侧流免疫层析技术在黄曲霉毒素B1检测中的研究进展.pdf

收稿日期:2 0 2 2-0 8-0 9 修回日期:2 0 2 2-1 0-2 0基金项目:国家自然科学基金(2 2 1 7 4 1 3 0)*通讯作者:汪晶,男,博士,副教授,研究方向为床边即时诊断(P O C T)等.E-m a i l:j i n g w 1 9 8 6 z j u t.e d u.c n第3 9卷第3期V o l.3 9 N o.3分 析 科 学 学 报J OUR NA LO FANA L Y T I C A LS C I E N C E2 0 2 3年6月J u n e 2 0 2 3D O I:1 0.1 3 5 2 6/j.i s s n.1 0 0 6-6 1 4 4.2 0 2 3.0 3.0 1 8侧流免疫层析技术在黄曲霉毒素B1检测中的研究进展童 璐,李大权,汪 晶*(浙江工业大学化学工程学院,浙江杭州3 1 0 0 1 4)摘 要:侧流免疫层析技术(l a t e r a l f l o wi mm u n o a s s a y,L F I A),是一种将色谱层析和免疫技术相结合的快速分析方法,为黄曲霉毒素B1(A F B1)的现场快速检测提供了一个良好平台。本文从比色和荧光两种方法介绍了侧流免疫层析技术在A F B1检测中的研究进展,重点阐述不同信号标记材料及其对应方法学,并讨论了目前免疫层析检测的不足及未来发展方向,以期为A F B1的现场即时检测提供参考。关键词:侧流免疫层析技术;黄曲霉毒素B1;信号标记材料;生物受体;快速检测中图分类号:O 6 5 8.1 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 6-6 1 4 4(2 0 2 3)0 3-3 6 7-0 5黄曲霉毒素是寄生曲霉和黄曲霉共同作用下产生的次级代谢产物,广泛存在于谷物、食品和饲料中,可能导致癌症、D NA突变和畸胎。黄曲霉毒素B1(A f l a t o x i nB1,A F B1)是黄曲霉毒素的一种,其分布最广、毒性最强、危害最大。因此,A F B1被国际癌症研究机构归类为I类致癌物1。世界上许多国家和地区制定了食品中A F B1的最高允许限量,欧盟一般为52 0g/k g,美国一般为2 0g/k g,中国一般为0.52 0g/k g2。鉴于A F B1的低允许限量,亟需灵敏、简便的分析方法来评估食品和农产品中微量A F B1。目前,常用的A F B1检测手段有高效液相色谱3和液相色谱-质谱联用4等。虽然这些方法准确度高,但通常需要大型仪器和专业人员,操作繁琐且耗时。基于农场、海关和超市等资源有限地区快速、现场筛查的需要,免疫分析法已被广泛用于饲料与谷物中A F B1的检测。常见的A F B1的免疫检测方法有酶联免疫吸附试验5、电化学免疫分析和比色免疫分析6等。其中,侧流免疫分析技术(L F I A)以其简单、快速、用户友好等优势而得到广泛的认可。本文简要概述了侧流免疫分析技术、A F B1的检测原理及进展,并对存在的不足及未来发展方向进行讨论。1 侧流免疫分析侧流免疫层析试纸主要由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(N C膜)和吸收垫等4部分组成(图1 A)。在N C膜上有用于观察判断检测结果的检测线(T线)和用于判定检测结果是否有效的控制线(C线)7。根据免疫结合模式的不同,L F I A主要分为两种类型8(图1 B):(1)双抗夹心法。待测物与信号探针结合,在T线上被预固定抗体捕获,形成三明治夹心结构,其特点是待测物浓度与T线信号强度成正比。(2)竞争法。待测物在T线与预固定的包被抗原竞争结合信号探针,从而释放先前结合的信号探针,其特点为待测物浓度与T线信号强度成反比。黄曲霉毒素B1是小分子物质9,通常适用于竞争法。以胶体金为标记材料,测定原理如图1 C所示。将A F B1-B S A和羊抗鼠I g G预先铺设在T线与C线上,当样品中没有A F B1时(阴性检测),A u N P s-A F B1a n t i b o d y可与T线上的A F B1-B S A相结合,在T线观察到红色条带;当样品中存在A F B1时(阳性检测),A u N P s-A F B1a n t i b o d y首先与样品中的A F B1进行结合,从而抑制了与T线上A F B1-B S A的结合,导致T线上观察不到明显红色条带。剩余信号探针继续迁移至C线处,被固定的羊抗鼠I g G捕获,验证检测的763第3期童璐等:侧流免疫层析技术在黄曲霉毒素B1检测中的研究进展第3 9卷有效性。图1 侧流免疫层析试纸的结构7(A)、检测模型8(B)及A F B1检测原理图9(C)。F i g.1 S c h e m a t i cd i a g r a mo f s t r u c t u r e7(A),d e t e c t i o nm o d e l8(B),a n dA F B1s e n s i n gp r i n c i p l e9(C)o f l a t e r a l f l o wi mm u n o c h r o m a t o g r a p h y.2 比色法胶体金是氯金酸水溶液在还原剂作用下,聚合成特定大小的金纳米颗粒,尺寸为1 04 0n m1 0。