大黄素通过NF-kB-iNOS_COX-2信号通路治疗急性胰腺炎的作用机制研究.pdf

基础研究Journal of Hepato3,Jun.2023肝胆外科杂志2 0 2 3年6 月第31卷第3期224大黄素通过NF-kB-iNOS/COX-2信号通路治疗急性胰腺炎的作用机制研究王子孺，李贺【摘要】目的石研究大黄素对急性胰腺炎的抗炎治疗作用及相关机制。方法半将2 4只SPF大鼠随机分为假手术组（Sh a m 组）、蔗糖脂肪酸酯处理组（Z组）、模型组（AP组）和大黄素处理组（E组）,每组6 只。除Sham组外,每一个组中均须使用L-精氨酸制作急性胰腺炎模型,E组于造完模型后1h及6 h分别给予大黄素（6 0 mg/kg）腹腔注射治疗;Z组比照E组，腹腔注射等量的4%的蔗糖脂肪酸酯溶液进行处理；造模实验期间每间隔2 h观察大鼠的一般情况，AP组造模12 h后处死大鼠，E组及Z组末次给药后12 h后处死大鼠,ELISA法检测大鼠血清中TNF-、IL-6、IL-1、i NO S和COX-2,TBA法检测大鼠血清中SOD、M D A 含量；WesternBlot检测大鼠胰腺组织NF-kB蛋白的表达情况;HE染色法检测胰腺及周围组织中的细胞炎症情况。结果与Sham组相比,AP组大鼠一般情况明显变差，血清TNF-、I L-6 及IL-1指标升高（P0.05）,SO D 活性升高，MDA活性降低（P0.05）CO X-2 及iNOS显著升高（P0.05）;与AP组相比，大黄素处理组中TNF-、I L-6 及IL-1指标明显降低（P0.05）,SO D 活性升高，MDA活性降低（P0.05）；CO X-2 及iNOS明显降低（P0.05）；与Sham组比较，AP组大鼠胰腺组织中NF-kB蛋白表达水平显著增加（P0.05）；与AP组相比,E组NF-kB蛋白表达水平明显降低（P0.05）。结论大黄素可以通过NF-kB-iNOS/COX-2通路来控制胰腺炎症，从而达到治疗胰腺炎的效果。【关键词】急性胰腺炎；大黄素;NF-kB-iNOS;COX-2；炎性因子【中图分类号】R 659【文献标识码】A【文章编号】1006-4761(2023)03-0224-06the anti-inflammatory and therapeutic effects of emodin on acute pancreatitis and its related mechanisms(WANG Zi-ru,LIHu.The Second Hospital of Anhui Medical University,Hefei230000,China)【A b s t r a c t Objective To study the anti-inflammatory and therapeutic effects of emodin on acute pancreatitis and its relatedmechanisms.Method 24 SPF rats were randomly divided into sham surgery group(Sham group),sucrose fatty acid ester treatmentgroup(Z group),model group(AP group),and emodin treatment group(E group),with 6 rats in each group.Except for the Shamgroup,L-arginine was used to create an acute pancreatitis model in each group.Group E received intraperitoneal injection of emodin(60mg/kg)1 hour and 6 hours after the model was established,respectively;Group Z was treated with intraperitoneal injection of anequal amount of 4%sucrose fatty acid ester solution compared to Group E;During the modeling experiment,the general condition ofthe rats was observed every 2 hours.After 12 hours of modeling in the AP group,the rats were