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5种常用病毒灭活剂的应用概述史大庆，肖永珍，陈汉林，陈金仙，王灵，齐冬梅，林德锐*（广东永顺生物制药股份有限公司，广东 广州 511356）摘 要：病毒灭活是利用物理或化学方法使病毒失去感染性的过程。病毒的灭活效率常受到病毒特性、灭活剂种类、灭活目的等多个因素的影响。通常病毒特性和病毒灭活后的用途决定了灭活剂的选择，疫苗研制需病毒完全灭活的同时保持病毒保护性抗原表位结构完整，以诱导有效的宿主免疫反应；分子生物学检测则需要病毒基因组完整等。因此选择适宜的灭活剂对高致病性病原进行灭活是病原分子诊断、血清学分析以及疫苗开发等后续工作的重要保障。目前越来越多的病毒灭活剂被开发和利用，本文选择5种实际工作中常用的化学类病毒灭活剂：甲醛（Formaldehyde）、丙内酯（propiolactone）、胍基离序盐（Guanidium based chaotropic salts）、补骨脂素（Psoralen）、过氧化氢（Hydrogen peroxide），对其灭活机理、病毒灭活特点以及灭活病毒在后续工作中的应用进行如下概述。关键词：甲醛；丙内酯；胍基离序盐；补骨脂素；过氧化氢；病毒灭活中图分类号：S851.66文献标识码：A文章编码：10058567（2023）04006606Overview of Five Frequently Used Virus InactivatorsSHI Daqing，XIAO Yongzhen，CHEN Hanlin，CHEN Jinxian，WANG Ling，QI Dongmei，LIN Derui*（Guangdong Winsun BioPhamaceutical Co.，Ltd，Guangzhou Guangdong 511356）Abstract：Virus inactivation is the process of using physical or chemical methods to make the virus loseinfectivity.The virus inactivation efficiency is often affected by many factors，such as virus characteristics，types ofinactivators and the aims of inactivation.The selection of inactivators is usually determined by the characteristics of thevirus and its use after inactivation.Vaccine development requires complete inactivation of the virus while maintainingthe integrity of the viral protective antigen epitope structure to induce an effective host immune response.Molecularbiological detection requires complete viral genome integrity.Therefore，selecting appropriate inactivators to inactivatehighly pathogenic pathogens is an important guarantee for subsequent work such as pathogen molecular diagnosis，serological analysis，and vaccine development.At present，more and more virus inactivators are being developed andutilized.In this paper，5 chemical virus inactivators frequently used are selected，namely formaldehyde，propiolactone，guanidium based chaotropic