β-氨基丁酸-大黄酸耦合物的合成、生物活性及韧皮部传导性.pdf

研究论文doi:10.16801/j.issn.1008-7303.2023.0036-氨基丁酸-大黄酸耦合物的合成、生物活性及韧皮部传导性胡慈银#,1,王锦鹏#,1,肖永欣1,李俊凯*,1,2(1.长江大学农学院，湖北荆州434025；2.长江大学农药研究所，湖北荆州434025)摘 要：氨基酸-农药耦合物能够改善母体农药的内吸传导性，提高农药的使用效率，减少因没有到达靶标造成的浪费及对环境的污染。本研究以天然产物大黄酸为先导化合物、以-氨基丁酸为导向基团，设计、合成了 4 个目标化合物，并检测了其对 6 种植物病原菌的抑菌活性，以及对小麦植株苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)活性的影响及在蓖麻幼苗中的韧皮部传导性。结果表明，化合物 4b(浓度 0.5mmol/L)不仅对水稻纹枯病菌 Rhizoctonia solaniKhn具有一定的抑制活性(菌丝生长抑制率为 53.5%)，而且具有诱导抗性(持效期近 7d)和韧皮部传导性(渗出液浓度为 15.1mol/L)。该研究为兼具内吸传导性和诱导抗性杀菌剂的开发提供了新思路。关键词:-氨基丁酸-大黄酸耦合物；抑菌活性；诱导抗性；韧皮部传导性中图分类号：O626.2；TQ455.4文献标志码：ASynthesis of-aminobutyric acid-Rhein conjugates and their bioactivity andphloem translocationHUCiyin#,1,WANGJinpeng#,1,XIAOYongxin1,LIJunkai*,1,2(1.School of Agriculture,Yangtze University,Jingzhou 434025,Hubei Province,China;2.Institute of pesticides,Yangtze University,Jingzhou 434025,Hubei Province,China)Abstract:Amino-pesticideconjugatesenabletoimprovethesystemicconductivityofparentingredients,increaseutilizationefficiency,anddecreasethewastethatwascausedbytheunreachedtargetandthuspollutiontotheenvironment.Inthisstudy,fourtargetcompoundsweredesignedandsynthesizedusingthenaturalproductRheinastheleadingcompoundand-aminobutyricacid(BABA)asthedirectinggroup,andtheirantifungalactivitiesagainstthesixplantpathogens,effectsonenzymaticactivitiesofthephenylalanineammonialyase(PAL)andperoxidase(POD)ofwheatleaves,whichweretreatedbythecompounds,andtheirphloemtranslocationinRicinusseedlingweremeasured.Theresultsshowedthatcompound4b(concentrationat0.5mmol/L)hadnotonlyaninhibitioneffectontheRhizoctonia solaniKhn(theinhibitionrateofmycelialgrowthwas53.5%),butalsoaninducibleresistance(durationwasnearly7d),andphloemtranslocation(sapconcentrationwas15.1mol/L).Thisstudyprovidesanewideafordevelopingsystemicandinduciblefungicides.