7种抗菌药物协同抗家蚕病原细菌效果.pdf

家蚕是一种经济动物昆虫，具有开放式体腔，缺乏特异性免疫，易发生病毒病、真菌病、细菌病、原虫病等传染性病害1。目前，养蚕生产中主要依赖严格消毒来预防传染性蚕病2，但由于家蚕病原种类多、来源广、传染性强，使得传染性蚕病防不胜防，很难完全防控其发生。因此，桑蚕业迫切需要能有效治疗蚕病的药物应用于养蚕生产。养蚕生产上能利用药物治疗的蚕病种类有细菌病和微粒子病，特别是家蚕细菌病是应用添食药物治疗效果最好的病种3；给家蚕添食抗细菌药物抑制细菌感染可以提高蚕体体质，也有助于家蚕抵御其他蚕病病原的侵染。长期以来，人用、兽用抗细菌药物层出不穷，部分药物成功应用于养蚕生产防治家蚕细菌病。但家蚕细菌病种类多，有败血病、肠道病、卒倒病等种类，其中败血病、肠道病又由多种病原感染引起，而一些药物只能抑制一种或多种病原，不能抑制抗所有家蚕细菌病。为了合理应用药物，有效治疗家蚕细菌病，本研究从蚕药市场上筛选一些常用的家蚕细菌病治疗药收稿日期：2023-03-25；接受日期：2023-05-18资助项目：国家自然科学基金项目（No.32060777），广西桑蚕产业创新团队病虫害防治岗位（No.nycytxgxcxtd-2021-02-04），广西农业科技项目（No.Z202041）。第一作者信息：陆方苗（1986），女，本科，农艺师，主要从事桑蚕生产管理及技术推广工作。E-mail：通信作者信息：文小淋（1969），男，本科，高级农艺师，工作。E-mail：7种抗菌药物协同抗家蚕病原细菌效果陆方苗1，黄洁薇1，欧壮兵1，黄湖滔1，罗妮1，黄深惠2，蒋满贵2，王霞2，黄旭华2，文小淋3*（1.环江毛南族自治县农业农村局，河池市 547100；2.广西壮族自治区蚕业技术推广站，南宁市 530007；3.宾阳县农业农村综合服务中心，南宁市 530405）摘要家蚕细菌病是一种可以应用药物治疗的蚕病，在养蚕生产中使用的抗菌药物种类繁多。为了合理使用药物，有效防治家蚕细菌病，采用琼脂平板滤纸片法调查盐酸环丙沙星、恩诺沙星、盐酸多西环素、硫氰酸红霉素、氯霉素、氟苯尼考和阿莫西林等7种抗菌药物对家蚕灵菌败血病病原、苏云金杆菌和葡萄球菌的体外抗菌活性，并调查抗菌药物间协同抗家蚕细菌病原的效果。结果表明，盐酸环丙沙星对家蚕病原细菌抗菌效果最佳，对灵菌败血病菌和苏云金杆菌的抑菌活性是抗菌较差药物的19倍以上；其次是恩诺沙星；其他药物的抑菌效果较差。试验验证出盐酸环丙沙星与恩诺沙星、盐酸多西环素、氟苯尼考、硫氰酸红霉素、氯霉素、阿莫西林以及恩诺沙星与硫氰酸红霉素、盐酸多西环素、氟苯尼考两两混合对家蚕灵菌败血病菌和苏云金杆菌具有协同增效作用；盐酸环丙沙星与氯霉素、恩诺沙星与氟苯尼考混合对家蚕葡萄球菌也具有增强抗菌的效果。试验结果为蚕用药物生产以及养蚕生产中合理利用药物有效防治蚕病提供指导依据。关键词家蚕；抗菌药物；细菌病；抑菌效果；协同抗菌中图分类号S884.1文献标识码B文章编号1006-1657（2023）02-0026-05ISSN 1006-1657；CN 45-1213/SDOI：10.19553/ki.1006-1657.2023.02.005陆方苗，等.7种抗菌药物协同抗家蚕病原细菌效果.广西蚕业，2023，60（2）：26-3026陆方苗，等.7种抗菌药物协同抗家蚕病原细菌效果.广西蚕业，2023，60（2）：26-30物以及一些人用、兽用新型抗菌素，以家蚕细菌病原为作用对象，调查这些抗菌药物直接抑制及协同抗家蚕病原细菌效果，以期为养蚕生产有效防治家蚕细菌病发生提供依据。1材料与方法1.1药品与试剂1.1.1抗菌药物及配制试验应用抗菌药物及使用浓度见表1。序号1234567抗菌药物蚕宝康强氯添食康新型蚕用高效氯霉素蚕服康好益特氟苯尼考粉阿莫奇抗有效成分盐酸环丙沙星恩诺沙星溶液氯霉素硫氰酸红霉素盐酸多西环素氟苯尼考阿莫西林生产厂家重庆新宝动物药业有限公司重庆新宝动物药业有限公司四川省三台县畜牧蚕药厂镇江中农生物技术有限公司四川好益特动物保健药品有限公司四川省泰信动物药业有限公司四川渴望生物科技有限公司规格及生产实用浓度规格：2 mL：5 mg，2 mL/支；每2支加水500 mL。规格：2 mL：5 mg，2 mL/支；每2支加水500 mL。规格：5 mL：500 mg，5 mL/支；每支加水1 000 mL。规格：5万单位/粒，1粒加水500 mL。规格：10%，以0.250.5克溶于1L水中。规格：2%，以3克溶于1L水中。规格：30%，以0.2克溶于1L水中。表表1 1供试抗菌药物供试抗菌药物1.1.2培养基（1）LB肉汤培养基，北京奥博星生物技术有限公司产品，称取本品32 g，加入1 000 mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121 高压灭菌15 min备用；（2）LB肉汤液体培养基，北京奥博星生物技术有限公司产品，称取本品20 g，加入1 000 mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121 高压灭菌15 min备用。1.2菌液配制家蚕灵菌败血病菌、苏云金杆菌和葡萄球菌均为广西蚕业技术推广站蚕桑病虫害研究室提供的标准株。用接种环挑取3种病原细菌在LB培养基上接种复壮，37 培养24 h；再分别从各种细菌平板培养基上挑取单菌落接于加有5.0 mL液体培养基的试管中，37 振荡培养过夜，分别取30 L加入另一支有5.0 mL液体培养基的试管中，37 振荡培养4 h，得到处于对数生长期的菌悬液，置4 冰箱保存备用4。1.37种抗菌药物生产实用浓度对家蚕病原细菌体外抑制测定含菌平板的制备：将LB固体培养基熔化后，冷却至 55 左右，在直径为 12 cm 的培养皿中倾注30 mL培养基，待凝固后，分别用备好的各种菌悬液2.0 mL加到平板上，旋转平皿，使菌液完全覆盖平板，之后立即倒出多余的菌液，放置稍干即可使用4。用直径为0.5 cm的滤纸片浸入配成实用浓度的各种药液中10 min，用镊子取出滤纸片放到各种备好的含菌平板中，轻放滤纸片，并轻压一下。记录各种抗生素的纸片位置，放纸片完毕，置恒温培养箱内37 培养24 h。用直尺测量各种药品的抑菌圈直径4。1.47种抗菌药物同样浓度对家蚕病原细菌体外抑制测定用直径为0.5 cm的滤纸片浸入有效成分浓度均为1.0 mg/mL的7种配方药液中。操作和培养方法同1.3。1.57种抗菌药物协同作用效果将2种对家蚕细菌病病原具有抑制效果的抗菌药物与其他抗菌药物两两混合，2种抗菌药物混合前浓度均是生产实用浓度的2倍，当混合后每种抗菌药物的浓度是生产实用浓度。再用直径为0.5 cm的滤纸片浸入混合药液中。操作和培养方法同1.3。2结果与分析2.17种抗菌药物生产实用浓度体外抑制家蚕细菌病病原效果采用琼脂平板滤纸片法测定7种抗菌药物的生产实用浓度抑制家蚕灵菌败血病菌、苏云金杆菌和葡萄球菌的效果，结果如表2所示。