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实 验 技 术 与 管 理 第 40 卷 第 6 期 2023 年 6 月 Experimental Technology and Management Vol.40 No.6 Jun.2023 收稿日期:2022-12-29 基金项目:国家自然科学基金项目（52176110）作者简介:程红（1976），女，湖北天门，硕士，高级工程师，长期从事光谱仪器分析，。通信作者:曾艳（1973），女，北京，学士，处长，主要研究方向为高校实验室安全管理、高校检验检测机构管理，。引文格式:程红，严定策，宋武林，等.“-螺旋主导蛋白质的圆二色光谱测定”实验室间比对项目统计结果分析：基于经典统计法J.实验技术与管理,2023,40(6):1-5.Cite this article:CHENG H,YAN D C,SONG W L,et al.Statistic result analysis of inter laboratory comparison in“measurement of a helical predominate protein by circular dichroism spectroscopy”:Based on classical statistic methodsJ.Experimental Technology and Management,2023,40(6):1-5.(in Chinese)ISSN 1002-4956 CN11-2034/T DOI:10.16791/ki.sjg.2023.06.001 特约专栏实验室间比对方法应用 编者按：由于不同实验室在测量仪器、条件、方法、操作等方面的差异性，导致了实验结果的不可比性，为了有效验证和比对实验数据，并建立统一的标准，实验室间比对分析就显得尤为重要。本期专栏特别推出华中科技大学和中国科学技术大学经验，通过圆二色光谱测定和热分析实验介绍了实验室间比对方法的应用，以期为实验室发展提供参考。“-螺旋主导蛋白质的圆二色光谱测定”实验室间比对项目统计结果分析 基于经典统计法 程 红1，严定策1，宋武林1，孔 翦2，曾 艳2（1.华中科技大学 分析测试中心，湖北 武汉 430074；2.教育部高等学校科学研究发展中心，北京 100080）摘 要：圆二色（CD）光谱是一种广泛使用的测量蛋白质结构和构象变化的方法，可以提供除其他生物物理、化学和结构生物学技术以外的辅助结构信息。为了评价各实验室间 CD 测量结果的准确性，实施了 2022 年度高校实验室间比对项目“-螺旋主导蛋白质的圆二色光谱测定”，项目以一种-螺旋为主导的蛋白质（细胞色素 C）在波长 222 nm 处的圆二色值作为考核参数，共有来自12 个国内高校测试平台和科研院所的实验室参加了此次比对活动。通过基于经典统计法对比对数据的统计分析，表明各参加实验室测量结果偏差均在可接受范围之内，有效验证了不同实验室间进行 CD 光谱测量的可比性和可靠性。关键词：-螺旋主导蛋白质；圆二色光谱；实验室间比对；-螺旋；可比性 中图分类号：O657.3 文献标识码：A 文章编号：1002-4956(2023)06-0001-05 Statistic result analysis of inter laboratory comparison in“measurement of-helical predominate protein by circular dichroism spectroscopy”:Based on classical statistic methods CHENG Hong1,YAN Dingce1,SONG Wulin1,KONG Jian2,ZENG Yan2(1.Analytical and Testing Center,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430074,China;2.Center for Scientific Research and Development in Higher Education Institutes,Ministry of Education,Beijing 100080,China)Abstract:Circular dichroism(CD)spectroscopy is a widely-used method for examining the structures and conformational changes