salts，psoralen，hydrogen peroxide，the inactivation mechanism andinactivation characteristics of the aboved virus inactivators，along with the application of inactivated virus aresummarized as follows.Keywords：Formaldehyde；propiolactone；Guanidium based chaotropic salts；Psoralen；Hydrogenperoxide；Virus inactivation收稿日期：20221009作者简介：史大庆（1978年生），男，兽医师，研究方向：兽用生物制品。Email：*通讯作者：林德锐（1978年生），男，高级兽医师，研究方向：兽用生物制品。Email：专题综述广东畜牧兽医科技广东畜牧兽医科技2023年（第48卷）第4期Guangdong Journal of Animal And Veterinary ScienceDOI:10.19978/ki.xmsy.2023.04.12 66高致病性病毒的灭活是病毒分子诊断、血清学分析以及疫苗开发的重要环节。根据灭活作用的性质可分为物理灭活和化学灭活。物理灭活包括热灭活、紫外光、射线灭活等。化学灭活主要指利用一些化学试剂达到灭活的效果，常用的病毒灭活剂有：甲醛、丙内酯、二乙烯亚胺、胍基离序盐、光活性化合物（如补骨脂素或叠氮化物等）、芳香族二硫化物、过氧化氢、乙醇等；还有其他灭活剂如清洁剂 Tween20、Triton X100或十二烷基硫酸钠（SDS）等也被用于病毒灭活1。病毒种属特性和灭活后病毒的用途是选择灭活剂和灭活方法的决定因素，如：血清学分析和疫苗研制要求病毒灭活完全，且灭活病毒的蛋白质结构完好，特别是保持能够诱导产生中和抗体的抗原表位蛋白结构完整，以诱导有效的宿主免疫反应；而分子生物学检测则需要病毒基因组完整2。病毒灭活效率还会受到诸如病毒效价、病毒液的储存基质（组织源、细胞源、血清源、胚源等）、pH值、无机盐含量、其它蛋白质含量、灭活辅助设备和环境等多种因素的影响。本文对甲醛、丙内酯、胍基离序盐、补骨脂素、过氧化氢等常用的化学类病毒灭活剂的灭活机理、病毒灭活特点以及灭活病毒在后续分子生物学检测、血清学评估、疫苗研发等一个或多个方向的应用进行如下概述。1甲醛（Formaldehyde）甲醛是一种有机化合物，化学式是HCHO或CH2O，是无色有强烈刺激性气味的气体。是WHO认定的一类致癌物。在实际工作中常常使用含量为37%40%的甲醛水溶液即福尔马林进行病毒灭活。甲醛易溶解于水形成水合亚甲基，可导致由羟甲基基团、席夫碱和亚甲基桥等多元化的修饰作用，形成核酸蛋白质和蛋白质蛋白质交联3。其中羟甲基和希夫碱的形成是可逆的，通过电喷雾电离质谱（Electrospray ionization mass spectrometry）可以发现羟甲基和希夫碱衍生物位于氨基或巯基的残基上。由甲醛引起的多肽或蛋白质最重要的修饰是形成稳定的亚甲基桥，首先甲醛与多肽或蛋白质的氨基和巯基发生反应，然后与精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸和酪氨酸等氨基酸残基形成交联4。亚甲基桥使蛋白质分子间或分子内形成交联。同时这些反应还可以在基因组与蛋白质之间形成核酸蛋白质交联，导致基因组功能失调。另外，核酸腺嘌呤上的非质子化外环胺作为亲核基团，可与甲醛碳正离子发生反应完成腺嘌呤的单羟甲基化（即烷基化），阻碍DNA复制和RNA转录5。因此，使用甲醛灭活对病毒的基因组和蛋白质都有影响。1.1血清学检测在血清学分析中，甲醛可保存细胞结构，是一种常见的固定剂，可用于电子显微镜、免疫荧光分析和流式细胞仪分析等。4%多聚甲醛固定严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2，SARSCoV2）感染的细胞，可以有效地灭活SARSCoV26。呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）融合前构象的F蛋白极不稳定，使用浓度为0.2667%-0.0156%甲醛灭活12 h，病毒40%-60%的融合前构象F蛋白被保留；小鼠免疫中和抗体水平提高了 45倍7。