收稿日期：2023-01-30；录用日期：2023-04-07；网络首发日期：2023-05-05.Received:January30,2023;Accepted:April7,2023;Published online:May5,2023.URL:https:/doi.org/10.16801/j.issn.1008-7303.2023.0036http:/ Journal of Pesticide ScienceE-mail:Keywords:BABA-rheinconjugates;antifungalactivities;inducibleresistance;phloemtranslocation农作物病虫草害是制约粮食安全生产的重要因素。化学防治是预防植物病虫草害发生并对其进行管控的有效手段，但农药不合理使用难免对粮食生产及质量造成不利影响1。因此，创制具有高活性、高选择性、低风险、无残留及清洁生产的绿色农药是未来中国农药发展的主要趋势。近年研究表明，天然产物在绿色农药研究领域潜力巨大，一些植物、微生物或海洋生物的提取物展现出良好的杀虫、杀菌及除草效果。例如：利用植物苦皮藤 Celastrus angulatusMaxim.制成的杀虫剂能够高效作用于鳞翅目昆虫靶标 Na+/K+-adenosinetriphosphatase(ATPase)2；从假单胞菌和链霉菌等微生物中提取的申嗪霉素(phenazine-1-carboxylicacid)已被登记为防治水稻纹枯病的高效杀菌剂3。此外，海洋天然产物芦竹碱(gramines)类似物和匹普利宁(pimprinine)生物碱等也具有良好的抗病毒活性4-5。大黄酸(Rhein，4,5-dihydroxyanthraquinone-2-carboxylicacid)属于单核蒽醌类衍生物，主要从药用植物大黄、虎杖及何首乌等多种传统中药材中分离提取6-7，具有抗炎、抑菌、抗肿瘤、抗病毒和抗氧化等活性8-11。以往对大黄酸的研究多集中在医药领域。大黄酸也是双醋瑞因(diacerein)的活性代谢物，Boileau 等12研究发现，双醋瑞因的作用机理是其代谢物大黄酸能够抑制胞外信号相关激酶 ERK1/2(extracellularsignal-regulatedkinase-1/2)和 p38 的活性，进而减少骨关节炎软骨组织中白细胞介素 1(interleukin-1-beta)诱导的金属蛋白(metalloprotease-13)和组织蛋白酶 K(cathepsinK)的合成，从而影响非正常软骨组织的代谢及破骨组织的分化。Yang 等13对大黄酸 3 号位上的羧基进行取代，分别合成了具有苯环结构和酰胺结构的两个系列衍生物。生物活性测定发现，这些衍生物对 Hela 和 Molt4 等肿瘤细胞具有较好疗效。王兴达等14在大黄酸羧基酰胺化的基础上继续对蒽醌母核 C7 位进行结构修饰，通过微孔板法检测发现，在大黄酸蒽醌母核 C7 位取代基上引入未取代杂环，可增强其对大肠杆菌的抑制作用。在农用活性研究方面，朱祥等15对大黄酸进行了结构改造，将其与氨基酸耦合，尝试从得到的系列衍生物中筛选到既具有良好的生物活性又具有韧皮部传导性的耦合物。生物活性测定发现，4,5-二甲氧基大黄酸氨基酸酯耦合物在离体条件下，对水稻纹枯病菌具有较好的杀菌活性，但其杀虫和除草效果不佳，且不具备韧皮部传导性。-氨基丁酸(-aminobutyricacid，BABA)是一种植物体内次生非蛋白质氨基酸，可激活植物自身免疫系统，从而诱导植物对多种生物和非生物胁迫做出防御反应来提高自身免疫能力16-18。作为一种极具潜力的广谱性植物诱抗剂，BABA 不仅能够提高不同植物对霜霉病、白粉病和软腐病等病害的抗病性，而且能诱导植物对烟草花叶病毒、细菌、卵菌和线虫等产生局部和系统抗性19。已有研究表明，以植物内源物质如糖或氨基酸等为导向基团，通过其与农药活性成分耦合，得到的衍生物具有韧皮部传导性20-21。