠壁绒毛部分缺失模型 组结肠结构严重破坏杯状细胞大面积缺损肠黏膜层厚度减少大量炎性细胞浸润(见图)组织病理学评分结果显示(见图)模型 组小鼠组织病理学评分均显著高于空白组(或 )图 各组小鼠结肠组织病理变化情况 小鼠血清炎性细胞因子 的变化情况于建模 天后处死小鼠摘眼球取血并分离血清检测小鼠血清炎性细胞因子 水平的变化情况结果见图 模型 组、模型 组、模型 组 水平均显著高于空白组(或 )图 各组小鼠组织病理学评分()注:与 空 白 组 比 较 图 各组小鼠血清 水平变化情况()注:与 空 白 组 比 较 讨论 是一种慢性自身免疫性炎症肠病以跳跃性病变和跨壁炎症为特征可影响从口腔到肛门的整个胃肠道 发病机制尚不明确原因不明的自身性免疫反应贯穿其整个病程患者反复腹泻、腹痛并且伴有严重的肠道损伤目前对于 的研究主要是在动物模型上进行的常用的动物有/小鼠、/小鼠、大鼠等 是一种半抗原性物质能够与结肠上皮产生的氨基酸结合形成免疫复合物使机体产生自身免疫能够较好模拟 炎症反应、临床症状及肠道损伤等特点是复制 病程较好的模型之一但不同浓度 对于模型动物的疾病进程、疾病严重程度不同过轻过重的疾病程度对于研究 都是不利的本研究中模型 组小鼠在建模第 天即出现肠黏膜溃疡、腹泻等症状并且进行性加重同时伴有大量炎性细胞浸润结肠长度缩短肠道杯状细胞减少与 病情相似以该比例建的结肠炎模型小鼠死亡率低模型稳定炎症严重程度适中小鼠之间个体差异较小实验过程中并未发现自愈现象模型 组小鼠第 天病变情况与模型、组相似但第 天炎症情况明显减轻且无明显溃疡表征部分小鼠出现自愈现象总体只表现为轻度炎症模型 组小鼠在造模第 天即表现为较为严重的炎症状态结肠组织损伤严重无完整结肠结构且死亡率较高综上笔者认为模型 组 浓度配比(即水 无水乙醇 比为)相对于模型 组和模型 组病理特征稳定炎症持续时间较长更适合模拟人 模型的建立参考文献 ():():():():()():():():():():():():海峡药学 年 第 卷 第 期 :():()():虎杖多糖对链脲佐菌素诱导糖尿病模型的降血糖作用研究马宁珠周先泰张建国齐 娜(桂林医学院药学院广西桂林 南方医科大学中西医结合医院广东广州)摘要:目的 研究虎杖多糖对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型的降血糖作用方法 采用水提醇沉法和乙醇提取两种方法提取并测定虎杖多糖的提取率制备链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型并给以虎杖多糖观察对大鼠饮水量、排尿量、体重变化、空腹血糖、糖耐量的影响分析链脲佐菌素诱导糖尿病模型动物一般情况、空腹血糖、口服糖耐量的变化结果 乙醇提取法较水提醇沉法可显著提高虎杖多糖提取率链脲佐菌素诱导的糖尿病模型组大鼠出现多饮、多食、多尿及体重减轻的现象与模型组相比虎杖多糖组大鼠饮水量、体重、排尿量有所改善口服糖耐量及空腹血糖明显降低()结论 虎杖多糖能够改善糖尿病大鼠“三多一少”的症状显著降低糖耐量和空腹血糖在糖尿病药物及保健食品的研究及开发中具有潜在的经济价值关键词:虎杖多糖糖尿病提取工艺糖耐量中图分类号:文献标识码:文章编号:()作者简介:马宁珠女()学历:硕士研究生 研究方向:主要从事药物递送系统及药食同源的功能性食品研究共同第一作者:周先泰男()学历:硕士研究生 研究方向:主要从事药物递送系统及药食同源的功能性食品研究通讯作者:齐 娜女()学历:博士 职称:副教授 研究方向:主要从事药物递送系统及药食同源的功能性食品研究基金项目:广西科学研究与技术开发计划项目(桂科能)广西高等学校千名中青年骨干教师培育计划(桂教办 号)():()“”: