短期投喂石榴皮水提物对花鲈防控杀鱼爱德华氏菌感染的作用.pdf

第 38 卷第 3 期大大 连连 海海 洋洋 大大 学学 学学 报报Vol.38 No.32 0 2 3 年 6 月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITYJune 2 0 2 3DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2022-241文章编号:2095-1388(2023)03-0397-09短期投喂石榴皮水提物对花鲈防控杀鱼爱德华氏菌感染的作用胡建美1,2,3,马壮1,王宝屯1,2,3,黄伟民1,冯娟2,苏友禄1(1.仲恺农业工程学院 动物科技学院,健康养殖创新研究院,广东 广州 510225;2.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室,广东 广州 510300;3.上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306)摘要:为探究石榴皮(Punica granatum L.)对花鲈(Lateolabrax maculatus)防控杀鱼爱德华氏菌(Ed-wardsiella piscicida)感染的作用,采用石榴皮水提物拌饲(添加量为 4、8 g/kg)后连续投喂花鲈(体质量为 10.14 g2.53 g)7 d,分别在投喂 3、5、7 d 时,检测鱼体血清生理生化指标和免疫相关酶活性,以及脾脏、鳃和头肾组织中免疫相关基因表达量,并用杀鱼爱德华氏菌浸泡感染花鲈,探究石榴皮水提物在细菌侵染鱼体中的防控效果。结果表明:与对照组相比,投喂添加石榴皮水提物饲料的试验组花鲈,随投喂时间延长,血清中总胆固醇、谷丙转氨酶、谷胱甘肽还原酶、乳酸脱氢酶、总蛋白和高密度脂蛋白含量均显著升高(P0.05),投喂 3、5 d 时,血糖含量显著降低(P0.05),碱性磷酸酶(AKP)活性显著升高(P 0.05);脾脏中 LZM 基因和头肾 NK-lysin、LZM 基因表达量降低,其余免疫相关基因相对表达量均有所升高;投喂石榴皮水提物混合饲料 5 d 后,使用杀鱼爱德华氏菌浸泡感染花鲈,其存活率显著提高(P0.05),说明石榴皮水提物对花鲈的杀鱼爱德华氏菌感染具有良好的防控效果,其中 4、8 g/kg 石榴皮水提物添加组对花鲈的相对保护率分别为 50%和 47%。研究表明,投喂石榴皮水提物混合饲料在短期内可有效增强花鲈免疫力和抗杀鱼爱德华氏菌感染力,且显著提高花鲈在杀鱼爱德华氏菌浸泡感染后的存活率。关键词:石榴皮;花鲈;杀鱼爱德华氏菌;免疫力中图分类号:S 948 文献标志码:A 花鲈(Lateolabrax maculatus)是中国重要的水产养殖品种,其隶属于鲈形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)花鲈属(Lateolabrax)。花鲈对环境适应能力强,适合海水网箱、海淡水池塘及工厂化养殖1,据 2022 中国渔业统计年鉴2,2021 年其年产量超 19.9 万 t,其中,广东省珠海市花鲈生产量占全国总产量的一半以上。随着养殖规模和密度的不断提高,花鲈养殖过程中的病害问题愈发严重。流行病学调查显示,咸淡水养殖的花鲈病害种类多3,其中维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)和杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)是其养殖过程中的主要致病菌4-5。非特异性免疫在鱼类抵御病原微生物的侵染中发挥重要作用。目前,对花鲈养殖中病害防控的有效途径是提高鱼体自身免疫力,减少抗生素及化学药物的使用。水产养殖用药明白纸 2022 年 1、2 号 规定,多种抗生素不允许用于水产养殖过程,抗生素的禁用大大增加了生产中病害防治难度。中草药是中国传统的医学瑰宝,历史悠久,其活性成分主要包括多糖、生物碱、有机酸和挥发油等,能够促进机体新陈代谢、提高机体免疫力和抗病能力6。相较于抗生素和化学药物,中草药不易产生毒副作用,也不易诱导致病菌产生耐药性,且多数中草药价格低廉,因此,其适合在水产养殖中推广应用。石榴原产中亚地区,在中国种植范围广阔,主要分布在陕西、安徽、四川和云南等地。石榴皮(Punica granatum L.)中含有丰富的酚类和黄酮类活性成分,据 中华人民共和国药典7记载,其具有抗氧化、抗菌、止血和驱虫等功效。石榴皮 收稿日期:2022-08-07 基金项目:广东省教育厅重点科研项目(2019KZDXM043)作者简介:胡建美(1995),女,硕士研究生。E-mail:1091158373 通信作者:苏友禄(1981),男,博士,研究员。E-mail:youlusu 提取物具有多种体外抑制病原微生物的作用。罗非鱼(Oreochromis niloticus)源维氏气单胞菌的单方中草药体外抑菌试验结果显示,其对石榴皮高度敏感,抑菌圈平均直径为 17 cm8;马玉和等9测定了 五 倍 子(Rhus chinensis)、石 榴 皮、诃 子(Terminalia chebula)、黄芩(Scutellaria baicalensis)和乌梅(Prunus mume)在不同盐度下对迟缓爱德华氏 菌(Edwardsiella tarda)和 嗜 水 气 单 胞 菌(Aeromonas hydrophila)的体外抑菌效果,结果表明,不同盐度下 5 种中草药对这两种细菌均存在抑制作用9;柯文杰等10采用琼脂扩散法测定了25 种中草药对普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的体外抑菌活性,结果显示,石榴皮具有显著的抑菌作用,最小抑菌浓度(MIC)为 1 mg/mL。本课题组前期采用平板打孔法及试管二倍稀释法测定了 60 种中草药对花鲈源杀鱼爱德华氏菌的体外抑/杀菌作用,其中石榴皮效果最佳,MIC 为15.625 mg/mL11。然而,体内试验数据的缺失致使石榴皮在花鲈抗杀鱼爱德华菌感染中的作用无法明晰。本研究中,通过将石榴皮水提物添加到花鲈日常饲料中,探究短期内石榴皮水提物拌饲投喂对花鲈血清生理生化、免疫相关酶活、组织免疫相关基因表达量,以及对花鲈浸泡感染杀鱼爱德华氏菌后死亡率的影响,以期为养殖生产中使用石榴皮水提物增强鱼类免疫力及抗病力提供数据支撑,为石榴皮替代抗生素防控花鲈细菌病害提供科学参考。1 材料方法1.1 材料1.1.1菌株及试验动物致病性杀鱼爱德华氏菌(E.piscicida 18BJ136)由课题组从患病花鲈中分离保存。健康花鲈购于广东省珠海市斗门区粉洲村某养殖场,体质量为(10.14 2.53)g,体 长 为(9.070.72)cm,暂养 15 d 后开始试验。1.1.2试剂石榴皮购自广东省珠海市斗门区某药房;海水鱼配合饲料(0.8 号)购自珠海市德海生物科技有限公司;脑心浸出液肉汤(BHI)培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。1.2 方法1.2.1 石榴皮水提物的制备 将石榴皮在 60 下烘干后粉碎,称取 100 g 的石榴皮粉用纱布包裹,注入500 mL 纯水,浸泡2 h,武火煮沸后,文火熬制 30 min,用 4 层纱布过滤,重复过滤两次,收集滤液,将滤液在水浴锅内 95100 下常压蒸发浓缩至 100 mL,121 下灭菌 20 min,置于 4 下保存。得到终质量浓度为 1 000 mg/mL(相当于生药质量浓度 1 g/mL)的石榴皮水提物。1.2.2 石榴皮水提物拌饲投喂试验选取 360 尾健康花鲈,随机分为 3 组,每组 120 尾,分别暂养于 2 m3水池内,连续充气,水温为(311),每天换水 1 次,正式试验的前一天停止喂食。试验中花鲈的日投喂量为鱼体质量的 3%,每天早、晚各 1 次,连续投喂 7 d。其中,试验组 1 和试验组2 拌饲投喂石榴皮水提物,按每 kg 配合饲料中分别添加 4、8 mL 终质量浓度为 1 000 mg/mL 的石榴皮水提物,配制成 4、8 g/kg 的中草药试验饲料12;对照组投喂正常配合饲料。1.2.3 样品采集在石榴皮水提物拌饲投喂 3、5、7 d 后,从各组取 3 尾鱼,将花鲈牺牲后解剖取其头肾、脾脏和鳃组织,立刻将组织样品悬浮在RNA 保存液中,4 下保存过夜,之后转移到-20 中保存,用于免疫相关基因表达水平的测定。在石榴皮水提物拌饲投喂 3、5、7 d 后,从各组取 10 尾鱼,使用 1 mL 无菌注射器快速从尾部静脉抽血,血液在 4 下静置 12 h 后,以 6 000 r/min离心 10 min,取上清液于-80 超低温冰箱中保存,用于生理生化及免疫相关酶活的测定。1.2.4血清生理生化指标的检测将血清样品送至广东省新海医院检验科,采用日本日立全自动生化分析仪(HITACHI 7180)检测花鲈血清总胆固醇(TC)、谷丙转氨酶(ALT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、血糖(GLU)、乳酸脱氢酶(LDH)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)共 10 个指标。1.2.5血清中相关酶活力的检测使用酸性磷酸酶和碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定花鲈血清样品中酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性。1.2.6 脾脏、鳃和头肾组织中免疫相关基因表达的检测 采用荧光定量 PCR(qPCR)检测各组织中的免疫相关基因,包括抗菌肽基因(NK-lysin)、免疫球蛋白 M 基因(IgM)、免疫球蛋白 D 基因(IgD)和溶菌酶基因(LZM),以 18S rRNA13作为内参基因。在 NCBI 上下载相关免疫基因的cDNA序 列,使 用 在 线 引 物 设 计 网 站(Primer3Plus)设计的特异性引物见表 1。采用893大连海洋大学学报 第 38 卷TRIzol Reagent 提取组织 RNA,分别使用 TBE 电泳、NanoDrop 分光光度计确认 RNA 纯度和浓度。使用 5All-In-One RT MasterMix 试剂盒将 RNA 逆转录合成 cDNA,-80 超低温冰箱中保存。荧光定量 PCR 在 LightCycler 480 中进行,所有反应均设置 3 个重复。qPCR 反应体系(共 10 L):cDNA模板 1 L,上、下 游 引 物 各 0.5 L,SYBRTM Green PCR Master Mix 5 L,ddH2O 3 L。采用两步法扩增产物,PCR 反应条件:95 下预变性30 s,95 下变性 5 s,60 下退火 60 s,共进行40 个循环。在 6095 下进行溶解曲线分析,以确定每对引物的特异性。反应结束后,采用 2-Ct方法计算基因表达量,以空白对照组相应组织的表达量为基准,计算试验组各组织的相对表达量。表 1 qPCR 引物Tab.1 qPCR primers 基因gene引物序列(5-3)primer sequence(5-3)18S rRNAF:GGGTCCGAAGCGTTTACTR:TCACCTCTAGCGGCACAANK-lysinF:AAGCTGAAGTCCGTCTGCAAR:AGCTCCTCGACCAATTTACCAIgMF:TGACCTGTACAGCCTCTGGAR:GATGGTAAACCGGCCCTGAALZMF:TCCAAGTGGGAGTCGAGCTAR:AGCGGCTGTTGATCTGGAAGIgDF:GCCAGATCAACGTCTGACCAR:TGCAGGCTGTCTGATCCAAG1.2.7花鲈浸泡感染杀鱼爱德华氏菌将冻存的杀鱼爱德华氏菌接种于 BHI 液体培养基中,28 下以 180 r/min 摇 床 培 养 12 h 后,菌 原 液 以5 000 r/min 离心 5 min,收集沉淀,用无菌生理盐水洗涤 3 次后重悬细菌,制成菌悬液。用石榴皮水提物拌饲投喂 3、5、7 d 时,分别从各组取 30 尾花鲈进行浸泡感染试验,每组 30 尾花鲈再细分为 3 个平行,即每个平行用 10 尾花鲈进行浸泡感染,试验期间水温为(32.00.5)。在盛有 8 L 水的玻璃缸中进行浸泡感染试验,3 次浸泡攻毒试验水体中杀鱼爱德华氏菌浓度分别为5.24105、6.03105、5.67105 CFU/mL,每次浸泡攻毒时长 30 min,之后,将花鲈转移到 100 L 的养殖桶中。攻毒后 14 d 内记录花鲈的发病症状和死亡情况。试验过程中,对濒死或死后不久的花鲈取其肝脏、脾脏和头肾进行病原平板划线分离,以及菌落 PCR 分子鉴定。1.3 数据处理试验数据用 Excel 2022 软件进行初步处理,采用 GraphPad Prism 9 软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),用 Tukey 法进行组间多重比较,显著性水平设为 0.05。2 结果与分析2.1 各组花鲈血清生理生化指标的变化从图 1(a)(j)可见:试验过程中,用石榴皮水提物混合饲料投喂的试验组花鲈,其血清中总胆固醇、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、谷胱甘肽还原酶、总蛋白、甘油三酯、乳酸脱氢酶和高密度脂蛋白含量总体上较对照组显著升高(P0.05);试验组花鲈的血糖含量在投喂 3、5 d 时均显著低于对照组(P0.05),但在投喂 7 d 时血糖含量显著高于对照组(P0.05);试验组谷草转氨酶含量在投喂 3、5 d 时显著高于对照组(P0.05),8 g/kg试验组谷草转氨酶含量在投喂 7 d 时恢复至对照组水平;4 g/kg 试验组低密度脂蛋白含量在投喂 3 d时与对照组含量相当,之后逐渐升高,而 8 g/kg试验组低密度脂蛋白含量在投喂 3 d 时显著低于对照组(P0.05),之后升高,并在投喂 7 d 时达到对照组水平。2.2 各组花鲈血清免疫相关酶活性的变化从图 1(k)、(l)可见,两个试验组花鲈血清中的碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P0.05),4、8 g/kg 试验组酸性磷酸酶活性分别在投喂 5、3 d 时酶活性达到峰值,投喂 7 d 时酶活性恢复到对照组水平或低于对照组水平。这表明,石榴皮水提物拌饲投喂后能够显著增加花鲈血清碱性磷酸酶活性,且高剂量投喂 7 d 后,可降低鱼体血清内酸性磷酸酶的活性。2.3 各组花鲈组织免疫相关基因表达量的变化从图 2 可见:两个试验组脾脏组织中 4 个免疫基因相对表达量变化在 7 d 内有所差异,其中,8 g/kg 试验组的 4 个免疫相关基因相对表达量变化在 7 d 内均呈现持续性上调,而 4 g/kg 试验组花鲈脾脏中的 NK-lysin、IgD、IgM 相对表达量呈现先升高后下降的趋势;两个试验组花鲈鳃组织中的 NK-lysin、LZM 和 IgD 基因的相对表达量随投喂时间的延长不断增加,8 g/kg 试验组 IgM 基因的相对表达量也呈持续上升的变化趋势;与脾脏和鳃组织相比,头肾中免疫相关基因的相对表达量变化较小,其中,两个试验组头肾组织 LZM 和NK-lysin 相对表993第 3 期胡建美,等:短期投喂石榴皮水提物对花鲈防控杀鱼爱德华氏菌感染的作用标有不同字母者表示同一时间点不同组间有显著性差异(P0.05),下同。The means with different letters within the same time point are significantly different between different groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter within the same time point are not significantly different,et sequentia.图 1 石榴皮水提物拌饲投喂后花鲈血清生理生化指标和相关酶活力的变化Fig.1 Changes of serum physiological and biochemical indices and related enzyme activity after feeding Lateolabrax mac-ulatus with Punica granatum L.water extract达量变化在 0.8 以内,而 IgM 和 IgD 基因的相对表达量在 5 d 时达到峰值。2.4 石榴皮水提物对花鲈浸泡攻毒杀鱼爱德华氏菌累积死亡率的影响从图 3 可见:投喂石榴皮水提物 3 d 后的试验组花鲈,在浸泡攻毒后死亡率较空白对照组略有降低(P0.05),但投喂石榴皮水提物 5 d 后,两个试验组花鲈累积死亡率降低至 50%左右,且不同添加剂量的试验组间无显著性差异(P0.05);石榴皮水提物持续投喂 7 d 后,4、8 g/kg 试验组的累积死亡率分别为 70%和 90%,明显低于对照组的004大连海洋大学学报 第 38 卷标有不同字母者表示组间有显著性差异(P0.05)。The means with different lettersare significantly different in the groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter are not signifi-cant differences.图 2 花鲈脾脏、鳃和头肾中免疫相关基因的相对表达量Fig.2 Relative expression of immune-related genes in the spleen,gill and head kidney of Lateolabrax maculatus100%。综上所述,投喂石榴皮水提物 5 d 后,花鲈浸泡感染后的存活率显著提高,表明石榴皮水提物具有较好的免疫力增强效果,其中,4、8 g/kg试验组的相对保护率分别为 50%和 47%。