本研究拟将 BABA作为导向基团，将其与先导化合物大黄酸耦合，设计、合成一系列衍生物，以期筛选到既保留大黄酸的生物活性和 BABA 的诱导抗性，又具有韧皮部传导性等性质的内吸传导型诱抗杀菌剂。目标化合物 3a、3b、4a 和 4b 的合成路线分别见图式 1 和图式 2。OHOOOHOHOSOCl2OHOOOHClONH2OOOHOOOHHNOOOOHOOOHHNOOHOLiOHCH2Cl2CH2Cl21,4-dioxane3a3b1大黄酸Rhein图式 1 目标化合物 3a 和 3b 的合成线路Scheme 1 Synthesis routes of target compounds 3a and 3bNo.4胡慈银等:-氨基丁酸-大黄酸耦合物的合成、生物活性及韧皮部传导性809 1 材料与方法 1.1 仪器与药剂BrukerAvanceDPX400型核磁共振仪(以TMS 作内标物，CDCl3或 DMSO-d6作溶剂，德国-瑞士布鲁克光谱公司)；ThermoScientificQ-Exactive型高分辨率质谱仪(ESI-MS，赛默飞世尔科技有限公司)；WRR 熔点测定仪(上海精密科学仪器有限公司)；K2025 高效液相色谱仪(山东悟空仪器有限公司)；SorvallLegendMicro21R型微量冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司)；SENSE425-301型多功能酶标仪(芬兰 Hidex 公司)。大黄酸原药、-氨基丁酸乙酯盐酸盐和 DL-氨基丁酸(纯度均为 98%)，购自上海晶纯生化科技股份有限公司；过氧化物酶(POD)活性检测试剂盒和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性检测试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司。其他化学试剂均为市售国产分析纯。1.2 供试材料供试病原菌：水稻纹枯病菌 Rhizoctonie solaniKhn、小麦赤霉病菌 Fusarium graminearum、油菜菌核病菌 Sclerotinia sclerotiorum、玉米小斑病菌 Cochlibolus heterostrophus、小麦茎基腐病菌Fusarium psedograminearum 和辣椒疫霉Phytophthora capsici，均由长江大学农学院植物病理学实验室提供。供试植物：小麦 Triticum aestivum 品种为“京双 16”，由湖北省农业科学院植保土肥研究所提供。蓖麻 Ricinus communisL.，由山东省淄博市农业科学院提供。1.3 目标化合物的合成中间体-氨基丁酸乙酯溶液的制备：称取1.15g-氨基丁酸乙酯盐酸盐于 100mL 圆底烧瓶中，加入 30mL 二氯甲烷超声溶解，再加入 3.5g三乙胺常温搅拌，反应 3h 后即可获得-氨基丁酸乙酯溶液。1.3.1目标化合物 3a 和 3b 的合成参考文献的方法15合成。称取 1.31g 大黄酸于 150mL 圆底烧瓶中，加入 50mL 二氯甲烷，充分搅拌溶解后加入 1mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，缓慢滴加1.26g 草酰氯，升温至 50 回流，反应 12h，用薄层色谱(TLC,V(石油醚):V(乙酸乙酯)=4:1)监测至反应完毕，旋转蒸发后得到中间体 1 用于下一步反应。向化合物 1 中加入 15mL 二氯甲烷，使其完全溶解。在冰浴条件下，将-氨基丁酸乙酯溶液转移至恒压滴液漏斗中，缓慢滴加到反应液中，室温反应 2h。减压浓缩，加入二氯甲烷 100mL 溶解并用饱和氯化钠水溶液洗涤 3 次，有机相用无水硫酸钠干燥后，抽滤，旋转蒸发除去溶剂，通过柱层析(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=8:1)分离纯化，得到目标化合物 3a(4-乙氧羰基-2-丁基氨基大黄酸酰胺，简称-氨基丁酸-大黄酸乙酯)。