1.2疫苗开发自20世纪20年代以来，甲醛一直是人用和兽用疫苗研发和生产中最常用的灭活剂。临床上已成功地应用于多个人用灭活苗，如甲型肝炎病毒灭活疫苗：HAVRIX、VAQTA、AVAXIM、Aimugen及中国医学科学院医学生物研究所生产的维赛瑞安等；钩端螺旋体灭活苗：赛诺菲巴斯德生产SPIROLEPT和古巴研制开发的vaxSPIRAL等；以及脊髓灰质炎病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、RSV 等病毒灭活疫苗3，89。目前，兽用灭活疫苗中如新城疫、禽流感、传染性支气管炎等禽用病毒灭活疫苗多使用甲醛进行病毒灭活。在疫苗制备过程中，甲醛的灭活效果受到诸如：病毒种类、灭活温度、病毒液的pH和浓度等多种因素的影响。使用甲醛灭活病毒会出现病毒灭活不彻底的现象，多由甲醛使用浓度不恰当或灭活时间不充分引起；也有可能是病毒核衣壳蛋白与RNA发生交联，RNA不能被降解，一些病毒颗粒逃脱了甲醛的影响未被灭活，导致灭活不彻底5。2丙内酯（BetaPropiolactone，BPL）BPL为四元环内酯类有机化合物，化学式为5种常用病毒灭活剂的应用概述史大庆，等专题综述 67C3H4O2，无色液体，易溶于水。BPL是病毒DNA或RNA鸟嘌呤上的烷基化剂，核酸的鸟嘌呤通过亲核取代机制与亲电的BPL试剂反应，完成鸟嘌呤的烷基化；抑制转录导致病毒失活，但不损害病毒衣壳蛋白10。BPL可水解为无细胞毒性的乳酸和羟基丙酸，因此可通过水解作用去除灭活液中残留的BPL5。适宜浓度的BPL能够充分发挥病毒灭活的作用，浓度过高则会影响结构蛋白的抗原完整性，还可使病毒粒子大量聚集，导致灭活不完全和免原性降低。BPL被广泛用于病毒灭活疫苗的研制与生产实践，使用频次仅次于甲醛。BPL临床上已用于黄热 病（Yellow fever）、流 感（Influenza）、狂 犬 病（Rabies）等人用病毒病疫苗及鳜传染性脾肾坏死病病毒（Infection spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）和弹状病毒（Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV）、大 鲵 虹 彩 病 毒（Giant SalamanderIridovirus，GSIV）等多种鱼类病毒病疫苗的抗原灭活1112。特别地，近三年BPL也广泛的应用于生产SARSCoV2全病毒灭活疫苗，如国药集团北京生物制品研究所的BBIBPCorV疫苗和北京科兴中维生物技术有限公司的CoronaVac疫苗1316。大量临床应用说明BPL灭活病毒制备的灭活疫苗，能够诱导良好的保护性免疫反应。3胍 基 离 序 盐（GuanidiumBasedChaotropic Salts，GBCS）GBCS通常为核酸提取液的主要成分，用于病毒 灭 活 的 GBCS 主 要 为 含 有 异 硫 氰 酸 胍（Guanidinium Isothiocyanate，GI）、苯酚或 Tritonx100、硫氰酸胍（Guanidium thiocyanate，GTC）等的缓冲液。GBCS灭活病毒可破坏病毒囊膜和降解细胞核酸酶，保持病毒的核酸结构。GBCS处理过的病毒样品能够满足分子生物学分析要求，但不能用于血清学和免疫学分析，因此GBCS常常应用于病毒核酸提取。GBCS常与其他化学试剂联合使用，常见商品化的核酸提取液如：TRIzol LS 试剂（含有GI和苯酚等的核酸提取液）、AVL缓冲液（含GTC 但不含 Triton X100 的核酸提取液）和 MPLB（含Triton X100和GTC的核酸提取液）等1718。市售的胍基制剂由于其各成分的比例及活性成分的含量不同，因此灭活效率不但会受到病原的性质和浓度、样品基质的影响，还会受到灭活剂使用量及作用时间等的影响。Blow等证实TRIzol LS和AVL缓冲液可以有效地灭活不同病毒科的多种病毒，如西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）、登 革 热 病 毒（Denguevirus，DENV）、埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）、裂谷热病毒（Rift Valley fever virus，RVFV）等17。