euthanized.After 12 hours of the lastadministration in the E and Z groups,the rats were euthanized.The serum TNF-、IL-6、IL-1、i NO S a n d CO X-2 o f t h e r a t s w a s d e-tected by ELISA method;TBA method was used to detect the content of SOD and MDA in rat serum;Western Blot detection of the ex-pression of NF-kB protein in rat pancreatic tissue;HE staining was used to detect cellular inflammation in the pancreas and surroundingtissues.Result Compared with the Sham group,the general condition of rats in the AP group significantly deteriorated,with serumTNF-、IL-6 a n d IL-1 increased(P0.05),SOD activity increased,MDA activity decreased(P0.05),COX-2 and iNOS signifi-cantly increased(P0.05);Compared with the AP group,TNF in the emodin treated group-、IL-6 a n d IL-1 The indicators sig-nificantly decreased(P0.05),SOD activity increased,and MDA activity decreased(P0.05);COX-2 and iNOS significantly de-creased(P0.05);Compared with Sham group,The expression level of NF-kB protein in AP group rats pancreatic tissue was signifi-cantly increased(P0.05);The expression level of NF-kB protein in group E rats pancreatic tissue decreased significantly comparedto AP group(P 98%）购自北京索莱宝科技有限公司（批号：518-8 2-1）;L-精氨酸和蔗糖脂肪酸酯（批号：1119-34-2,IS9000）购自北京索莱宝科技有限公司；水合氯醛（分析试剂）购自天津大茂化学试剂厂（批号：30 2-17-0）；10%多聚甲醛购自南昌玉露实验设备有限公司（批号2 2 0 6 0 7）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒购自武汉塞维利亚生物科技有限公司（批号G1005）；冰醋酸溶液（分析纯，醋酸浓度99.5%）购自天津恒兴化学试剂有限公司（批号：6 4-19-7）；无水乙醇购自成都麦卡希化工有限公司（批号：6 4-17-5）；实验用NF-kB抗体和山羊抗小鼠二级抗体购自CST公司。肿瘤坏死因子（T NF-）ELISA 试剂盒（批号：E-EL-R2856c）、白介素-6（IL-6）ELISA 试剂盒（批号：E-EL-R0015c）、白介素-1（IL-1)ELISA试剂盒（批号：E-EL-R0012c）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；前列腺素内过氧化物酶2（PTGS2/COX-2)ELISA试剂盒（编号：D731111）、诱导型一氧化氮合成酶（NOS2/iNOS）ELISA 试剂盒（编号：D731068）购于生工生物工程（上海）股份有限公司；总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（WST-1法）（批号：A001-3-2）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA法）（批号：A003-1-2）购于南京建成生物工程研究所有限公司。