称取 1.0g 化合物 3a 于 150mL 圆底烧瓶中，加入 1,4-二氧六环(1,4-dioxane)50mL，常温充分搅拌溶解，缓慢滴加 0.38g 氢氧化锂溶于 5mL 水的溶液，室温搅拌 14h(反应液由黄色变为红褐OOHOOHOHOOHOHOOOOOOOOOOOOOHOOOOOClOOONH2OOOOHNOOOOOOOOOHNOOHOCH2Cl2CH3OHCH3IN,N-dimethylformamideLiOHCH3CH2OHLiOH1,4-dioxane大黄酸RheinABCD4a4bSOCl2SOCl2图式 2 目标化合物 4a 和 4b 的合成线路Scheme 2 Synthesis routes of target compounds 4a and 4b810农药学学报Vol.25色)，用 TLC(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=6:1)监测至反应完毕。滴加稀盐酸调节 pH 至 5.0，析出固体后抽滤，加入二氯甲烷 50mL 溶解并用饱和氯化钠溶液洗涤 3 次，有机相用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋转蒸发除去溶剂，烘干得到目标化合物 3b(4-羧基-2-丁基氨基大黄酸酰胺，简称-氨基丁酸-大黄酸)。1.3.2目标化合物 4a 和 4b 的合成参考文献的方法15制备，称取 1.47g 大黄酸于 250mL 圆底烧瓶中，加入 80mL 无水甲醇充分溶解后，室温下缓慢滴加 5mL 二氯亚砜，升温至回流，反应24h。TLC(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=4:1)监测至反应完毕。将反应液倒入 500mL 冷水中充分搅拌，析出黄色固体，抽滤，烘干后得到中间体 A。称取 1.43g 中间体 A 于 250mL 圆底烧瓶中，加入 80mLDMF 溶解。冰浴条件下，加入 0.32g氢氧化钠，搅拌 10min，缓慢滴加8.4g 碘甲烷，升温至回流反应 1h，TLC(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=4:1)监测至反应完毕。向反应液中缓慢滴加稀盐酸，调节溶液 pH 至 7.0，加水搅拌 10min，抽滤，烘干，得到中间体 B。称取 1.85g 中间体 B 于 150mL 圆底烧瓶中，加入 30mL 乙醇充分溶解后，称取 0.32g 氢氧化钠溶解于 30mL 水中，将其缓慢滴加入反应液中，室温搅拌反应 1h，TLC(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=6:1)监测至反应完毕。缓慢滴加稀盐酸于反应液中，调节 pH 至 3.0，加水逐渐有固体析出，抽滤，将固体用甲醇溶解，减压浓缩，烘干，得到中间体 C(甲氧基大黄酸)。称取 1.47g 中间体 C 于 150mL 圆底烧瓶中，加入 50mL 二氯甲烷充分溶解后，加入 1mLDMF，缓慢滴加 1.28g 草酰氯，升温至 50 回流，反应 10h，TLC(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=4:1)监测至反应完毕。旋转蒸发除去溶剂后加入30mL 二氯甲烷，使其完全溶解。冰浴条件下，将-氨基丁酸乙酯溶液缓慢滴加到圆底烧瓶反应液中，室温反应 2h。TLC(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=4:1)监测至反应完毕。减压浓缩，加入二氯甲烷 100mL 溶解并用饱和氯化钠水溶液洗涤3 次，有机相用无水硫酸钠干燥后，抽滤，旋转蒸发除去溶剂，用柱层析(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=8:1)分离纯化，得到目标化合物 4a(4-乙氧羰基-2-丁基氨基-4,5-二甲氧基大黄酸酰胺，简称-氨基丁酸-甲氧基大黄酸乙酯)。