当这些标记物在特定位置大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而可用于定性或半定量测定。如图2 A所示,X i n g等人1 1利用金纳米颗粒和抗体制备了标记探针,设计开发了一个通道可调的多重侧向流动条云平台。将多种霉菌毒素-B S A和小鼠I g G喷洒在N C膜上形成多条T线和C线。阳性测定时,目标分析物首先会特异性地与A u N P s探针结合,形成偶联物。此时,偶联物不再被T线上的包被抗原所捕获,但与C线山羊抗小鼠I g G反应并捕获。在阴性测定时,探针与T线抗原反应,形成A u N P s-抗体-毒素-B S A复合物,而多余探针将被捕获在C线上。结果表明,小麦中A F B1的可视化检测限和定量检出限分别为2 0g/k g和4g/k g。抗体与标签的结合效率与温度和p H等因素相关,从而影响检测性能1 2。因此,研究者提出了纳米材料标记核酸适配体的方法。核酸适配体可特异性识别单一小分子、复杂的混合物以及完整的有机体1 3。将核酸适配体应用于层析试纸条,可将小分子检测从传统竞争型转换成三明治模型,有效降低反视觉观察的不准确性1 4。Z h a n g1 5等构建了基于适配体功能化金纳米颗粒的侧流免疫层析试纸,其可视检测限为1 0n g/m L,定量检测限为1.0 5n g/m L。传统胶体金标签仅依靠光吸收进行显色,灵敏度有限。基于此,研究人员致力于开发新型的酶标记材料,通过酶催化显色以提高可视化检测的灵敏度。当前,基于纳米酶的生物检测方法主要集中于使用类过氧化物酶纳米酶,这类酶能在特定情况下识别并诱导过氧化物酶底物催化1 6。通过酶显色催化反应,可进一步信号放大,实现高灵敏可视化定性识别。如图2 B所示,C a i1 7将M n O2纳米片作为抗体的标记物,利用了M n O2-TMB催化显色体系发展了一种检测A F B1的竞争型L F I A。首先探针与T线上的抗原结合形成棕色带,随后在T线上添加TMB溶液,利用M n O2-TMB催化放大系统增强T线上的信号颜色。该方法的检出限为1 5p g/m L,检测范围跨越4个数量级,可满足不同国家对食品和饲料中A F B1残留限量的要求。3 荧光法基于胶体金及酶显色的L F I A只能实现对A F B1的定性或半定量检测,灵敏度还有极大的提升空间。863第3期分 析 科 学 学 报第3 9卷图2 基于比色法的A F B1免疫层析试纸条。(A)胶体金1 1;(B)纳米酶1 7。F i g.2 L a t e r a l f l o wi mm u n o c h r o m a t o g r a p h yb a s e do nc o l o r i m e t r y.(A)G o l dn a n o p a r t i c l e s1 1;(B)N a n o z y m e1 7.荧光纳米材料(如时间分辨荧光微球、荧光染料、量子点和上转换纳米粒子)因高量子产率、强光稳定性、低光学背景等特点,已作为信号标签广泛用于L F I A的定量分析1 8。图3 基于荧光纳米材料的A F B1侧流免疫层析测定。(A)时间分辨荧光微球2 0;(B)荧光染料2 6;(C)量子点2 8;(D)上转换纳米粒子3 4。F i g.3 D e t e r m i n a t i o no fA F B1l a t e r a l f l o wi mm u n o c h r o m a t o g r a p h yb a s e do nf l u o r e s c e n tn a n o m a t e r i a l s.(A)T i m e-r e s o l v e df l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e s2 0;(B)F l u o r e s c e n td y e s2 6;(C)Q u a n t u md o t s2 8;(D)U p c o n v e r s i o nn a n o p a r t i c l e s3 4.时间分辨荧光微球是将成千上万个镧系元素荧光分子包裹于单个纳米级聚苯乙烯微球中,利用镧系元素的长荧光寿命,消除背景干扰,可实现更灵敏的定量分析1 9-2 1。T a n g2 2等将E u/T b()负载在羧基963第3期童璐等:侧流免疫层析技术在黄曲霉毒素B1检测中的研究进展第3 9卷聚苯乙烯纳米球中,制得E u/T b()纳米球标签,可将A F B1的检测限降低至0.0 5n g/m L。C h a n g2 3等建立了一种多重时间分辨免疫层析技术同时定量检测6种谷物中的A F B1的新方法,其最低检测限为0.0 4g/k g。W a n g2 4等开发了一种用于玉米中A F B1检测的时间分辨荧光免疫层析技术,定量检出限为0.1 6g/k g。S u n2 5等开发了用于中草药中A F B1检测的时间分辨荧光免疫层析技术,其定量检测限可达0.6 0g/k g。荧光染料具有优异的发光特性,标记抗体后可制得荧光信号标签。Z h a o2 6等研制了一种用于检测A F B1的侧向流动适配体层析试纸。