草鱼生长性状相关微卫星标记的初步筛选.pdf

收稿日期:.基金项目:国家自然科学基金资助项目().作者简介:顾剑峰(),男,硕士生.通信作者:毛慧玲(),女,教授.E m a i l:h u i l i n m c o m.顾剑峰,吴初新,王隽隽,等草鱼生长性状相关微卫星标记的初步筛选J南昌大学学报(理科版),():GUJF,WUCX,WAN GJ J,e t a l S c r e e n i n ga n da n a l y s i s o fm i c r o s a t e l l i t eD NAm a r k e r s a s s o c i a t e dw i t hg r o w t h t r a i t s o fG r a s sc a r p(C t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s)JJ o u r n a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c e),():草鱼生长性状相关微卫星标记的初步筛选顾剑峰a,吴初新b,王隽隽a,龚瑞玥a,胡成钰a,毛慧玲a(a 南昌大学生命科学学院,江西 南昌 ;b 豫章师范学院,江西 南昌 )摘要:以 尾草鱼为样本,利用微卫星分子标记技术初步筛选出与生长性状相关的分子标记.K S和QQ图分析显示草鱼体长、体高和体重个主要生长性状均为正态分布.利用S P S S 分析不同基因对草鱼生长性状的影响,共获得 个基因型;同时发现D基因对草鱼生长性状具有负调控作用,而B、C基因对D基因有抑制作用.微卫星标记与草鱼个主要生长性状关联分析显示,对引物HL J C 、HL J C 、C 、HL J C 均与草鱼不同生长性状相关联,其中,HL J C 与体长极显著相关,与体高、体重显著相关;HL J C 与体长、体重显著相关;HL J C 与体长、体高极显著相关;C 仅与体重显著相关.关键词:草鱼;微卫星;分子标记;生长性状中图分类号:S 文献标志码:A文章编号:()S c r e e n i n ga n da n a l y s i so fm i c r o s a t e l l i t eD N Am a r k e r sa s s o c i a t e dw i t hg r o w t ht r a i t so fG r a s s c a r p(C t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s)GUJ i a n f e n ga,WUC h u x i nb,WANGJ u n j u na,GONGR u i y u ea,HUC h e n g y ua,MAO H u i l i n ga(a S c h o o l o fL i f eS c i e n c e s,N a n c h a n gU n i v e r s i t y,N a n c h a n g ,C h i n a;b Y u z h a n gN o r m a lU n i v e r s i t y,N a n c h a n gU n i v e r s i t y,N a n c h a n g ,C h i n a)A b s t r a c t:I nt h i sp a p e r,f i s hw e r eu s e da s s a m p l e s t os c r e e n t h em i c r o s a t e l l i t em o l e c u l a rm a r k e r s r e l a t e dt ot h eg r o w t ht r a i t so fG r a s sc a r p T h er e s u l t so f t h eK Sa n a l y s i sa n dt h eQQ m a ps h o w e dt h a t t h eg r o w t ht r a i t so f t h eb o d yl e n g t h,t h eb o d yh e i g h t,a n dt h eb o d yw e i g h ta r ei nan o r m a ld i s t r i b u t i o n T h ee f f e c to f t h em i c r o s a t e l l i t em a r k e r so nt h eg r o w t ht r a i t sw a s a n a l y z e db yS P S S a n d g e n o t y p e sw e r eo b t a i n e d A l s o,i tw a sf o u n dt h a tt h eDg e n eh a