of proteins,provides complementary structure information to that obtainable by other 2 实 验 技 术 与 管 理 biophysical,chemical,and structural biology techniques.In order to evaluate the consistency of CD measurement results among laboratories and ensure the accuracy and reliability of the measurement results,in 2022,the inter laboratory comparison project“Measurement of a-helical predominate protein by circular dichroism spectroscopy”is organized.The project is carried out to compare the CD spectral magnitude of cytochrome C,a-helical predominate protein,in wavelength of 222 nm.12 test platforms of domestic university and laboratories of scientific research institutes participated in this comparison.Through the effective implementation of the comparison scheme and the statistical calculation of the comparison data based on classical statistic methods,it is found out that the deviation of the measurement results of each participant laboratory is within the acceptable range,which verifies the comparability and reliability of CD spectrum measurement between different laboratories.Key words:-helical predominate protein;circular dichroism spectroscopy;inter laboratory comparison;-helix;comparability 对于由手性亚基组成的蛋白质等生物分子，其多肽骨架中酰胺和羰基的吸收在被圆偏振光照射时会产生近紫外和远紫外波长范围内的信号。圆二色（circular dichroism，CD）光谱技术利用发色团对左右圆偏振光的不同吸收原理，获得蛋白质构象的结构信息1-2。CD光谱基于远紫外波长区域（约 260170 nm）中电子跃迁的原理辨别蛋白质的二级结构，基于近紫外区域（约300260 nm）来监测芳香族氨基酸残基的局部三级结构环境，是考察蛋白质和多肽等生物分子的物理或化学环境、氨基酸组成（如突变）或分子间相互作用的有力工具3-4。在过去的十年中，已经发表了 24 000多篇使用 CD 光谱联合其他技术如晶体学5、低温电子显微镜6、核磁共振波谱7-8、傅里叶变换红外光谱6,8、振动圆二色光谱9、摩尔动力学模拟10和小角散射11等来共同表征多肽和蛋白质结构的研究论文。由于蛋白质主链肽键中的单线态电子跃迁发生在190 和 222 nm 附近（酰胺生色团 NC=O），因此远紫外区的 CD 光谱更受关注。222 nm 附近的跃迁是由于 O 原子上的孤对电子跃迁到反键轨道（n-*跃迁）所致，190 nm 附近的跃迁是由于非键轨道到反键轨道的跃迁（-*跃迁）引起的。这两种跃迁在蛋白质的手性环境中混合，导致各种蛋白质呈现不同的二级结构光谱。对于以-螺旋为主导的蛋白质，-*跃迁裂分导致其 CD 光谱中出现 190 nm 处的正峰和 208 nm处的负峰，n-*跃迁则表现为谱图中 222 nm 的负峰12-13。在实际应用中，CD 信号强度（即圆二色值）在对蛋白质/多肽（尤其是螺旋特征）的二级结构定性和定量分析中起着关键作用13-14。然而，CD 光谱技术自得到广泛应用以来，一直没有很好地建立测量结果的溯源性。