272023年第60卷第2期广西蚕业GuangxiSericultureVol.60No.2，2023对灵菌败血病菌的抗菌活性由强到弱依次为盐酸环丙沙星恩诺沙星盐酸多西环素硫氰酸红霉素=氯霉素氟苯尼考=阿莫西林，其中盐酸环丙沙星的抑菌圈直径为3.00 cm，面积为7.07 cm2，是氟苯尼考和阿莫西林抑菌圈面积的25倍，说明抗菌素间抗家蚕灵菌败血病菌效果差异大。对苏芸金杆菌的抗菌活性依次为盐酸多西环素盐酸环丙沙星=恩诺沙星硫氰酸红霉素氟苯尼考阿莫西林氯霉素，其中盐酸多西环素的抑菌圈直径为3.1 cm，面积为7.53 cm2，是氯霉素抑菌圈面积19.58倍，也说明抗菌素间抗苏芸金杆菌效果差异大。对葡萄球菌的抗菌活性依次为盐酸环丙沙星恩诺沙星硫氰酸红霉素盐酸多西环素氟苯尼考=阿莫西林氯霉素，其中盐酸环丙沙星的抑菌圈直径为3.1 cm，面积为7.53 cm2，是氟苯尼考和阿莫西林抑菌圈面积的2.40倍，说明抗菌素间抗家蚕葡萄球菌也有一定差异。表表2727种抗菌药物的生产实用浓度对家蚕种抗菌药物的生产实用浓度对家蚕3 3种病原的抑菌圈直径种病原的抑菌圈直径cm病菌灵菌败血病菌苏芸金杆菌葡萄球菌抗菌药物盐酸环丙沙星3.03.13.1恩诺沙星溶液1.83.12.8氯霉素0.80.71.8硫氰酸红霉素0.82.92.4盐酸多西环素1.03.42.2氟苯尼考0.61.62.0阿莫西林0.60.82.02.27种抗菌药物生产同样浓度体外抑制家蚕细菌病病原效果采用琼脂平板滤纸片法测定 7 种抗菌药物的1.0 mg/mL浓度抑制家蚕灵菌败血病菌、苏芸金杆菌和葡萄球菌的效果，结果如表3所示。对灵菌败血病菌的抗菌活性依次为盐酸环丙沙星恩诺沙星氟苯尼考硫氰酸红霉素氯霉素盐酸多西环素阿莫西林，与生产实用浓度的抑菌效果比较有一定差异，但抑菌效果最佳的还是盐酸环丙沙星和恩诺沙星。对苏芸金杆菌的抗菌活性依次为恩诺沙星盐酸环丙沙星盐酸多西环素硫氰酸红霉素=氟苯尼考氯霉素阿莫西林，与生产实用浓度的抑菌效果比较也有一定差异，但抑菌效果最佳的是恩诺沙星和盐酸环丙沙星。对葡萄球菌的抗菌活性依次为盐酸环丙沙星恩诺沙星硫氰酸红霉素盐酸多西环素氟苯尼考阿莫西林氯霉素，与生产实用浓度的抑菌效果比较基本一致。表表3737种抗菌药物有效成分浓度为种抗菌药物有效成分浓度为1 1 mg/mLmg/mL对对3 3种家蚕病原的抑菌圈直径种家蚕病原的抑菌圈直径cm病菌灵菌败血病菌苏芸金杆菌葡萄球菌抗菌药物盐酸环丙沙星3.43.03.2恩诺沙星溶液3.03.22.9氯霉素1.42.00.7硫氰酸红霉素1.52.72.8盐酸多西环素1.32.82.2氟苯尼考1.62.71.8阿莫西林0.91.31.22.3抗菌药物协同体外抑制家蚕细菌病病原效果经过实验反复筛选7种抗菌药物两两混合后的协同灭菌效果，发现盐酸环丙沙星和恩诺沙星分别同其他抗菌药物混合后的抑菌效果较明显。采用琼脂平板滤纸片法测定盐酸环丙沙星和恩诺沙星分别与其他种抗菌药物两两混合抑制家蚕灵菌败血病菌、苏芸金杆菌和葡萄球菌的效果如表4所示。对灵菌败血病菌的抗菌活性，盐酸环丙沙星+恩诺沙星、盐酸环丙沙星+硫氰酸红霉素、盐酸环丙沙星+盐酸多西环素、恩诺沙星+氯霉素、恩诺沙星+硫氰酸红霉素、恩诺沙星+盐酸多西环素两两混合具有增强抗菌效果，但盐酸环丙沙星+氯霉素、盐酸环丙沙星+氟苯尼考、恩诺沙星+氟苯尼考两两混合有减28陆方苗，等.7种抗菌药物协同抗家蚕病原细菌效果.