称取 1.1g 化合物 4a 于 150mL 圆底烧瓶中，加入 50mL1,4-二氧六环常温充分搅拌溶解，再称取 0.15g 氢氧化锂溶解于 5mL 水中，将氢氧化锂水溶液缓慢加入反应体系中，室温搅拌 7h 后，反应液由黄色变为红褐色，TLC(V(石油醚):V(乙酸乙酯)=6:1)监测至反应完毕。滴加稀盐酸调节 pH 至 5.0，析出固体后抽滤，加入二氯甲烷50mL 溶解并用饱和氯化钠溶液洗涤 3 次，有机相用无水硫酸钠干燥后，抽滤，旋转蒸发除去溶剂，烘干得到目标化合物 4b(4-羧基-2-丁基氨基-4,5-二甲氧基大黄酸酰胺，简称-氨基丁酸-甲氧基大黄酸)。1.4 生物活性测定方法1.4.1离体抑菌活性测定方法采用菌丝生长速率法22测定 4 个目标化合物对 6 种植物病原真菌的离体抑菌活性。称量对应质量的目标化合物，用 1mL 二甲基亚砜(DMSO)溶解，然后使用含有 0.2%吐温 80 的双蒸水定容至 50mL，备用。向 PDA 培养基中加入等体积的供试药液，充分混匀(各组分终浓度：供试药剂为 0.2mmol/L 或0.5mmol/L，DMSO 为 1%，吐温 80 约为 0.1%)后制成含药平板(=90mm)。以大黄酸为对照药剂，以含 1%DMSO 和 0.1%吐温 80 的双蒸水处理为空白对照。使用直径为 6mm 的打孔器在活化菌培养基上制备菌饼，接种至含供试药剂的培养基中央，28 黑暗培养 72h。每处理设置 3 次生物学重复。采用十字交叉法测量菌落直径。按公式（1）计算各处理药剂对供试病原菌的菌丝增长抑制率（I）。I/%=(DCKDPT)/(DCK6 mm)100(1)式中：DCK为空白对照 PDA 培养基上菌丝平均直径，mm；DPT为处理后 PDA 培养基上菌丝平均直径，mm。1.4.2诱导抗性相关酶活性测定方法参考文献方法23进行。以大黄酸和 DL-氨基丁酸为对照药剂，以含 1%DMSO 及 0.1%吐温 80 的无菌水作为空白对照，供试药剂的浓度为 10mmol/L。称量对应质量的目标化合物，用 5mLDMSO 溶解后，使用含有 0.5%吐温 80 的双蒸水稀释至500mL，备用。采用叶面喷雾的方式对抽穗期小麦进行喷雾处理。每 20 株为一组处理，每处理设置 3 次重复。分别在施药 1、3、5、7 和 9d 后采No.4胡慈银等:-氨基丁酸-大黄酸耦合物的合成、生物活性及韧皮部传导性811集小麦旗叶，用液氮速冻后放入80 冰箱备用。分别使用 PAL 活性检测试剂盒和 POD 活性检测试剂盒按照说明书以 96 孔板法测定 PAL 和POD 活性。1.4.3目标化合物韧皮部传导性测定方法参考文献 24-25 的方法，采用蓖麻幼苗体系测定目标化合物的韧皮部传导性。以 L 型缬氨酸-申嗪霉素耦合物(L-Val-PCA)为对照药剂，设置供试药剂浓度为 0.2mmol/L。首先将蓖麻种子置于自来水中在室温下浸泡过夜，27C 催芽 48h。挑选发芽一致的种子播种于蛭石内培养 72h，培养条件：温度 27C、相对湿度 80%。挑选 16 株长势一致的幼苗(下胚轴长约 25mm、胚乳直径约 20mm)剥除胚乳洗净，将子叶浸泡于 MES 缓冲液(20mmol/LMES、0.25mmol/LMgCl2和 0.5mmol/LCaCl2，pH5.6)、胚根于 0.5mmol/LCaCl2溶液中同时预孵育 2h。用刀片在距离子叶同胚轴交际处约 20mm的弯钩处小心切断，然后向 MES 缓冲液中补充供试药剂使其终浓度为 0.2mmol/L26。每隔 1h 于切口处收集韧皮部渗出液，连续收集 5h。使用双蒸水对收集的渗出液按照 V(双蒸水):V(渗出液)=2:1 的比例进行稀释，用 0.22m 滤膜过滤，高效液相色谱(HPLC)检测。每处理设置 3 次重复。化合物 3b 色谱检测条件：色谱柱为 VenusilXBPC18反相色谱柱(4.6mm250mm，5m)，柱温为 35，流动相为 V 甲醇(A):V0.1%甲酸水(B)=70:30，流速为 0.9mL/min，检测器检测波长为 229nm，进样量为 10L。化合物 4b 色谱检测条件与 3b 基本一致，色谱柱为 VenusilXBPC18反相色谱柱(4.6mm250mm，5m)，柱温为 35，流动相为 V 甲醇(A):V0.1%甲酸水溶液(B)=65:35，流速为 0.8mL/min，检测器检测波长为 226nm，进样量为 10L。