dn e g a t i v er e g u l a t o r ye f f e c to nt h eg r o w t ho fG r a s sc a r p,w h i l et h eBa n dCg e n e s c o u l ds u p p r e s s t h e e x p r e s s i o no f t h eDg e n e T h e a s s o c i a t i o na n a l y s i s o fm i c r o s a t e l l i t em a r k e r sw i t hg r o w t ht r a i t s s h o w e dt h a t t h ep a i rp r i m e r so fHL J C ,HL J C ,C ,a n dHL J C w e r e r e s p e c t i v e l yr e l a t e d t od i f f e r e n tg r o w t ht r a i t so fG r a s s c a r p Am o n g t h e m,t h eHL J C l o c u sw a s e x t r e m e l yr e l a t e dt ot h eb o d y l e n g t h,t h eb o d yh e i g h t,a n dt h eb o d yw e i g h t T h eHL J C l o c u sw a ss i g n i f i c a n t l yc o r r e l a t e dw i t h t h eb o d y l e n g t ha n d t h eb o d yw e i g h t T h eHL J C l o c u sw a s e x t r e m e l y r e l a t e d t o t h eb o d y l e n g t ha n dt h eb o d yh e i g h t T h eC l o c u sw a so n l yr e l a t e dt ot h eb o d yw e i g h t B a s e do nt h er e s u l t s,i t c a nb eu s e da sc a n d i d a t e l o c i f o ra p p l y i n gt om o l e c u l a rm a r k e r sa s s i s t e db r e e d i n go fG r a s sc a r p K e yW o r d s:G r a s sc a r p;m i c r o s a t e l l i t e;m o l e c u l a rm a r k e r;g r o w t ht r a i t s草鱼(C t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a)是江西省淡水鱼类养殖产量最大的品种.草鱼性成熟较晚,传统的育种方法多是采用从长江捕捞的原种作为养殖亲本,该方式周期长、难度大.相比之下,分子育种第 卷第期 年月南昌大学学报(理科版)J o u r n a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c e)V o l N o J u n 技术在提高育种效率、缩短育种年限、提高产量、增强品质等方面都表现出巨大的应用前景,已广泛应用于作物、家畜及水产动物的育种,.微卫星标记由于其量大、呈中性、共显性以及可检测等位基因多的特点,被认为是研究物种遗传多样性的有效工具,现已广泛应用于连锁图谱分析、基因定位以及性状分析等方面的研究,.鱼类遗传育种中,生长性状是重要经济性状.近些年,与鱼类性状相关的分子标记陆续被发现报道.张义凤()等人从 个微卫星标记中筛选出个与鲤鱼生长性状相关的标记,其中个与体重、体长、体高相关,个与体高相关,并且找到与生长性状相关的基因型.随后,徐美佳()等人利用E S T S S R对鲤鱼的个性状进行单回归分析,最终得到个与鲤鱼吻长、头长、尾长、眼间距有关的分子标记.张丽博()等人利用 个S S R及E S T标记对柏氏鲤进行基因型检测,单标记回归分析共得到 个与饲料转化率相关的标记.在草鱼生长性状方面,丁炜东()等人使用S R A P技术分析野生草鱼和家养草鱼,筛选出与草鱼种质退化相关的分子遗传标记.王解香()分析了 对草鱼E S T S S R分子标记,发现对微卫星引物与草鱼生长性状具有关联性.最近,余成晨()等在前期研究的基础上,对草鱼生长相关的微卫星标记在长江草鱼选育群体的 个个体进行验证分析,确定出各多态性位点的优势基因型.但总体而言,有关与草鱼性状相关的分子标记的研究还是偏少.