2方法2.1分组、造模与给药24只无特定病原体（SPF）的大鼠随机分为假手术组（Sh a m 组）、蔗糖脂肪酸酯处理组（Z组）、模型组（AP组）和大黄素处理组(E组）。每组6 只。除Sham组外，各组均采用L-精氨酸制作急性胰腺炎模型。大黄素组在模型建立后1小时和6 小时腹膜内注射大黄素（用4%蔗糖脂肪酸酯溶液制备）;Z组腹膜内注射相同量的4%蔗糖脂肪酸酯。在造模期间，观察大鼠的一般生活状况。模型建立后12 小时处死大鼠。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测IL-6、I L-1、T NF-;以及COX-2和iNOS。酶标试剂盒检测总SOD、MDA含量，进行NF-kB蛋白表达的蛋白质印迹（WB）检测。苏木精-伊红（HE）用于胰腺染色。观察胰腺组织的炎症情况。2.2样本采集与处理AP组造模12 h后处死大鼠,E组及Z组末次给药后12 h后处死大鼠，处死前留取血液标本。于EP管中静置，然后以150 0 g低温离心10 min,吸取血清并分装于冻存管中，放-8 0 冰箱冻存，用于测定血清中炎症指标及其他生化指标；处死大鼠后留取大鼠胰腺组织，用于后续测定蛋白表达情况及HE染色。2.3大鼠血清中TNF-、IL-6、IL-1、i NO S和COX-2水平测定按照ELISA试剂盒方法进行操作，检测各组大鼠血清中TNF-、I L-6、I L-1、i NO S和COX-2水平，测定仪器为全自动血生化分析仪。2.4大鼠血清中SOD、M D A 水平测定按照酶标试剂盒方法进行操作，检测各组大鼠血清中SOD、M D A 水平2.5大鼠胰腺组织中NF-kB蛋白含量采用WesternBlot检测大鼠胰腺组织中NF-kB蛋白含量：取胰腺组织，与组织蛋白提取液一起在组织匀浆机上匀浆，然后10 0 0 0 g离心10 min，收集组织上清液，采用二喹啉甲酸（BCA)法对上清液中蛋白定量，然后将蛋白置于-8 0冰箱中保存，备用。取等量蛋白（2 5g）上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，采用半干转膜法转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，脂奶粉封闭后,用相应一抗(1：10 0 0)在4下孵育，振荡过夜；TBST液漂洗3遍，羊抗免二抗（1：5000）孵育1h;TBST液漂洗3遍，采用化学发光超敏显色试剂盒显影。以GAPDH为内参,ImageJ分析靶带和内部对照带的灰度值，计算NF-kB蛋白的相对表达。2.6HE染色观察胰腺组织病理变化取各组大鼠胰腺，以4%多聚甲醛固定48 h，蒸馏水洗涤，梯度乙醇脱水，制作组织蜡块，冰上预冷4m切片，二甲苯脱蜡30 min，梯度乙醇复水，使用苏木精和伊红染液分别染细胞核和细胞质，脱水、透明后中性树胶封片，镜下观察各Journal,Jun.2023226肝胆外科杂志2 0 2 3年6 月第31卷第3期组大鼠胰腺组织病理变化。2.7数据分析使用SPSS22.0进行数据分析。正态性检验采用Sha-piro-Wilk检验方法。用s来描述符合正态分布的连续变量，独立样本t检验被用来比较两组间的差异；P0.05时认为差异具有统计学意义。3结果3.1大黄素对大鼠般状况的影响Sham组大鼠精神状态正常，活动正常，无明显扭体现象。与AP模型组大鼠相比,Z组大鼠的表现无显著差异；AP组大鼠出现疲劳和严重嗜睡，活动次数显著减少，自造模完成至处死期间（12 h），平均排便次数不到2 次，并有明显的腹部饱胀，12 h内频繁出现扭体现象（平均5次），有舔腹部表现；E组大鼠倦卧，但无明显嗜睡。从建模完成处死（12 h）,平均排便次数为6 次。同时，与AP组相比扭体表现减少(平均 3次）。3.2大黄素治疗前后大鼠胰腺的病理学观察在10 0 倍光学显微镜下,Sham组胰腺腺泡、胰岛和导管结构清晰正常，腺泡结构中可见深蓝色细胞核（图A）；Z组和AP组的病理学表现无显著差异（图B）；A P组细胞排列结构紊乱，间质可见明显炎症细胞浸润，间质微血管破裂出血,血管内红细胞溢出(图 C);与AP组相比,E组胰腺组织中炎症细胞的浸润减少，血管破裂和出血得到改善（图D）。ABCD图1大鼠胰腺组织病理切片镜下观察（10 10）3.3大黄素对大鼠血清炎症因子含量的影响结果见表1及图2,与Sham组大鼠比较，AP组大鼠IL-6、T NF-及IL-1水平显著增加（P0.05）,E组大鼠血清IL-6、T NF-及IL-1水平较AP组明显降低（P0.05）。