通过对患病花鲈病原菌的分离鉴定,证实其死亡由杀鱼爱德华氏菌导致。3 讨论3.1 石榴皮水提物对花鲈血清非特异性免疫指标的影响鱼体血液各项生理生化指标受环境压力、病害及食物等影响而发生改变14。本研究中,投喂石榴皮水提物的试验组花鲈血清中谷丙转氨酶、谷草104第 3 期胡建美,等:短期投喂石榴皮水提物对花鲈防控杀鱼爱德华氏菌感染的作用图 3 花鲈摄食含石榴皮水提物的饲料 3、5、7 d 后感染杀鱼爱德华氏菌的累积死亡率Fig.3Cumulative mortality of Lateolabrax maculatus infected with Edwardsiella piscicida after feeding diets containing water extract of pomegranate peel for 3,5 and 7 d转氨酶、乳酸脱氢酶、总蛋白和高密度脂蛋白含量总体上显著高于对照组,分析可能是由于石榴皮水提物中某些成分增加了肝脏代谢负荷,造成了花鲈肝功能障碍。与本研究结果不同,佟延南等15发现,在罗非鱼饲料中添加 5%板蓝根复方制剂投喂28 d 后,血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶均显著低于对照组;龚席磊等16研究发现,适量刺五加(Acanthopanax senticosus)水提物作为一种绿色饲料添加剂应用在罗非鱼日常养殖中,试验组鱼血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量与对照组无显著差异,但是血清中脂质代谢吸收能力和肝脏的免疫功能却得到改善。与本研究结果类似,在饲料中添加复方中草药后,史氏鲟幼鱼(Acipenser schrenscki)血清中高密度脂蛋白含量显著高于对照组17。类似地,宿斌等18发现,饲料中添加黄芪(Radix scutellaria)、白术(Atractylodes macrocephala)、防风(Saposhnikovia divaricata)配比制成复方中草药后,哲罗鱼(Hucho taimen)血清中乳酸脱氢酶含量显著升高;饲料中添加葛根(Radix puerariae)、甘草(Radix giycyrrhizae)等配比制成复方中草药后,哲罗鱼血清中总蛋白含量显著提高。综上所述,血清生理生化参数可作为机体健康参考指标之一,但不能以它为唯一标准,由于不同的试验条件下血清生理生化参数结果差异较大,故应当结合其他指标进行统筹分析。碱性磷酸酶作为一种代谢调控酶,参与代谢营养物质的吸收和利用,与动物的生长性能关系密切,同时也参与了生物体内解毒体系构成,具有促进机体免疫力的作用。本研究结果表明,投喂添加石榴皮水提物的饲料,可显著提高花鲈血清中碱性磷酸酶活性。与本研究结果类似,张永政19研究发现,罗非鱼投喂添加黄柏(Phellodendron amu-rense)的饲料后,鱼体血清中碱性磷酸酶活性随时间延长逐渐增加。此外,王赛赛等20发现,在产卵前,大口黑鲈(Micropterus salmoides)雌鱼肝脏中碱性磷酸酶活性随饲料中复合益生菌添加量的增加逐渐增强,机体的防御和免疫功能得到增强,从而提高了子代的成活率。由此推测,花鲈摄入混合有石榴皮水提物的饲料后,机体碱性磷酸酶活性升高,从而增强了鱼体的非特异性免疫能力。以上结果表明,在饲料中添加适量的中草药制剂可提高机体的非特异性免疫酶活,从而增强机体的防御能力和免疫功能,减少养殖中病害的发生。3.2 石榴皮水提物对花鲈组织免疫相关基因的影响NK-lysin 是一种抗菌肽,具有广谱杀菌活性,主要由 T 淋巴细胞和自然杀伤细胞合成。免疫球蛋白是体液免疫中 B 细胞的主要产物,在中和抗原和清除病原中具有重要意义。溶菌酶由非特异性免疫系统中的细胞产生,具有杀菌作用,可水解细菌胞壁上的糖苷键,溶解破裂细菌达到杀菌效果。鳃是鱼类重要的外周黏膜免疫器官之一,鳃中已经发现含有多种天然免疫分子,鳃在抵御病原微生物侵染过程中发挥了重要的免疫屏障作用21。本研究中,4、8 g/kg 试验组花鲈脾脏和鳃组织中的免疫相关基因(NK-lysin、IgD、IgM 和 LZM)显著上调,这与王洪光等22的研究结果相类似。204大连海洋大学学报 第 38 卷此外,有研究发现,用发酵艾草-构树叶复合物饲料长时间投喂鲤(Cyprinus carpio),可显著提高其免疫相关基因(IL-10、LZM、C3、TNF-和 IL-6)表达量23。类似地,陈建军等24发现,发酵艾草-构树叶混合饲料组脾脏中 IL-10 的相对表达量显著高于未添加的对照组。