本研究将少量多态性丰富的微卫星位点排列组合,拟从 对微卫星引物中进行筛选,获得与草鱼体长、体高、体重个主要性状显著相关的标记,并分析其基因型对生长性状的影响效应,获得优势基因型,为草鱼的分子辅助育种提供理论依据.材料与方法实验材料实验用鱼为二龄草鱼,年月取样于江西省瑞昌长江四大家鱼原种场(国家级).实验方法数量性状的测量随机选取 尾草鱼,利用刻度尺(精度为mm)、电子台秤(精度为 g)分别测量和记录草鱼的体长、体高、体重等生长数据.D NA的提取参照刘哲的方法,采用改良T r i s饱和酚氯仿 法,以 草 鱼 鱼 鳞 作 为 材 料 提 取 草 鱼 基 因 组D NA.微卫星引物的筛选筛选实验室自行设计和引自文献 的 对微卫星引物,最终获得扩增效果多态性较好的对引物(上海生工生物工程有限公司)(表),可用于草鱼后续研究.其余引物因扩增产物一致化、多态性不佳被弃除.表对微卫星引物序列及退火温度T a b T h e s e q u e n c e so f s e v e nm i c r o s a t e l l i t ep r i m e r sa n da n n e a l i n g t e m p e r a t u r e序号引物名称引物序列退火温度片段大小/b pH L J C F:G C A A G C T G C A T T C A C T C T G A R:T G G A G A A A A G G G C T G T A G G A H L J C F:G C A A A G C A A A A C A C A G C A A A R:C G A C G A T C T G T C C A T C A G T G H L J C F:C A G A T G A G A G A G G G G G A G G T R:A A C A A G G C T G T T G T C A C T G C H L J C F:T T C T C T G C C C T G T T G T G T T G R:A A A T T G A G G C C C T G A G G A C T H L J C F:T T G A A G A G G G C C A A T G G T T A R:T G C A C G A C A C A A C A T G A A A A H L J C F:A A A T G C C G T C C A G T G A G T C T R:T C A G C C T G C A C A T A A C A A A G A C F:A A A T G C C G T C C A G T G A G A R:G G C A G A G T A G A C C T G T G A A F:正向引物;R:反向引物.P C R扩增利用不同引物和 个草鱼样本基因组D N A进行P C R扩增.P C R反应体系为 l:d d HO l、B u f f e r l、d N T P l、引物各 l、D N A样品 l、T a q U.P C R反应条件:预变性m i n;变性 s,复性 s,延南昌大学学报(理科版)年伸 m i n,共 个循环;彻底延伸 m i n.将P C R产物保存备用,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法显色进行检测、分析.数据处理与分析应用S P S S 软件对草鱼的体长、体高、体重个主要生长参数进行正态分析.利用G E OG E L软件统计样品凝胶上特异区域微卫星条带,分析个体基因型.统计每对引物间特异区域碱基对(b p)数量的最大值及最小值,并以每 个b p为一区,分别赋以A、B、C、D、E、F、G,并进行分区,根据各样品在特异区域b p数大小确定基因型,并统计基因型数量.采用S P S S 软件的一元线性回归模型分析草鱼基因型与其生长性状的关联性,进而获得与草鱼生长性状相关的微卫星位点.结果与分析 草鱼体长、体高、体重分析 草鱼体长、体高、体重分布及假设检验分析 尾草鱼的体长、体高、体重个主要生长性状统计分析,其分布范围及均值见表.同时,利用S P S S 软件对草鱼的体长、体高、体重个生长性状进行K S分析(表),P值越大,表型性状的频率分布偏离正态分布程度越低.假设检验结果显示(表),草鱼的体长、体高、体重的P值均大于 ,表明草鱼个生长性状分布均为正态分布.