在A F B1阴性样本中,C y 5标记的适配体首先在T线与部分互补链的单链D NA结合,剩余的适配体与C线上的p o l yT结合,即A F B1浓度越高,在T线上捕获的游离C y 5标记的适配体就越少,T线的荧光强度越低。结果表明,该试纸可将A F B1的检出限降低至0.1 6n g/m L。量子点作为一类新兴的生物荧光标记材料,具有宽吸收、窄发射、强稳定性、高荧光量子产率等特点2 7。G u o等2 8通过一锅超声乳化法制备了高发光的磁性荧光微珠(MF B s)。将所得MF B s用作L F I A的信号标签,可实现老抽酱油中的A F B1的痕量检测,酱油提取物和纯黑酱油中的检出限分别为3和5 1p g/m L。J i a2 9等建立了基于量子点纳米棒的荧光免疫层析试纸条,用于食用和药用莲子中A F B1的现场检测,检出限为1n g/m L。L i3 0等合成了核壳量子点,基于该信号标签的荧光试纸对A F B1的检出限为0.0 0 5n g/m L。S h a o3 1等开发了一种基于量子点纳米珠的多重L F I A用于同时定量检测A F B1和Z E N,检测限分别为1.6 5p g/m L和5 9.1 5p g/m L。W a n g3 2等建立了一种基于红色荧光微球的侧向流动免疫分析技术,用于酒糟中A F B1的定量检测,其检测限为3.4g/k g。上转换荧光纳米粒子是一种能在长波长光(通常为红外光)激发下发射出短波长光(通常为可见光)的材料。它能避免生物背景荧光的干扰、有机类发光标记物稳定性差以及量子点潜在毒性的缺点3 3。Z h a o3 4等建立了一种基于上转换荧光技术的免疫层析法,用于谷物中A F B1的检测,与传统的胶体金试纸条(0.2 5n g/m L)相比,该方法对A F B1(0.0 3n g/m L)具有更高的灵敏度。4 结论经过多年的不断完善和发展,L F I A为A F B1检测提供了一个方便、快捷和灵敏的技术平台。针对A F B1的竞争型免疫层析可视化检测大多依靠光吸收进行显色,即通过颜色亮度的强弱进行判读,给出“是”或“否”的定性结果。由于受信号/背景对比度的局限,人眼对低浓度靶标变化难以做出准确的判断,特别是针对竞争型免疫分析(颜色亮度与目标物浓度呈反比)。此外,“是”和“否”之间显示的中间颜色是模糊不清的,以至于难以实现更准确的半定量测量,从而无法分析特定浓度/区间标准的标志物。因此,寻求辨识度更高的可视化识别机制,替代传统的颜色亮度识别原理,才能从根本上解决当前可视化传感原理的局限,实现更准确的可视化半定量分析。同时定量结果多以单波长强度输出,易受到外界因素(背景信号、样品的光散射、激发光的波动等)的干扰,准确度也需进一步提高。参考文献:1 C R E P P YEE.T o x i c o l o g yL e t t e r s,2 0 0 2,1 2 7:1 9.2 Z HUC,Z HAN GGL,HUAN GYF,e t a l.J o u r n a l o fH a z a r d o u sM a t e r i a l s,2 0 1 8,3 4 4:2 4 9.3 WANG W H,Z HAN GQ,MAF,e t a l.R e a g e n t s(汪文花,张奇,马飞等.化学试剂),2 0 2 1,4 3(1 1):1 5 3 6.4 CHA R L E RMR O JR,P HU E N GWA SS,MAK O R NWA T T ANA M,e t a l.T a l a n t a,2 0 2 1,2 3 3:1 2 2 5 4 0.5 L I UZW,HUAQC,WAN GJ,e t a l.B i o s e n s o r sa n dB i o e l e c t r o n i c s,2 0 2 0,1 5 8:1 1 2 1 7 8.6 Z HAN GS.D e v e l o p m e n to faR a p i dD e t e c t i o nT e c n o l o g yo faS t r i pb a s e do nA p t a m e r s i nt h eD e t e c t i o no fA f l a t o x i nB1.B e i j i n g:B e i j i n gU n i v e r s i t yo fC h e m i c a lT e c h n o l o g y(张珊.核酸适配体试纸条法快速检测黄曲霉毒素B1残留,北京:北京化工大学),2 0 1 8.7 S UKUMA R ANA,THOMA ST,THOMA SR,e t a l.I n d i a nJ o u r n a l o fC l i n i c a lB i o c h e m i s t r y,2 0 2 1,3 6(2):2 0 8.8 B AHA D L REB,S E Z G I N TR K M K.T r e n d s i nA n a l y t i c a lC h e m i s t r y,2 0 1 6,8 2:2 8 6.9 G AOPP,R E NY W,YAN GXY,e t a l.F o o dS c i e n c e(高平娉,任玉伟,杨鑫焱等,食品科学),2 0 2 2,4 3(5):2 5 2.1 0L USY.D e v e l o p m e n to fC o l l o i d a lG o l dI mm u n o c h r o m a t o g r a p h i cA s s a yf o rR a p i dD e t e c t i o no fA f l a t o x i nB1.Y a n g-z h o u:Y a n g z h o uU n i v e r s i t y(卢守英.