3.4大黄素对血清SOD、M D A、C O X-2 及iNOS含量的影响结果见表2 及图3,与Sham组大鼠比较，AP组大鼠SOD含量明显降低（P0.05），M D A、CO X-2 及iNOS含量明显升高（P0.05）,E组SOD含量较AP组明显升高（P0.05），M D A、CO X-2 及iNOS含量较AP组明显降低。表1大大黄素对各组大鼠血清L6、TNF-和IL-1的影响(xs,n=6)IL-6TNF-IL-1Group(pg:mL-)(pg:mL-)(pg:mL-)Sham Group128.70 9.3347.36 2.2017.93 2.10ZGroup161.30 4.5448.12 3.2218.49 0.65AP Group232.07 9.42125.805.8127.31 1.50EGroup140.23 5.7855.79 4.8718.97 1.59F value140.03352.7627.49Pvalue0.0000.0000.000表2大黄素对各组大鼠血清SOD、M D A、COX-2及iNOS的影响(xs,n=6)SODMDACOX-2iNOSGroup(U:mg(U mg(U:mL-)1(U mL-I)Sham Group 151.99 3.4590.04 3.06318.72 0.5218.76 0.52Z Group158.59 4.7295.24 3.09326.06 14.5820.000.53AP Group96.76 2.62130.60 5.42452.56 2.9052.57 2.88E Croup141.46 3.08105.67 3.50346.72 8.7426.40 2.10F value368.20128.34311.28449.244P value0.0000.0000.0000.0003.5大黄素对大鼠胰腺组织中NF-kB蛋白表达的影响结果见图4,与Sham组比较,AP组大鼠胰腺组织中NF-kB蛋白表达水平显著增加（P0.05）;E组NF-kB蛋白表达水平较AP降低明显（P0.05）。4讨论研究表明，急性胰腺炎的主要病理过程之一是胰腺分泌的胰酶和各种炎症因子介导胰腺的消化,导致胰腺腺泡细胞损伤后局部炎症的一系列反应。在AP患者中，受损的腺泡细胞会产生多种炎症因子，如细胞因子、趋化因子和粘附分子，通过多种方式激活免疫细胞（如中性粒细胞和单核巨噬细胞），并将其募集到胰腺组织和全身其他器官的损伤部位，从而放大炎症反应 1。如果此时不再需要采取医疗干预，20%或更多的急性胰腺炎病例最终会发展或转变为重症急性胰腺炎(SAP)12-13。SA P 是一种急性和危重症,涉及全身多个器官和系统，临床病程危险，治疗困难。发病过程是早期局部炎症性病变可以激活细胞因子级联的信号通路，诱导炎症因子的释放，使局部炎症因子在体内快速释放，从而使局部炎症迅速扩展到全身，引起全身炎症反应综合征（SI R S），并最终导致多器官功能障碍综合征（MODS）和死亡 14-15。SAP患者更有可能并发难治性厌氧细菌和真菌感染,这增加了败血症的风险。大多数SAP患者发病迅速，病情复杂，死亡率高达30%16-17 。目前,SAP的临床治疗主要是基础疾病的控制和治疗、抑制胰腺分泌和保护器官功能的对症治疗 18 。因此,探索如何有效改善早期炎症反应,延缓疾病进展,避免SAP的发生，已成为急性胰腺炎临床治疗的重要组成部分。AP的疾病发展途径主要包括早期胰腺器官的各种局部病理损伤、局部炎症甚至广泛的全身炎症免疫反应，炎症因子的敏感变化可以反映体内炎症的情况。白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-（T NF-）在SAP中显著Journalof,Jun.2023肝胆外科杂志2 0 2 3年6 月第31卷第3期227ABC40-300150-TTT*30*200-100-nsns20ns100-50-10TTETT000ZgroupAPgroupEgroupZ.groupAPgroupEgroupZ.groupEgroupAPgroupShamgroupShamgroupShamgroup图2大黄素对各组大鼠血清IL-6、T NF-和IL-1的影响BCD2001507500-60ns150400-(uraioidBu/n)aos100ns40300-10050200-20-ns50T100TTTZ.groupAPgroupEgroupZ.groupAPgroupEgroupShamgroupShamgroupZ.groupAPgroupEgroupZ.groupAPgroupEgroupSham groupSham group图3大黄素对各组大鼠血清青SOD、M D A、CO X-2 及iNOS的影响AShamGroupZGroupAPGroupEGroupP-p65p65-actinB2.55TTTTTns*一2.01.51.00.50.0ZGroupEGroupAPGroupShamGroup图4NF-kB蛋白在大鼠胰腺组织的表达升高，目前被认为是AP预后和严重程度的指标 19-2 0 。