表 草鱼体长、体高、体重和K S分析T a b B o d y l e n g t h,h e i g h t,w e i g h t o f g r a s sc a r pa n dK Sa n a l y s i s性状最小值最大值均值P值体长/c m 体高/c m 体重/g 草鱼体长、体高、体重Q Q图分析为了进一步证实K S分析的结果,利用Q Q图对草鱼的体长、体高、体重个主要生长性状进行分析,结果如图,各散点均围绕在直线周围,呈正态分布,结果与K S分析一致.3210-1-2-325201510530观测值3210-1-2-365437观测值21420-23002001005400观测值体长/c m体高/c m体重/g图 草鱼生长性状Q Q图F i g Q Qc h a r t s o f g r o w t h t r a i t s o f g r a s s c a r p 草鱼微卫星引物的筛选及其效应以 个草鱼样本基因组D N A为模板,利用不同引物进行P C R扩增.在此,仅以H L J C 引物为例分析扩增效果.利用引物H L J C 扩增草鱼基因组D N A,然后将扩增后的产物电泳、显色.结果显示(图),条带清晰明亮,每个样品在特异片段集中区域均图 引物H L J C P C R扩增结果F i g P C Ra m p l i f i c a t i o nr e s u l t s o fp r i m e rH L J C 第期顾剑峰等:草鱼生长性状相关微卫星标记的初步筛选有 条特异性条带,其特异性条带片段大小介于 b p之间.在特异片段集中区域共获得 条条带,其中强带占到 以上.在 尾草鱼中共有个等位基因.其他对引物扩增效果分析方法与H L J C 相似.草鱼基因型对生长性状的影响效应应用S P S S 软件,分别对草鱼体长、体高、体重等参数构建一元线性模型,分析个微卫星标记对各生长性状参数的影响效应(表).个微卫星标记共建立了 个基因型,出现频数 次,其中频数大于次的有 个基因型.从表可以看出,在AH个基因中,B、C、D是主要影响基因.H L J C 和H L J C 标记的D D基因型的个体在体长、体高、体重个 主 要 性 状 参 数 均 低 于 其 他 基 因 型,以 及H L J C 标记的D D基因型个体的个主要生长性状的参数均低于B B及C C基因型(纯合子)个体,由此推断D基因对个主要生长性状具有负调控的作用;而H L J C 和C 标记的B D基因型的个体测量值却比其他个体的个主要生长参数均要高,推测B基因在某种程度上抑制D基因的表达.H L J C 标记的A C基因型的个体在个主要生长性状上显著高于拥有D D基因型的个体;C 标记的B D基因型的个体在个主要生长性状上显著高于拥有C D基因型的个体,表明C基因抑制D基因表达作用效果不及B基因.由于A基因影响效应不明显,在此不再赘述.其余个标记对草鱼生长性状未见有明显效应.表 个微卫星位点不同基因型生长相关性状之间的比较T a b M u l t i p l e c o m p a r i s o n s o f g r o w t h r e l a t e d t r a i t s i n l o c i位点基因型个体数体长/c m体高/c m体重/gH L J C A C a a aB B a a aC C a a aC D b a bD D a b b a bH L J C B B a a aC C a a aD D a a aE E a a aE G a a aF F a a aG G b a bHH a b b a bC A B a b aB a bB C b a bB D a a aC D a b B a bH L J C B B a a aB D a a aC C a a aD D a a aH L J C C C a a aD D a b bE E a a aB B a a aH L J C C C a a aB C a a aD D b a bH L J C D D a a E E a a aF F a a aG G a a a注:表中的位点为引物名称,个体数为该群体中拥有某种基因型的个体数.同一位点中同列数据的不同小写字母表示差异显著(P );基因型出现频数小于不在此统计中.南昌大学学报(理科版)年 微卫星标记与草鱼体长、体高、体重关联性分析利用最小二乘法对微卫星标记与草鱼体长、体高、体重个主要性状进行关联性统计分析,结果见表所示.筛选出的个微卫星标记中,H L J C 、H L J C 与体长呈极显著相关,H L J C 还与体高呈极显著 相 关;H L J C 与 体 长、体 重 呈 显 著 相 关;H L J C 与体高、体重显著相关;而C 仅与体重呈显著相关.其余个标记与草鱼生长性状关联性不明显.表 微卫星位点与草鱼生长性状的关联性T a b C o r r e l a t i o nb e t w e e nm i c r o s a t e l l i t e l o c ia n dg r o w t h t r a i t s o f g r a s s c a r p位点体长/c m体高/c m体重/gH L J C H L J C H L J C C :显著水平(P ),:极显著水平(P ).讨论现有的研究表明,鱼类分子辅助育种可能是筛选出优良性状的一条捷径,可靠且实用.