2 结果与分析 2.1 目标化合物的物理性质及结构表征4-乙氧羰基-2-丁基氨基大黄酸酰胺(3a)：黄色固体，收率 72.7%，m.p.201203C.1HNMR(400MHz,CDCl3)12.04(s,1H),12.00(s,1H),8.12(d,J=1.6Hz,1H),7.88(dd,J=7.6,1.2Hz,1H),7.777.69(m,2H),7.34(dd,J=8.4,1.2Hz,1H),4.20(qd,J=7.2,1.2Hz,2H),2.66(qd,J=16.0,5.2Hz,2H),1.38(d,J=6.8Hz,3H),1.30(t,J=7.2Hz,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-d6)192.02,181.69,171.18,163.77,161.86,161.57,142.30,138.03,134.12,133.85,125.02,122.94,119.92,118.13,118.04,116.65,60.38,43.35,40.85,20.58,14.55.HRMS,计算值C21H19NO7M+H+:398.1234,实测值398.1239.4-羧基-2-丁基氨基大黄酸酰胺(3b)：黄色固体，收率81.5%，m.p.234235.1HNMR(400MHz,DMSO-d6)12.25(s,1H),11.89(d,J=3.6Hz,2H),8.78(d,J=8.0Hz,1H),8.11(d,J=1.6Hz,1H),7.877.78(m,1H),7.777.70(m,2H),7.437.37(m,1H),4.414.31(m,1H),2.61(dd,J=15.6,7.2Hz,1H),2.45(dd,J=15.6,7.2Hz,1H),1.21(d,J=6.4Hz,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-d6)191.98,181.61,172.85,163.63,161.84,161.57,142.30,138.03,134.04,133.78,125.00,122.95,119.91,118.08,118.02,116.56,43.31,40.85,20.62.HRMS,计算值C19H15NO7M+H+:370.0921,实测值370.0924.4-乙氧羰基-2-丁基氨基-4,5-二甲氧基大黄酸酰胺(4a)：黄色固体，收率 83.7%，m.p.157158.1HNMR(400MHz,CDCl3)8.03(d,J=1.2Hz,1H),7.88(d,J=1.2Hz,1H),7.83(d,J=7.6Hz,1H),7.65(t,J=8.0Hz,1H),7.31(d,J=8.4Hz,1H),7.19(d,J=8.4Hz,1H),4.654.52(m,1H),4.19(q,J=7.2Hz,2H),4.06(s,3H),4.00(s,3H),2.732.60(m,2H),1.38(d,J=6.8Hz,3H),1.29(t,J=7.2Hz,3H).13CNMR(101MHz,CDCl3)183.52,182.27,171.66,164.48,159.98,159.59,139.15,134.83,134.56,134.19,125.67,123.84,119.03,118.30,117.30,115.47,60.89,56.80,56.55,42.89,39.77,20.03,14.23.HRMS,计算值C23H23NO7M+H+:426.1547,实测值426.1554.4-羧基-2-丁基氨基-4,5-二甲氧基大黄酸酰胺(4b)：黄色固体，收率 