白介素-1(IL-1)也属于白介素家族，已被证明与胰腺细胞损伤有关 2 1,并有可能成为未来AP的新实验室指标。大黄作为一种古老的中药材，一直被认为可以改善炎症反应，中药专著也有记载，大黄在被发现可治疗急性胰腺炎之前就已经广泛应用于哮喘、骨关节炎以及角膜炎等疾病的治疗中。大黄素作为大黄的主要组成部分，一些文献报道了大黄素降低鼠体内肠道炎症介质、增强大鼠肠道巨噬细胞的吞噬能力,从而直接改善AP的相关报道的一些动物性研究：如李慧艳等 2 2 报道大黄素联合黄芩苷可抑制AP大鼠的氧化应激反应；金晶等 2 3 报道生大黄及其有效成分可抑制胰腺组织核转录因子-kB（NF-k B）的活化，降低炎症递质如 TNF-、IL-6 和 IL-8 和细胞因子的表达水平;Guo F 等 2 4发现大黄素对急性胰腺炎可能导致的严重肺损伤等器官损伤有很大程度的病情改善作用。ZhouQ等 2 5 发现大黄素能改善细胞免疫功能以及改善肠粘膜损伤进一步改善AP的症状。NF-kB能介导细胞信号双向传递,是一种参与调节细胞生长周期发育的重要转录因子，它参与调节胰腺细胞的生长周期和发育，同时广泛参与了炎症生理反应、免疫反应调控等多种机体生理过程。YangL等 2 6 发现诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶2（COX-2）是NF-kB的重要下游因子，研究人员证明，NF-kB-iNOS/COX-2信号通路与急性炎症有关,抑制该途径可以进一步减少TNF-和IL-6的释放，从而下转第2 40 页）Journalof,Jun.2023Hepate肝胆外科杂志2 0 2 3年6 月第31卷第3期228减缓炎症的进展 2 7-2 9 。Zhou J30 和 Jakkampudi A31已经证实该信号通路与急性胰腺炎的发病有关，但是NF-kB-iN-OS/COX-2这一途径在急性胰腺炎中的作用尚未得到彻底研究。早期针对大黄素治疗急性胰腺炎的相关研究大多数着眼于“大黄素改善胰腺炎症的程度”，而不是“大黄素如何改善胰腺炎症”。随着研究的不断深人，对于大黄素治疗AP的研究逐渐向治疗机制方向转变，这也是未来研究药物治疗急性胰腺炎的趋势所在。目前研究大黄素治疗急性胰腺炎大多数是研究大黄素改善炎症反应来治疗AP,本研究的创新主要在于加入NF-kB-iNOS/COX-2信号通路，引人氧化应激指标,能从新的角度阐述大黄素对急性胰腺炎的治疗效果。本研究采用L-精氨酸制作急性胰腺炎大鼠模型，并利用大黄素进行治疗，发现大黄素治疗的急性胰腺炎大鼠各方面指标明显优于单纯模型组，与AP组相比,E组炎症指数TNF-、IL-6、IL-1及MDA含量明显下降，SOD含量明显升高（P0.05）;H E染色发现大黄素治疗组大鼠胰腺炎病理得到明显改善；同时，免疫印迹结果显示，NF-kB蛋白的表达低于单纯模型组（P0.05），这表明，大黄素可以通过影响NF-kB-iNOS/COX-2信号通路降低急性胰腺炎大鼠炎症因子水平，从而对急性胰腺炎起到治疗作用。综上所述，大黄素可以通过NF-kB-iNOS/COX-2信号通路降低急性胰腺炎炎症因子水平，为大黄素在急性胰腺炎临床治疗中的应用提供了新的理论支持。参考文献1Crockett SD,Wani S,Gardner TB,et al.American Gastroenterologi-cal Association Institute Guideline on Initial Management of AcutePancreatitis.Gastroenterology,2018,154(4):1096-1101.2Iannuzzi JP,King JA,Leong JH,et al.Global incidence of acutepancreatitis is increasing over time:A systematic review and meta-a-nalysis.Gastroenterology,2022,162(1):122-34.3Tenner S,Baillie J,DeWitt J,et al.American 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