如果测量不可溯源，则在不同实验室、不同仪器、不同时间、不同条件下进行的测量就不具有可比性15。因此，十分有必要对国内的圆二色光谱用户尤其是提供测试服务的仪器平台如分析测试中心开展此类项目的实验室间比对，最终在测量机构和更广泛的用户群体中逐步实现可比的 CD 测量。国际上，国际计量委员会物质量咨询委员会（CCQM）多次开展 CD 光谱仪测试的比对活动，其中在 2010 年编号为CCQM-P59 的国际比对项目“圆二色光谱仪测定蛋白质结构”中16，发现 CD 光谱实验室间数据缺乏可比性，但是认为变量因素与样品相关，可以使用更加详细的作业指导书来避免。我国之前还没有机构组织过关于 CD 光谱仪的实验室间比对活动。2022 年，在组织专家系统论证比对方案后，由教育部高等学校科学研究发展中心、国家计量认证高校评审组组织，华中科技大学分析测试中心承担并负责实施了 2022 年度高校实验室间比对项目“-螺旋主导蛋白质的圆二色光谱测定”。本项目根据 GB/T 270432012合格评定能力验证的通用要求和 JY/T 05722020 圆二色光谱分析方法通则 设计比对方案和制定作业指导书，以一种-螺旋主导蛋白样品细胞色素 C 为样品，要求参加比对的实验室使用作业指导书中的方法和参数检测该蛋白 222 nm 特征谱带处的圆二色值数据（）。此项比对活动不同于历年国际比对的项目，为首次使用圆二色光谱仪测试圆二色值的比对。一般情况下，实验中的 值和 CD 吸光度的差值（A）不在实验室之间或实验室内进行比较，但在前期蛋白质的圆二色光谱测量中圆二色值不确定度评估的基础上，考虑所用比色皿的光程长度、仪器的校准状态和溶液的浓度，得以顺利开展此项实验室间比对活动，并通过本次比对活动了解高校实验室进行圆二色光谱测试的相关技术能力，为圆二色光谱仪测试的可比性和可靠性评估提供参考。1 实验部分 1.1 比对方案 截至 2020 年的不完全统计，我国现有圆二色光谱仪的主流厂商有两家：日本 JASCO 公司，英国应用光物理（Applied Photophysics,APP）公司，两家各种不同仪器型号共计约 200 台圆二色光谱仪为高校和科研院所持有。考虑到仪器类型的差异及可能对测试结果有重大影响的因素，对于参加本项目的实验室，我们统一随样品一起发放了用于校准仪器的标准样品，在进 程 红，等：“-螺旋主导蛋白质的圆二色光谱测定”实验室间比对项目统计结果分析基于经典统计法 3 行样品测试前，先使用标准样品校准仪器，然后测试样品，再对其结果进行统计分析。本次实验室间比对要求参加比对的实验室（以下简称“参加实验室”）严格按照作业指导书中的相关参数设置和检测程序完成检测。1.2 比对样品的准备 校准样品：d-10-樟脑磺酸铵（ACS），购自日本Jasco 公司，部件号：0730-0358，纯度 99%；比对样品：-螺旋主导蛋白（细胞色素 C），GBW(E)100153，由中国计量科学研究院研制，购自中国国家标准物质资源共享平台，棕色玻璃瓶装。蛋白样品使用原包装，校准样品使用离心管包装好后，用20 冰袋冷却，快运给参试单位。比对的蛋白样品和校准样品均标识为盲样，使用数字对其进行编号，分别标记为 1 号和 0 号。承担方按照 CNAS-GL003：2018能力验证样品均匀性和稳定性评价指南对蛋白样品进行了圆二色值的均匀性和稳定性检验。圆二色值均匀性检验采用单因子方差分析，稳定性检验采用 t 检验法，结果均符合要求，表明样品的圆二色值是均匀和稳定的。1.3 检测方法 1.3.1 溶液的配制 参加实验室收到样品后，先将提供的标准品 ACS精确称重，然后使用超纯水溶解并稀释至 0.6 mg/mL；将细胞色素 C 使用超纯水溶解并稀释至 0.05 mg/mL的溶液。将配制好的样品溶液放置在冰箱（4）中。在进行 CD 测量之前，让溶液在此温度下平衡至少一整夜。1.3.2 仪器校准 从冰箱中取出 ACS 溶液，在室温（232）下平衡 1 h，并在进行 CD 测量之前将样品装入 10 mm 的石英比色皿内，根据表 1 中校准样品的测试参数测量样品的 CD 光谱。表 1 校准样品和蛋白样品的测试参数 参数设置 校准样品 蛋白样品 扫描范围/nm 200400 190260 累积次数/次 1 6 响应时间/s 1 1 带宽/nm 1 1 灵敏度/mdeg Standard(100)Standard(100)步长/nm 1 1 扫描速度/(nmmin1)50 50 根据 ACS 溶液的出峰情况调整仪器，使 291nm 附近谱峰的圆二色值为(190.41)mdeg。记录 3 个重复光谱。