例如,鲁翠云()以密度较高的镜鲤微卫星遗传图谱为基础,获得与镜鲤体重、体长、体高和体厚等生长性状显著相关的标记,分析其对生长性状的影响.同时,筛选出与建鲤生长性状显著相关的标记及优势基因型,用于指导建鲤的选育,显著地节省了工作量和成本.李胜杰等人()分析了E S T S N P标记与大口黑鲈生长性状关系.结果显示,在体质量、全长和尾柄长的个性状中,C L C o n t i g _A l l 位点的C C基因型的均值都显著高于T T基因型(P );并且在体高、头长中,C C型的均值都比C T和T T型的均值高,但差异未达到显著水平.由此他们认为C基因可作为今后育种重点利用的基因.高进等利用简化基因组测序技术(bR A D)获得大菱鲆育种群体相应基因型数据,通过全基因组关联研究(GW A S)筛选出与大菱鲆生长性状显著关联的数量性状核苷酸(Q T N s)遗传位点,从而探寻用于改良目标性状的分子标记及候选基因.余成晨()等在草鱼选育群体中验证了生长相关的微卫星标记,确定出优势基因型.类似地,我们利用微卫星分子标记技术,初步筛选出与草鱼生长性状相关的分子标记.在本研究中,我们从基因型角度将对微卫星引物与草鱼的体长、体高、体重关联起来发现,不同基因型对于草鱼的生长性状具有不同的影响.从表中,我们发现B、C纯合子基因型显著大于其他基因型,而只含有D基因的显著小于其他基因型,说明B、C两种基因分别对草鱼的生长起到正调控的作用,而D基因起到负调控的作用,其中B、C基因为优势基因.这提示我们在之后的育种中,应尽可能筛选出含有B、C基因的草鱼,以获得更高的经济效益.同样地,若在育种过程中检测含有D基因的样本,则可直接筛选淘汰,以有效地节约育种成本.此外,H L J C 和H L J C 标记与多个生长性状相关联.目前,我们猜测这对引物标记的基因可能具有与控制生长性状的连锁现象,也有可能是因为基因经过剪切产生不同的成熟m R N A最终对草鱼生长性状产生不同影响效果,其机制都有待于进一步深入探讨.由于基因的偶然性,一些基因型只出现 次,并不具有统计分析意义,可忽略不计.张义凤等人()的研究显示,每种基因型至少出现次观察值才会被考虑.袁文成等人()发现,标记C 的C C基因型的样本数最少,只出现次,其余基因型出现次数为次以上,出现次数最大可达 次.王解香()研究草鱼不同地域群体的遗传结构及生长性状相关的微卫星标记筛选时提出,选择数据时只有当超过次才被考虑.基于此,本研究选择出现次及以上的基因型.我们共获得 个基因型,其中在与草鱼生长性状有关联的个标记中,获得个可作为后期选育时重点考虑的基因型,分别是B B、C C、D D、B D、C D.有研究表明,微卫星位点与特定功能基因具有一定的关联性.徐美佳等人()发现,将所筛选出的对微卫星标记与已知序列进行B l a s t比对,其中C 与已知控制V型离子泵的基因同源性较高.王解香()筛选出的标记与鲤鱼的自然杀死细胞增强因子的同源性较高.同样地,李胜杰等人()筛选与大口黑鲈生长性状具有关联的E S T S N P标记,结果显示与生长性状显著相关的C L C o n t i g A l l 标记所位于的基因序列与R I L P l i k ep r o t e i n 具有高度的相似性.R I L P与R a b 相互作用,能够控制细胞的生存、增殖分化以及凋亡.那么,我们所筛选出的微卫星标记与控制草鱼生长性状相关的某些基因是否也具有较高的同源性?这有待进一步研究和分析.(下转第 页)第期顾剑峰等:草鱼生长性状相关微卫星标记的初步筛选t i o nC/t hAAA IC o n f e r e n c eo nA r t i f i c i a l I n t e l l i g e n c e,:WAN G H,WAN G N Y,Y E UN G D Y C o l l a b o r a t i v ed e e pl e a r n i n gf o rr e c o mm e n d e rs y s t e m sC/t hA CM S I G K D DI n t e r n a t i o n a lC o n f e r e n c eo n K n o w l e d g e D i s c o v e r ya n d D a t a M i n i n g,K D D A CM,:K I M D,P A R K C,OHJ,e ta l C o n v o l u t i o n a lm a t r i xf a c t o r i z a t i o nf o rd o c u m e n tc o n t e x t a w a r er e c o mm e n d a t i o nC/t h A CM C o n f e r e n c eo nR e c o mm e n d e rS y s t e m s A CM,:Z HE N GL,NO R OO Z IV,YU PS