广西蚕业，2023，60（2）：26-30弱抗菌效果，盐酸环丙沙星+阿莫西林与恩诺沙星+阿莫西林混合后的活性一样，没有增强或减弱效果。表表4747种抗菌药物两两协同体外抑制灵菌败血病菌效果种抗菌药物两两协同体外抑制灵菌败血病菌效果药物组合+组合抑菌圈直径/cm1.51.52.21.51.61.51.81.81.71.61.7药一抑菌圈直径/cm1.41.61.91.41.81.51.81.71.61.91.7药二抑菌圈直径/cm1.21.50.81.00.80.90.60.81.11.20.6协同抑菌效果增强减弱增强增强减弱一致增强增强增强减弱一致注：为盐酸环丙沙星；为恩诺沙星溶液；为氯霉素；为硫氰酸红霉素；为盐酸多西环素；为氟苯尼考；为阿莫西林。“药一”为组合中第一种药，“药二”为组合中第二种药。下同。对苏云金杆菌的抗菌活性，有盐酸环丙沙星+氯霉素、盐酸环丙沙星+硫氰酸红霉素、盐酸环丙沙星+盐酸多西环素、恩诺沙星+盐酸多西环素、盐酸环丙沙星+阿莫西林两两混合具有增强抗菌效果，盐酸环丙沙星与氟苯尼考混合有减弱抗性效果，恩诺沙星与其他4种抗菌素混合也具有减弱抗性效果。盐酸环丙沙星同恩诺沙星混合的活性没有增强或减弱效果。表表5757种抗菌药物两两协同体外抑制苏芸金杆菌效果种抗菌药物两两协同体外抑制苏芸金杆菌效果对葡萄球菌的抗菌活性，盐酸环丙沙星+阿莫西林、恩诺沙星+氟苯尼考混合具有增强抗菌效果，盐酸环丙沙星与其他5种抗菌素混合有减弱抗性效果，恩诺沙星与其他5种抗菌素混合也具有减弱抗性效果，恩诺沙星+阿莫西林混合后活性与恩诺沙星的活性一样，没有增强或减弱效果。表表6767种抗菌药物两两协同体外抑制葡萄球菌效果种抗菌药物两两协同体外抑制葡萄球菌效果药物组合+组合抑菌圈直径/cm1.91.92.11.91.62.41.61.52.01.71.8药一抑菌圈直径/cm2.42.02.22.22.32.11.71.61.52.01.8药二抑菌圈直径/cm1.91.61.51.51.51.61.51.21.41.91.0协同抑菌效果减弱减弱减弱减弱减弱增强减弱减弱增强减弱一致3讨论自1929年Fleming在 英国医学杂志 宣布发现青霉素以来，先后发现链霉素、氯霉素等抗生素，被当作抗细菌感染的特效药物，并广泛临床应用于人、畜5。此后，通过筛选和人工合成的抗生素种类层出不穷6，为保障人类健康和畜禽产品生产做出重要贡献。很早时期在养蚕生产中也应用氯霉素等抗生素防治家蚕细菌病，取得很好的效果7。随着2002年7月1日国家农业部规定氯霉素禁止生产和使用，以及其他替代药物的开发，目前在养蚕生产中抗菌药物种类繁多。本研究着重调查7种抗菌药物对家蚕细菌病原的抑菌效果，试验调查发现盐酸环丙沙星和恩诺沙星对家蚕病原细菌抗菌效果比较好，无论是+3.12.93.23.23.23.32.93.43.13.12.42.93.03.33.03.13.23.23.12.02.92.52.01.01.83.22.5一致增强增强增强减弱增强减弱增强减弱药物组合组合抑菌圈直径/cm药一抑菌圈直径/cm药二抑菌圈直径/cm协同抑菌效果续表5+3.42.93.53.32.00.6减弱减弱药物组合组合抑菌圈直径/cm药一抑菌圈直径/cm药二抑菌圈直径/cm协同抑菌效果292023年第60卷第2期广西蚕业GuangxiSericultureVol.60No.2，2023生产实用浓度还是同样的浓度，两者抑菌效果比较好，也比较稳定，它们对灵菌败血病菌和苏云金杆菌的抑菌圈面积是其他较差抑菌药物的19倍以上，特别是对灵菌败血病菌，盐酸环丙沙星的抑菌呈现“一枝独秀”的效果。