1.3.3 蛋白样品溶液的测试 在完成仪器校准当天，将细胞色素 C 样品溶液从冰箱中取出，在室温（232）下平衡 1 h。在进行CD 测量之前，先测试溶剂空白超纯水在光程长为 1 mm的石英比色皿的 CD 光谱图，然后将样品装入同一个比色皿内进行 CD 测量，测试中保持样品测试与空白测试时比色皿的方向一致。根据表 1 中蛋白样品的测试参数测量蛋白样品的远紫外 CD 光谱。记录样品的3 个重复光谱（连续测定，对同一样品连续重复测量）。1.4 测试结果 得到的 CD 谱图经过扣减溶剂空白和平滑处理后，报告谱图中 222 nm 附近的圆二色值，单位用 mdeg表示，数据精确到小数点后一位。2 比对结果统计 2.1 评价方法 CNAS-GL002：2018能力验证结果的统计处理和能力评价指南指出，由能力验证计划参加者的结果确定指定值和能力评定标准差，是检测能力验证计划常用的方法。通常，用格拉布斯（Grubbs）准则等统计方法剔除异常值后若样本数 p12，可以采用经典统计方法，计算平均值和标准差，以平均值和标准差作为指定值和能力评定标准差。对该检测项目将计算下列总体统计量：结果总数、平均值、标准差、极小值（Minimum）、极大值（Maximum）和变动范围（Range）；根据实验室的测定结果，对每个实验室给出其样品的 Z 比分数并根据样品的 Z 比分数评价每个参加实验室的检测能力。2.2 评价准则 本次高校实验室间比对活动对实验室的测定结果中有关统计量的含义规定如下：（1）结果总数：在统计分析中某项测定结果的总数。（2）平均值：各数据之和除以数据总点数。（3）标准差：21()(1)niixxSn其中，x代表所采用的样本 x1,x2,，xn的平均值。（4）变动范围为一组结果中的极大值减极小值。（5）实验室的 Z 比分数为 Z结果-指定值能力评定标准差 采用经典统计方法，分别以平均值和标准差作为指定值和能力评定标准差。本次高校实验室间比对活动以 Z 比分数评价每个参加实验室的能力：|Z|2 为满意结果。2|Z|3 为有问题结果（可疑值）。|Z|3 为不满意结果（异常值）。4 实 验 技 术 与 管 理 不满意结果为统计分析中的异常值，存有问题的结果为统计分析中的可疑值。参加比对活动的高校实验室样品的初测 Z 比分数（|Z|）2 将进行一次样品补测。2.3 比对结果 对参与本次比对的实验数据进行格拉布斯检验，无异常值。参加本次实验室间比对的实验室为 12 家，满足样本要求，使用参加者结果平均值作为指定值，用参加者结果统计得到的标准差作为能力评定标准差，最后计算出 Z 比分数对比对结果进行统计比对。根据参加实验室报告的结果，对所有数据进行统计处理，相关结果见表 2。表 2 蛋白样品的最终测试结果及统计处理 序号 实验室代码 仪器公司 测试结果/mdeg Z 比分数1 2 3 平均值1 LAB02 JASCO 4.3 4.3 4.3 4.30.192 LAB13 JASCO 4.7 4.5 4.5 4.61.393 LAB19 APP 4.3 4.3 4.3 4.30.194 LAB27 JASCO 4.2 4.3 4.3 4.30.045 LAB32 APP 4.0 4.0 4.1 4.01.016 LAB33 APP 4.4 4.4 4.5 4.40.797 LAB37 APP 4.6 4.5 4.4 4.51.098 LAB39 APP 4.4 4.4 4.5 4.40.799 LAB42 JASCO 4.1 4.1 4.1 4.10.7110 LAB43 JASCO 3.9 4.1 4.1 4.01.0111 LAB46 JASCO 4.3 4.3 4.3 4.30.1912 LAB47 JASCO 4.0 3.8 3.7 3.81.91 从表 2 中 12 个测试结果得出本次实验室间比对蛋白样品的圆二色值平均值为4.3 mdeg，标准差为0.2 mdeg。其中最小值为4.6 mdeg，最大值为3.8 mdeg，极差为 0.8 mdeg。从最终所得结果的 Z 比分数统计分析可以看出，本次比对无异常值，所有参加实验室均取得了满意结果。图 1 为所有结果的 Z 比分数直方图。图 1 蛋白样品最终测试结果的 Z 比分数直方图 3 比对结果分析及建议 3.1 比对结果分析 圆二色光谱仪本身具有一定的专业特点，是一个小众的仪器机种。此次为首次组织开展该类项目的实验室间比对。本次实验室间比对活动共有 12 家实验室参加（仪器台数为 12 台），其中 7 家为高校中的资质认定实验室，其他 5 家分别为科研院所和省属资质认定单位。受新冠疫情影响有一部分资质认定的实验室未能参加此次比对。参加实验室的地域分布及资质认定情况见表 3。