综上所述,中草药作为饲料添加剂应用在水产养殖中,可有效上调机体组织中免疫相关基因的相对表达量。本研究中,花鲈鳃中的免疫相关基因相对表达量在石榴皮水提物拌饲投喂后显著升高,推测可能是由于石榴皮水提物中的有效活性成分通过消化道消化吸收后,经血液传播和物质交换进入鳃组织及细胞,之后作用于细胞,调节细胞内免疫相关机制,进而成功促进了免疫相关基因的高效表达。然而,中草药作为添加剂是如何影响鳃黏膜免疫分子调控网络,或影响其他各免疫器官的抗病机制,进而全局调控机体的免疫功能尚待进一步研究。3.3 石榴皮水提物对杀鱼爱德华氏菌浸泡攻毒花鲈累积死亡率的影响鱼类投喂中草药添加剂后,在病原菌侵袭过程中能否成功存活,将成为最直接且有效的评判标准。本研究中,利用石榴皮水提物混合饲料短期投喂的花鲈,通过杀鱼爱德华氏菌浸泡攻毒后,花鲈的累积死亡率均有所下降,其中以投喂 5 d 的保护效果最佳,相对保护率可达到 50%,说明石榴皮水提物在提高机体免疫力并辅助鱼体抵抗杀鱼爱德华氏菌侵染中发挥了一定作用。然而,在攻毒试验过程中还发现,石榴皮水提物的投喂时间与保护效果并不呈正相关。本研究表明,虽然一定浓度的石榴皮水提物可以提高机体免疫力,减少花鲈在细菌浸泡攻毒后的死亡率,但是鱼体内药物含量难以达到杀菌浓度,投喂石榴皮水提物后机体仍可能感染杀鱼爱德华氏菌,甚至死亡。预示对花鲈爱德华氏菌病的防治应以预防用药为主,可以通过中草药的免疫增强作用减少养殖过程中的病害发生,降低死亡率。与本研究结果类似,投喂添加钩吻总碱的团头鲂经嗜水气单胞菌攻毒后,其存活率显著提高25;投喂添加黄柏饲料的罗非鱼经无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)攻毒感染后其死亡率低于对照组19。饲料中添加不同水平的单方中草药,可不同程度地提高点带石斑鱼(Epinephelus co-ioides)黏液的抗菌活力,4 周后用迟缓爱德华氏菌攻毒,试验组死亡率均低于无添加的空白对照组,其中 20 g/kg 金银花(Lonicera japonica)组免疫保护率高达 90%26。此外,中草药除了对鱼类的细菌性病害防控具有良好效果,在病毒和寄生虫疾病中也有其独特作用。陈小龙27通过转录组学技术分析发现,用番石榴叶(Psidium guajava)水提物药浴拟穴青蟹(Scylla paramamosain)后,可通过调控体内免疫信号识别、转导及免疫效应的基因表达,提高其非特异性免疫功能,并增强拟穴青蟹的抗病毒能力。李超等28研究发现,投喂添加复方中草药制剂饲料的草鱼(Ctenopharyngodon idella),其吞噬细胞活力、血清溶菌活力和血清抗菌活力等均显著升高,草鱼对多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)及嗜水气单胞菌的抗感染能力均得到提升。但关于石榴皮中草药的合理搭配、正确剂量使用和安全性能验证还待进一步研究。4 结论1)添加石榴皮水提物短期内拌饲投喂花鲈,可有效改善鱼体的部分非特异性免疫指标并提高组织中免疫相关基因的相对表达量,表明石榴皮水提液作为一种饲料添加剂可有效增强鱼体免疫力。2)与未添加的空白对照组相比较,用石榴皮水提物混合饲料投喂花鲈能够显著提高鱼体感染杀鱼爱德华氏菌后的存活率,改善鱼体的抗病能力,揭示了石榴皮可作为防控花鲈杀鱼爱德华氏菌病的候选中草药。参考文献:1 温海深,李昀,张美昭,等.花鲈:家喻户晓的中国海鲈J.中国水产,2020(8):110-111.WEN H S,LI Y,ZHANG M Z,et al.The well-known Chinese sea bass,Lateolabrax maculatusJ.China Fisheries,2020(8):110-111.(in Chinese)2 农业农村部渔业渔政管理局,全国水产技术推广总站,中国水产学会.2022 中国渔业统计年鉴M.北京:中国农业出版社,2022.Fisheries and Fisheries Administration Bureau of Ministry of Agri-culture and Rural Affairs,National Fisheries Technology Extension Center,China Society of Fisheries.China Fisheries Statistical Year-book 2022M.Beijing:China Agriculture Press,2022.(in Chi-nese)3 毛灿.