Burton等研究结果表明，AVL和0.1%Triton X100共同作用10 min后，EBOV完全失活。Triton X100和 AVL 缓冲液共同作用不影响 EBOV 核酸的活性，可用于RTqPCR和测序分析等19。将SARSCoV2和Trizol LS按1 4的比例混合孵育5 min、与0.5%SDS、或与 Triton X100 在室温共同孵育 30min后，可有效灭活SARSCoV2，灭活后的病毒可利用RTqPCR进行分子生物学诊断分析6，20。痘苗病毒及牛痘病毒样品与含20%Triton X100和25%GI的MPLB等量混合，室温孵育15 min，可以有效灭活痘苗病毒和牛痘病毒，且不影响后续的qPCR检测21。4补骨脂素（Psoralens）补骨脂素是一种光敏剂，光反应性天然化合物。常用的补骨脂素为人工合成的氨托沙林（Amotosalen，别名：S59）和 4氨甲基三氧沙林（40 aminomethyltrioxsalen，AMT）等。其可自由穿透磷脂双层膜并插入核酸嘧啶残基之间而不影响病毒完整性。在长波紫外线（UVA）照射下补骨脂素与完整的病毒和核酸发生光反应，这种光反应可以保持病毒蛋白抗原及其表面结构，但导致核酸嘧啶残基交联，从而抑制 DNA 复制和 RNA 转录，使病毒失去感染性2224。补骨脂素灭活动力学是非线性的，RNA病毒和DNA病毒的光反应作用动力学也不同。补骨脂素是最具光活性的化学物质，具有广泛的适用性和灭活多种病毒的潜力。4.1分子生物学检测及血清学评估补骨脂素作为病毒灭活剂，不影响病毒的核酸和表面蛋白的完整性，因此常用于免疫荧光检测、流式细胞仪分析、Sanger法测序、RTqPCR等分子生物学检测和血清学评估23，25。Schneider等利用AMT灭活EBOV、RVFV、DENV等多个病毒并提专题综述5种常用病毒灭活剂的应用概述史大庆，等 68取核酸成功完成RTqPCR检测，验证了在灭活过程中灭活病毒的核酸未受到损伤。灭活后的DENV核酸可用于qPCR、Sanger法测序26。利用补骨脂素和UVA光源来灭活病毒的方法不但可以使病毒有效失活，还可以不用去除残留的灭活剂的前提下进行分子检测、血清学评估等多项工作。4.2疫苗开发与广泛使用的高温或有毒化学物质使蛋白质和核酸变性或交联的方法相比，补骨脂素具有可使病毒失去感染性，但保持病毒结构、保留免疫原性的特点，因此补骨脂素灭活病毒也适用于疫苗开发。AMT已被证明可以有效地灭活囊膜、非囊膜、球形、丝状等多个不同科的 RNA 病毒26。Maves等利用小鼠和猴评估补骨脂素灭活的DENV1型灭活疫苗的免疫原性，10 ng剂量组的小鼠中检测到抗DENV1的中和抗体（10/11）；10 ng剂量组的猴在接种62天后，7/7仍能检测到IgG和中和抗体；证实了该灭活疫苗在小鼠和猴上均具有良好的免疫原性2728。Sundaram等利用补骨脂素开发出了DENV14型四种单价灭活疫苗和DENV四价灭活疫苗，疫苗诱导小鼠产生的中和抗体几何平均滴度与甲醛灭活组疫苗相当或更高29。DENV四价灭活疫苗免疫食蟹猕猴，补骨脂素灭活疫苗组的每一种DENV血清型的中和抗体滴度均明显高于甲醛灭活组29。Sundaram等利用补骨脂素作为灭活剂灭活 SARSCoV2 抗原，开发了 SARSCoV2全病毒灭活疫苗（SARSCoV2 PsIV），免疫小鼠产生了强烈的中和抗体反应和针对刺突蛋白及核蛋白的T细胞反应25。利用补骨脂素灭活病毒主要优点是其低毒性和不会破坏病毒抗原及其它表位的构象。但每种病毒所需的UVA暴露时间和补骨脂素浓度等受到病毒种类、病毒滴度等多方面的影响；如用于疫苗研发还需要利用多种方法验证灭活病毒的安全性和有效性1。5过氧化氢（Hydrogen peroxide）过氧化氢是一种无机化合物，化学式为H2O2，一种强氧化剂。通过攻击核苷中的碳双键或阻碍氢原子，使核酸的单链或双链断裂，从而影响病毒复制，导致病毒失活；H2O2灭活后的病毒能够保持诱导体液和细胞免疫反应的抗原结构3032。同时，H2O2具有对环境安全的优点，它可分解为氧气和水，无灭活剂残留问题，无需从灭活液中去除。5.1血清学评估H2O2灭活病毒破坏病毒核酸，但能够保持诱导体液和细胞免疫反应的抗原结构，因此在血清学分析和疫苗开发中，H2O2作为一种病毒灭活的替代方法引起了人们的广泛关注。