参加实验室仪器型号涵盖了国外两家主流圆二色光谱仪厂商生产的 5 个不同型号仪器，具体型号为：日本 JASCO 公司 J-810 型（3 台）、J-815型（3 台）、J-1700 型（1 台），英国 Applied Photophysics公司 Chirascan（4 台）、ChirascanPlus（1 台）。本次比对中，所有参加实验室均能按照比对计划时间及时开展实验，技术人员的检测水平和数据处理能力均符合要求。通过此次比对活动，进一步提升了高校检验检测机构的检测能力和水平，确保了实验室 CD 光谱分析测试结果的准确性。表 3 参加实验室地域分布及资质认定情况 地域 参加实验室个数 具有资质认定实验室个数北京 3 1 江苏 3 3 湖北 1 1 广东 3 1 重庆 1 1 天津 1 0 合计 12 7 本次比对项目主要考察圆二色光谱测试中纵坐标的强度，该值与所用比色皿的光程长度、仪器的校准状态和溶液的浓度等相关因素高度相关。圆二色测试所用比色皿应尽量使用高品质的比色皿，方形或圆形均可。本次比对统一发放校准样品右旋樟脑磺酸铵，参加实验室自行配置 0.6 mg/mL（即 0.06%）的溶液，调校仪器。根据参加实验室反映，有一些实验室不能自行校准，需要委托供货服务商提供校准服务。在疫情封控的情况下，服务商不能及时赶到现场，导致部分实验室的校准样品数据偏差较大。校准样品和蛋白样品溶液在配置过程中，应使用检定合格的天平进行称重，使用检定合格的移液器和容量瓶进行液体的移取和稀释，并尽量减少稀释次数，避免测试不确定度过大。如果样品溶液浓度不准确，会直接导致测量得的圆二色值不准确。3.2 问题与建议 此次实验室间比对活动中大部分实验室都能严格按照作业指导书的内容开展试验，但也发现了一些问题，主要包括：（1）未按作业指导书规定的平行测试次数（3 次）进行测试。（2）未按作业指导书要求在原始记录中提供校准样品的谱图。程 红，等：“-螺旋主导蛋白质的圆二色光谱测定”实验室间比对项目统计结果分析基于经典统计法 5（3）谱图标识不明确。（4）有两家实验室报告了明显偏离的测定值，经过沟通后及时改正重新报告了正确的 CD 值。针对本次比对活动发现的问题，提出以下几点建议：（1）应注重对作业指导书的理解和掌握，特别是测试过程中的一些细节问题，建议在有条件的情况下，参加高水平的标准宣贯等培训。（2）加强检测原始记录和检测报告的审核工作，避免原始记录不“原始”，检测报告不规范的问题。（3）在书写纵坐标的值时，应明确负峰即为负值，正峰即为正值，避免发生混淆。（4）加强对仪器校准状态的监管，避免工作中出现校准过期对外出具报告的情况。通过本次比对活动，发现一定范围内 CD 数据具有可比性，比对结果一定程度上说明该种仪器提供数据的可靠性。希望以后有更多的实验室来参与到实验室间比对的活动，以使比对结果更具说服力和普适性。4 结语 半个世纪以来，CD 光谱在结构生物学中得到了广泛应用，主要用于研究蛋白质在溶液中的二级结构、折叠和相互作用。为促进高校实验室相关分析测试水平的提升，华中科技大学分析测试中心作为承担单位实施了 2022 年高校实验室间比对项目“-螺旋主导蛋白质的圆二色光谱测定”。国内 12 家实验室参与本次计量比对，基于经典统计法对比对结果进行统计分析可知，12 家参加实验室的比对结果均为满意，但部分参加实验室在对作业指导书的理解、溶液的配制、原始记录、结果的报告等方面存在一些问题。通过对以上问题的分析，使各参加实验室在 CD 光谱测试方面的技术水平有所提高，确保了 CD 光谱测试量值传递准确、可靠。本项目在高校实验室间首次开展，可以给类似比对活动的开展提供经验和参考，CD 光谱的实验室间比对活动不仅限于蛋白质这些常规项目的检测，还可以开展手性化学药物以及各种类型的蛋白质二级结构等更多的测试项目。通过实验室间比对活动既能体现仪器检测的可靠性，又能反映实验人员的测试水平，同时对进一步加强高校资质认定实验室能力建设，促进实验室规范化管理，强化高校实验室出具证明性数据的可靠性和规范性提供有力支持。参考文献(References)1 程红，严定策，武利庆，等.圆二色光谱在药物分析中的应用J.药物分析杂志，2021,41(4):559571.2 RAVI J,RAKOWSKA P D,GARFAGNINI T,et al.International comparability in spectroscopic measurements of protein structure by circular 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