珠海养殖花鲈流行病学及细菌生态调查D.上海:上海海洋大学,2020.MAO C.Epidemiological and bacterial ecological investigation of cultured Lateolabrax maculatus in Zhuhai,ChinaD.Shanghai:Shanghai Ocean University,2020.(in Chinese)4 WANG B,MAO C,FENG J,et al.A first report of Aeromonas vero-nii infection of the sea bass,Lateolabrax maculatus in ChinaJ.Frontiers in Veterinary Science,2020,7:600587.304第 3 期胡建美,等:短期投喂石榴皮水提物对花鲈防控杀鱼爱德华氏菌感染的作用5 HU J M,WANG B,FENG J,et al.Edwardsiella piscicida,a patho-genic bacterium newly detected in spotted sea bass Lateolabrax maculatus in ChinaJ.Aquaculture Reports,2022,22:100973.6 PU H Y,LI X Y,DU Q B,et al.Research progress in the applica-tion of Chinese herbal medicines in aquaculture:a reviewJ.En-gineering,2017,3(5):336-350.7 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部M.北京:中国医药科技出版社,2020.Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China-Volume M.Beijing:China Medical Science Press,2020.(in Chinese)8 张召兴,史秋梅,吴同垒,等.单味中草药对罗非鱼维氏气单胞菌的体外抑菌试验J.黑龙江畜牧兽医,2017(2):147-149.ZHANG Z X,SHI Q M,WU T L,et al.In vitro antibacterial test of single Chinese herbal medicine on Aeromonas veronii in tilapiaJ.Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine,2017(2):147-149.(in Chinese)9 马玉和,王庆奎,郭永军,等.5 种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌抑菌效果的比较J.饲料工业,2014,35(16):51-54.MA Y H,WANG Q K,GUO Y J,et al.The comparison of inhibi-tion effect between Edwardsiella tarda and Aeromonas hydrophila in five Chinese herbalsJ.Feed Industry,2014,35(16):51-54.(in Chinese)10 柯文杰,覃华斌,陈言峰,等.25 种中草药对普通变形杆菌的体外抑菌试验J.水产科技情报,2019,46(6):328-331.KE W J,QIN H B,CHEN Y F,et al.Antibacterial effects of 25 kinds of Chinese herbal medicines on Proteus vulgaris in vitroJ.Fisheries Science&Technology Information,2019,46(6):328-331.(in Chinese)11 胡建美,王宝屯,冯娟,等.60 种中草药及其复方对杀鱼爱德华氏菌的体外抑菌效果J.甘肃农业大学学报,2022,57(2):27-35.HU J M,WANG B T,FENG J,et al.In vitro bacteriostatic effect of 60 Chinese herbal medicines and their compounds on Edwardsiel-la piscicidaJ.Journal of Gansu Agriculture University,2022,57(2):27-35.