黄曲霉毒素B1胶体金免疫层析试纸条的研制,扬州:扬州大学),2 0 1 0.073第3期分 析 科 学 学 报第3 9卷1 1X I NGCR,D ON GX,XUT,e t a l.A n a l y t i c a lB i o c h e m i s t r y,2 0 2 0,6 1 0:1 1 3 9 2 8.1 2F A B I O D IN,S I MON EC,C L AUD I OB,e t a l.A C SA p p l i e dM a t e r i a l s&I n t e r f a c e s,2 0 1 9,1 1(3 6):3 2 7 5 8.1 3WANG H.S t u d yo nt h eR a p i dD e t e c t i o no fM y c o t o x i n sb yA p t a m e r-b a s e dL a t e r a lF l o wC h r o m a t o g r a p h yT e s tS t r i p s.B a o d i n g:H e b e iU n i v e r s i t y(王荷.基于核酸适配体的侧流层析试纸条快速检测真菌毒素研究,保定:河北大学),2 0 2 0.1 4L I ULH.S t u d yo nR a p i dD e t e c t i o no fM y c o t o x i n sb yA a p t a m e rS t r i p s.W u x i:J i a n g n a nU n i v e r s i t y(刘丽红.真菌毒素快速检测适配体试纸条的研究,无锡:江南大学),2 0 1 8.1 5Z HAN GS,Z HA OS,WAN GS,e t a l.J o u r n a l o fA OA CI n t e r n a t i o n a l,2 0 1 8,1 0 1(5):1 4 0 8.1 6OM I D F A RK,KHO R S AN DF,D A R Z I AN IA Z I Z IM.B i o s e n s o r sa n dB i o e l e c t r o n i c s,2 0 1 3,4 3:3 3 6.1 7C A IXF,L I ANG MJ,MAF,e t a l.F o o dC h e m i s t r y,2 0 2 2,3 7 7:1 3 1 9 6 5.1 8L IM.R e s e a r c ho nQ u a n t i t a t i v eD e t e c t i o no fM y c o t o x i n s i nM i l ka n dD e v e l o p m e n t o fT e s t S t r i p sb a s e do nF l u o r e s c e n c eI mm u n o c h r o m a t o g r a p h y.W u x i:J i a n g n a nU n i v e r s i t y(李淼.基于荧光免疫层析定量检测牛奶中真菌毒素的方法研究及试纸条研制,无锡:江南大学),2 0 2 1.1 9L IH,WAN GD,T ANGXQ,e t a l.F r o n t i e r s i nM i c r o b i o l o g y,2 0 2 0,1 1:6 7 6.2 0WANGD,Z HANGZW,L IPW,e t a l.S e n s o r s,2 0 1 6,1 6(7):1 0 9 4.2 1Z HAN GZW,TANGXQ,WAN GD,e t a l.P l o sO n e,2 0 1 5,1 0(4):e 0 1 2 3 2 6 6.2 2T AN GXQ,L IP W,Z HAN GQ,e t a l.A n a l y t i c a lC h e m i s t r y,2 0 1 7,8 9(2 1):1 1 5 2 0.2 3CHANGXX,Z HANGYQ,L I U HB,e t a l.A n a l y t i c a lM e t h o d s,2 0 2 0,1 2(3):2 4 7.2 4WANGD,Z HUJG,Z HAN GZW,e t a l.T o x i n s,2 0 1 9,1 1(1):5 6.2 5S UNSJ,Z HE NGPM,Z HAOSJ,e t a l.F o o dA d d i t i v e s&C o n t a m i n a n t s:P a r tA,2 0 1 8,3 5(1 2):2 4 3 4.2 6Z HA OZL,WAN G H,Z HA IW L,e t a l.T o x i n s,2 0 2 0,1 2(2):1 3 6.2 7L I JY,MA O M,WUF,e t a l.A