J o i n td e e pm o d e l i n go fu s e r sa n d i t e m su s i n gr e v i e w s f o r r e c o mm e n d a t i o nC/t hA CMI n t e r n a t i o n a lC o n f e r e n c eo nW e bS e a r c ha n dD a t a M i n i n g(WS DM)A CM,:T R UMB L E M,G I B E R T A,H I L TON A,e ta l D e e pa u t o e n c o d e r f o rc o m b i n e dh u m a np o s ee s t i m a t i o na n db o d ym o d e l u p s c a l i n gC/C o m p u t e rV i s i o nE C C V :t h E u r o p e a nC o n f e r e n c e,M u n i c h,G e r m a n y,S e p t e m b e r ,P r o c e e d i n g s,P a r tX,:S A L AKHUT D I NOV R,MN I H A P r o b a b i l i s t i c m a t r i xf a c t o r i z a t i o nC/I nA d v a n c e s i nN e u r a l I n f o r m a t i o nP r o c e s s i n gS y s t e m s,:Z OU H R,CHE NCX,Z HAOCJ,e ta l H y b r i dc o l l a b o r a t i v ef i l t e r i n g w i t hs e m i s t a c k e d d e n o i s i n ga u t o e n c o d e r sf o rr e c o mm e n d a t i o nC/C y b e rS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y C o n g r e s s(C y b e r S c i T e c h ),F u k u o k a,J a p a n,(上接第 页)参考文献:黎裕,王建康,邱丽娟,等中国作物分子育种现状与发展前景J作物学报,():鲁翠云,匡友谊,郑先虎,等水产动物分子标记辅助育种研究进展J水产学报,():GU I CHOUX E,L AG A CHE L,WAG N E R S,e ta l C u r r e n t t r e n d s i nm i c r o s a t e l l i t eg e n o t y p i n gJ M o l e c u l a rE c o l o g yR e s o u r c e s,():缪一恒,沈玉帮,徐晓雁,等长江、珠江和黑龙江草鱼双列杂交组合遗传变异的微卫星分析J上海海洋大学学报,():张义凤,张研,鲁翠云,等鲤鱼微卫星标记与体重、体长和体高性状的相关分析J遗传,():徐美佳,张妍,鲁翠云,等利用E S T S S R座位对鲤鱼种生长性状的单标回归分析J水产学杂志,():张丽博,张晓峰,曹顶臣,等利用S S R及E S T标记对鲤鱼饲料转化率的Q T L分析J农业生物技术学报,():丁 炜 东,曹 丽 萍,曹 哲 明草 鱼 种 质 相 关S R A P及S C A R的分子标记J动物学报,():王解香草鱼不同地域群体的遗传结构分析及生长性状相关的微卫星标记筛选D上海:上海海洋大学,余成晨,沈玉帮,徐晓雁,等草鱼生长相关的微卫星标记在选育群体中的验证J水产学报,():刘哲,康鹏天,柴文琼,等鱼类血液基因组D NA提取方法优化J水生态学杂志,():李鸥,赵莹莹,郭娜,等草鱼种群S S R分析中样本量及标记数量对遗传多度的影响J动物学研究,():王解香,于凌云,白俊杰,等草鱼E S T S S R标记及个不同地 域群 体 的遗 传结 构分 析J动 物 学 杂 志,():周盼,张研,徐鹏,等基于 个微卫星标记的三江水系草鱼遗传多样性分析J中国水产科学,():鲁翠云,顾颖,李超,等镜鲤与建鲤生长性状共享Q T L标记及优势基因型J中国水产科学,():李胜杰,白俊杰,赵荦,等大口黑鲈E S T S N P标记开发及其与生长性状的关联性分析J海洋渔业,():高进,杨润清大菱鲆体重和体尺性状联合GWA S分析J渔业科学进展,():袁文成,叶金明,黄鹤忠,等翘嘴鳜(S i n i p e r c ac h u a t s i)E S T S S R遗传标记与生长性状相关性及个选育群体遗传结构研究J海洋与湖沼,():南昌大学学报(理科版)年