53.5%，m.p.205206.1HNMR(400MHz,DMSO-d6)8.78(d,J=7.6Hz,1H),8.15(d,J=1.2Hz,1H),7.85(d,J=1.2Hz,1H),7.817.68(m,2H),7.597.52(m,1H),4.38(dt,J=14.0,7.0Hz,1H),3.98(s,3H),3.92(s,3H),2.62(dd,J=15.6,7.0Hz,1H),2.482.41(m,1H),1.22(d,J=6.4Hz,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-d6)183.47,181.44,172.89,164.17,159.21(2C),139.75,134.93,134.65,134.56,125.51,123.89,119.50,118.66,117.53,117.18,56.97,56.82,43.31,40.94,20.69.HRMS,计算值C21H19NO7M+H+:398.1234,实测值398.1236.2.2 目标化合物的生物活性2.2.1离体抑菌活性测定结果(表 1)显示：在药剂浓度为 0.2mmol/L 时，目标化合物 3b 对水稻纹枯病菌(抑制率 40.2%)和油菜菌核病菌(41.6%)的抑制作用优于对照药剂大黄酸(28.5%和 24.0%)。当药剂浓度调整为 0.5mmol/L 时，化合物 3b 对水稻纹枯病菌(62.6%)和小麦赤霉病菌(41.3%)的抑制作用优于对照药剂大黄酸。此外，化合物 4b 对812农药学学报Vol.25水稻纹枯病菌(53.5%)和小麦赤霉病菌(40.2%)的抑制作用也优于对照药剂大黄酸。表明在 0.5mmol/L时化合物 3b 和 4b 对水稻纹枯病菌和小麦赤霉病菌均具有较好的抑制作用。2.2.2诱导抗性如图 1A 所示，在药剂供试浓度为 10mmol/L 时，使用大黄酸处理小麦叶片 1、3、5、7 和 9d 后，同 CK 相比 PAL 活性变化无显著性差异。使用 BABA 处理后的 1、5 和 7d 后，酶活性变化同 CK 相比显著增高，其中，处理 3d后 PAL 活性极显著增高。但在 BABA 处理 9d后，PAL 活性同 CK 相比无显著性差异。使用化合物 3b 处理小麦叶片后，仅在第 3 天检测到 PAL活性呈显著上升，其他时间同 CK 相比 PAL 活性变化无显著性差异。化合物 4b 处理小麦叶片 1、5 和 7d 后，酶活性变化同 CK 相比显著增高，其中，在处理 3d 后 PAL 活性呈极显著增高。如图 1B 所示，对于 POD 活性来说，使用大黄酸处理小麦叶片 1 和 3d 后，同 CK 相比酶活性变化无显著性差异。处理 5d 后 POD 活性极显著降低，处理 7d 后酶活性变化同 CK 相比无显著性差异，处理 9d 后，同对照相比 POD 活性变化又显著降低。使用 BABA 处理小麦 1、3、5、7 和 9d 后，POD 活性同 CK 相比显著上升。然而，在化合物3b 处理小麦叶片后的任意时间段，POD 活性同CK 相比都无显著性差异。使用化合物 4b 处理小麦 1d 后 POD 活性无显著性变化，处理 3 和 5d后活性显著上升，但在 7d 后活性无显著性变化，甚至在第 9 天后 POD 活性出现显著下降。使用化合物 4b 处理小麦叶片后 PAL 和 POD 的活性变化趋势与激活剂 BABA 基本一致表明 4b 可能在诱表 1 目标化合物对 6 种植物病原菌菌丝生长的抑制作用Table 1 Inhibition of target compounds against six pathogens in vitro化合物Compd.浓度Concentration/(mmol/L)抑制率Inhibitionrate/%水稻纹枯病菌R.solani小麦赤霉病菌F.graminearum油菜菌核病菌S.sclerotiorum玉米小斑病菌C.heterostrophus小麦茎基腐病菌F.pseudograminearum辣椒疫霉P.capsici3a0.235.71.514.50.521.40.518.00.518.40.325.90.50.557.83.131.51.337.60.842.22.434.51.542.71.53b0.240.21.421.00.441.61.513.80.429.81.428.41.10.562.63.841.31.563.73.034.82.146.92.552.