n a l y t i c a lM e t h o d s,2 0 1 8,1 0(2 9):3 5 8 2.2 8GUOL,S HAOYN,D UAN H,e t a l.A n a l y t i c a lC h e m i s t r y,2 0 1 9,9 1(7):4 7 2 7.2 9J I ABY,L I AOXF,S UNCN,e t a l.F o o dC h e m i s t r y,2 0 2 1,3 5 6:1 2 9 6 1 4.3 0L I JY,MA O M,WUF,e t a l.A n a l y t i c a lM e t h o d s,2 0 1 8,1 0(2 9):3 5 8 2.3 1S HAOYN,D UAN H,Z HOUS,e t a l.J o u r n a l o fA g r i c u l t u r a l a n dF o o dC h e m i s t r y,2 0 1 9,6 7(3 2):9 0 2 2.3 2WANGZF,L UOPJ,Z HE N GBD.F o o d s,2 0 2 1,1 0(9):2 1 0 9.3 3WUSJ.R e s e a r c ho f t h eS e n s i t i v eD e t e c t i o nM e t h o d s f o rM i c r o b i a lT o x i n sb a s e do nU p c o n v e r s i o nN a n o p a r t i c a l s a sL a-b e l s.W u x i:J i a n g n a nU n i v e r s i t y(吴世嘉.基于上转换荧光纳米探针的高灵敏微生物毒素检测方法研究,无锡:江南大学),2 0 1 3.3 4Z HA OY,L I UX,WAN GXC,e t a l.T a l a n t a,2 0 1 6,1 6 1:2 9 7.R e s e a r c hP r o g r e s so nt h eD e t e c t i o no fA f l a t o x i nB1b yL a t e r a lF l o wI mm u n o a s s a yT ON GL u,L ID a q u a n,WAN GJ i n g*(C o l l e g e o fC h e m i s t r ya n dE n g i n e e r i n g,Z h e j i a n gU n i v e r s i t yo fT e c h n o l o g y,H a n g z h o u3 1 0 0 1 4)A b s t r a c t:L a t e r a l f l o wi mm u n o a s s a y(L F I A)i sar a p i da n a l y s i sm e t h o dt h a tc o m b i n e sc h r o m a t o g r a p h ya n d i mm u n o l o g y,w h i c hp r o v i d e sag o o dp l a t f o r mf o rt h eo n-s i t ea n dr a p i dd e t e c t i o no fa f l a t o x i nB1(A F B1).T h i sp a p e r i n t r o d u c e s t h er e s e a r c hp r o g r e s so fL F I Ai nt h ed e t e c t i o no fA F B1f r o mt w om e t h o d so fc o l o r i m e t r ya n df l u o r e s c e n c e,f o c u s i n go nd i f f e r e n ts i g n a ll a b e l i n g m a t e r i a l sa n dt h e i rc o r r e s p o n d i n gm e t h o d o l o g i e s,a n dd i s c u s s e st h ec u r r e n ts h o r t c o m i n g sa n df u t u r ed e v e l o p m e n to fi mm u n o c h r o m a t o g r a p h i cd e t e c t i o n,w i t hav i e wt op r o v i d i n ga r e f e r e n c e f o rp o i n t-o f-c a r ed e t e c t i o no fA F B1.K e y w o r d s:L a t e r a l f l o wi mm u n o a s s a y;A f l a t o x i nB1;S i g n a lm a r k e rm a t e r i a l s;B i o l o g i c a lr e c e p t o r s;R a p i dd e t e c t i o n173