因此，盐酸环丙沙星和恩诺沙星适合应用于养蚕生产防治细菌病。由于生产成本高或者原料来源缺乏等问题，养蚕生产应用盐酸环丙沙星和恩诺沙星药剂比较少，价格相对较低的盐硫氰酸红霉素、盐酸多西环素、氟苯尼考等药剂更常作为家蚕细菌病防治药物，经测试这些抗菌药物对家蚕细菌病原抑菌效果较差。为了养蚕生产户应用抗菌药物有效防治病害，本研究测试了盐酸环丙沙星和恩诺沙星与抗菌药物混合协同抑菌效果。试验验证出盐酸环丙沙星与恩诺沙星、盐酸多西环素、氟苯尼考、硫氰酸红霉素、氯霉素、阿莫西林以及恩诺沙星与硫氰酸红霉素、盐酸多西环素、氟苯尼考两两混合对家蚕灵菌败血病菌和苏云金杆菌具有协同增效作用；盐酸环丙沙星与氯霉素、恩诺沙星与氟苯尼考混合对家蚕葡萄球菌也具有增强抗菌效果；但盐酸环丙沙星和恩诺沙星与其他药物混合有减弱抗菌效果。因此，药物混合后抗菌效果有差异，有的增强，有的减弱，应该是药物间存在互补与相互影响的机制，以及存在病原抗性的影响，具体机理有待深入研究。当前使用抗菌药物还存在一个突出问题，即病原菌产生耐药性问题8，极大影响药物使用效果，而利用适合药物组合，有利于解决耐药性问题。由实验还可以看出，虽然盐酸环丙沙星对3种家蚕病原抗菌活性最好，但针对某种病原还是有优势药品存在，如对苏云金杆菌的抗菌活性，盐酸多西环素的抑菌圈最大，明显比其它药品好。因此，在养蚕生产中要选择正确药物和正确使用方法才能有效防治病害。参考文献1 金伟.家蚕病理学 M.北京：中国农业出版社，2000：14.2 蒋亮，赵萍，夏庆友.家蚕抗病分子育种研究进展与展望 J.蚕业科学，2014，40（4）：571-575.3 苏振霞，牟志美.三种氟喹诺酮类药物体外抗家蚕病原菌活性的对比实验 J.蚕业科学，2003，29（4）：443-445.4 黄旭华，朱方容，石美宁.七种抗菌药品对家蚕病原细菌的抗菌试验 J.广西蚕业，2006，43（4）：1-4.5 李超，关芳灵，任建军，等.抗生素的历史演进及思考 J.医学与哲学，2015，36（537）：80-83.6 颜光美.药理学 M.北京：高等教育出版社，2010：372-380.7 江苏省蚕业研究所病理室.用氯霉素防治家蚕细菌病 J.农业科技通讯，1978（6）：1-2.8 孙双勇，王蒙蒙，李丽，等.抗生素耐药与抗生素新药开发的研究进展 J.现代药物与临床，2022，37（2）：15-18.蚕业信息“中国农业大学教授工作站”揭牌仪式在广西蚕业技术推广站举行2023年6月8日，“中国农业大学教授工作站”揭牌仪式在广西蚕业技术推广站举行，中国农业大学党委常委、副校长林万龙，广西壮族自治区农业农村厅总农艺师、党组成员李如平出席揭牌仪式。中国农业大学教授工作站的成立是贯彻落实中央及自治区有关精神、促进校地合作加快科技成果转化和服务产业落地的一项具体举措。依托教授工作站，广西将在蔬菜主产区开展适宜设施类型、主栽品种、栽培模式、环控技术等方面的技术研究与主推技术试验示范，力争在未来5年内建立适合广西设施蔬菜产业发展的技术模式与推广模式，确保广西蔬菜周年稳定生产并提高单产水平，有效推进广西设施蔬菜面积占比从2%提升到10%以上。活动期间，各位领导、专家还考察了广西蚕业技术推广站的整体规划建设情况，并参观了广西蚕桑遗传改良与技术创新中心实验室及科研成果展示馆。自治区农业农村厅人事处、科技教育处、广西蚕业技术推广站以及中国农业大学领导及相关专家参加揭牌仪式。（广西蚕业技术推广站石韡韬梁贵秋）30