Amanna等利用H2O2灭活黄热病病毒（Yellow Fever virus，YFV）和WNV病毒，取灭活病毒作为ELISA包被抗原，用小鼠抗 YFV 免疫血清检测抗原与抗体的结合情况，H2O2处理2 h组获得87%98%抗体结合反应率30。血清学检测结果表明，灭活病毒制备的H2O2WNV疫苗免疫小鼠诱导产生的中和抗体水平相当于或超过WNV自然感染的抗体水平30。5.2疫苗开发H2O2能灭活DNA和RNA病毒且对病毒蛋白表位的损害小；H2O2灭活抗原制备的疫苗能诱导强烈的中和抗体反应和有效的T细胞反应，因此H2O2同样被广泛的应用于病毒疫苗研发。Dembinski等将3种流感病毒分别用1%或3%的H2O2溶液在室温灭活2 h，试验结果表明，1%的H2O22 h可以完全灭活3种流感病毒33。采用ELISpot、BioPlex和ELISA方法验证了灭活病毒诱导免疫反应的水平与活病毒相同。结果说明H2O2不但可以有效灭活流感病毒，而且对抗原结构没有任何影响。AbdElghaffar等34证实终浓度为3%的H2O2在2-8 孵育2 h，能够完全灭活狂犬病巴斯德株固定毒，小鼠免疫和NIH效价测定结果H2O2组与BPL灭活组相当。Akbarian等将H2O2用于小反刍兽疫灭活苗的开发，疫苗安全性和免疫原性良好35。Slifka等开发了基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）H2O2灭活疫苗（HydroVaxCHIKV），灭活病毒能够有效地保持中和表位，针对4种不同分支的CHIKV代表毒株以及多个甲病毒诱导广泛的中和抗体反应，并提供完全的抗体介导的病毒血症保护36。HydroVaxCHIKV可能是一种有前途的预防基孔肯雅热的新候选疫苗。6小结与展望目前，寻找一种有效的病毒灭活方法仍然是5种常用病毒灭活剂的应用概述史大庆，等专题综述 69一个不断试错的过程，通常是选择一种或多种灭活方法灭活病毒，然后再使用各种验证方法，如细胞培养、胚培养、鼠兔等小型试验动物、靶动物等进行灭活检验，以确定病毒是否完全灭活；以疫苗研发为目的的病毒灭活还要进行灭活抗原的免疫原性试验、免疫攻毒效力试验等的验证。虽然已经开发出了众多的适用于病毒灭活的物理和化学的方法，但这些方法的灭活效果均受到病毒种类、灭活条件等多种因素的影响。以上概述了甲醛、丙内酯、胍基离序盐、补骨脂素、过氧化氢等灭活剂的灭活机理和特点、灭活病毒的应用；但无论是哪一种灭活剂或方法都有其优势和局限性，因此，实际工作中应根据病毒灭活目的和用途综合评估和选择灭活剂及灭活方法，并利用多种方法对病原的核酸、蛋白活性等进行灭活效果的验证。参考文献：1 ELVEBORG S，MONTEI V M，MIRAZIMI A.Methods ofInactivationofHighlyPathogenicVirusesforMolecular，Serology or Vaccine Development Purposes J.Pathogens，2022，11：271295.2 MEGHA K B，NAYAR S A，MOHANAN P V.Vaccine andvaccination as a part of human life：In view of COVID19J.Biotechnology Journal，2022，17（1）：e2100188.3 LU K，YE W J，ZHOU L，et al.Structural Characterization ofFormaldehydeInduced CrossLinks between Amino Acids andDeoxynucleosides and Their Oligomers J.Journal of theAmerican Chemical Society，2010，132：33883399.4 METZB，KERSTENGF，HOOGERHOUTP，etal.IdentificationofFormaldehyde inducedModificationsinProteins：REACTIONS WITH MODEL PEPTIDES J.TheJournal of Biological 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