(in Chinese)12 莫小政.饲料中添加中草药对罗非鱼免疫性能的影响J.水产养殖,2021,42(6):11-13.MO X Z.Effect of traditional Chinese medicine on immune func-tion of tilapiaJ.Journal of Aquaculture,2021,42(6):11-13.(in Chinese)13 WANG H,WEN H,LI Y,et al.Evaluation of potential reference genes for quantitative RT-PCR analysis in spotted sea bass(Late-olabrax maculatus)under normal and salinity stress conditionsJ.PeerJ,2018,6:e5631.14 KIM J H,KANG J C.Changes in hematological parameters,plas-ma cortisol,and acetylcholinesterase of juvenile rockfish,Sebastes schlegelii supplemented with the dietary ascorbic acidJ.Aqua-culture Reports,2016,4:80-85.15 佟延南,肖蕊,郭忠宝,等.饲料中添加板蓝根复方对吉富罗非鱼生长性能及抗病力的影响J.江苏农业科学,2022,50(21):181-186.TONG Y N,XIAO R,GUO Z B,et al.Effects of Radix isatidis compound on growth performance and disease resistance of Gifu TilapiaJ.Jiangsu Agricultural Sciences,2022,50(21):181-186.(in Chinese)16 龚席磊.饲料中添加刺五加水提物对吉富罗非鱼生长性能、生理生化及抗氧化能力的影响D.南京:南京农业大学,2020.GONG X L.Effects of dietary aqueous extract of Acanthopanax senticosus applementation on growth performance,physiology bio-chemistry and antioxidant capacity in genetically improved farmed tilapia(Oreochromis niloticus)D.Nanjing:Nanjing Agricultur-al University,2020.(in Chinese)17 张盈娇,夏陈,曾晓丹,等.饲料中添加复方中草药对史氏鲟肝脏保护作用的研究J.饲料工业,2011,32(12):12-14.ZHANG Y J,XIA C,ZENG X D,et al.Study on the protective effect of compound Chinese herbal medicine added to feed on the liver of Acipenser schrenckiiJ.Feed Industry,2011,32(12):12-14.(in Chinese)18 宿斌,刘红柏.饲料中添加复方中草药对哲罗鱼生长、存活及部分生化指标的影响J.水产学杂志,2013,26(02):35-39.SU B,LIU H B.Effects of Chinese herbal medicine on growth,survival and biochemical indices in Taimen Hucho taimenJ.Chinese Journal of Fisheries,2013,26(2):35-39.(in Chinese)19 张永政.黄柏对罗非鱼生长性能、非特异性免疫及抗无乳链球菌感染能力的研究D.海口:海南大学,2017.ZHANG Y Z.Immunostimulatory effects of artificial feed supple-mented with Phellodendron amurense Rupr.on tilapia(GIFT Ore-oc