93.44a0.224.71.414.30.415.90.414.30.413.10.40.542.52.632.61.233.80.817.50.534.32.432.21.54b0.227.10.517.30.315.40.613.10.319.70.50.553.52.340.22.539.31.825.40.832.70.748.12.5Rhein0.228.51.617.30.624.01.519.31.124.20.933.21.80.547.73.134.21.441.42.236.31.244.32.649.22.7注：每个处理重复 3 次(平均值标准差)；“”代表活性低于 10%。Note:Eachtreatmenthadthreereplicates(MeanSD).meansthattheactivityislessthan10%.10306090120A*3时间 Time/dPAL 酶活性PAL enzyme activity/(U/g)5791030 00060 00090 000120 000B*3时间 Time/dPOD 酶活性POD enzyme activity/(U/g)579CKRheinBABACKRheinBABA3b4b3b4bA：PAL；B：POD图 1 不同化合物(Rhein、BABA、3 3b b 和 4b4b)处理小麦植株后的酶活性检测(*:P 0.05,*:P 0.01,*:P 0.001)Fig.1 Detection of the enzyme activity after the treatment of wheat leaves by the different compounds(Rhein,BABA,3 3b b 和4b4b)(*:P 0.05,*:P 0.01,*:P 0.001).No.4胡慈银等:-氨基丁酸-大黄酸耦合物的合成、生物活性及韧皮部传导性813导植物产生抗病性方面发挥重要作用。2.3 目标化合物的韧皮部传导性蓖麻幼苗体系检测供试化合物的韧皮部传导性发现：在蓖麻韧皮部渗出液中未检测到大黄酸、化合物 3a 和 4a，说明三者不具备韧皮部传导性。对照药剂 L-Val-PCA 在蓖麻幼苗韧皮部渗出液中的浓度为 26.9mol/L。HPLC测试目标化合物 3b 和 4b 的韧皮部渗出液浓度分别为 1.7 和15.1mol/L(图 2)，说明二者具有韧皮部传导性。化合物 3b 标准溶液的峰面积与浓度之间的回归方程为 y=11.5041x+2.1869，相关系数为 r=0.9998；化合物 4b 的回归方程为 y=22.7776x+7.6147，相关系数为 r=0.9999；对照样品 L-Val-PCA 的回归方程为 y=0.1181x+5.6624，相关系数为 r=0.9987。3 讨论与结论以天然产物为先导化合物进行结构改造，通过耦合植物内源物质如糖或氨基酸的方式来增加母体的韧皮部传导能力，是改善农药内吸性的有效手段之一。Yu 等27以 PCA 为先导化合物合成了一系列氨基酸-申嗪霉素耦合物，其中，L-Val-PCA不仅保留了部分对水稻纹枯病菌的抑菌活性，而且具有良好的韧皮部传导性。本研究以大黄酸为先导化合物，以 BABA 为导向基团，合成了 4 个BABA-大黄酸耦合物，其中化合物 3b 和 4b 在0.5mmol/L 时对水稻纹枯病菌和小麦赤霉病菌的抑制效果优于对照大黄酸。这说明以植物次生代谢物质为导向基团对天然产物进行结构改造具有可行性。虽然 4b 对水稻纹枯病菌的生长抑制作用(53.5%)低于 3b(62.6%)，但从诱导抗性检测结果来看，在使用化合物 4b 处理小麦叶片后近一周的时间内，PAL 和 POD 一直保持较高活性，诱导效果强于 3b。从蓖麻幼苗韧皮部渗出液中检测到的浓度来看，4b 的韧皮部传导能力(韧皮部渗出液中含量 15.1mol/L)远大于 3b(1.7mol/L)，说明将大黄酸的羟基基团改变为甲氧基基团能够提高其自身的诱导抗性及韧皮部传导能力。此外，蓖麻幼苗作为一种模式植物被广泛用于定性、定量地检测农药的韧皮部传导性26。开发具有韧皮部传导性的农药可实现药剂被叶片吸收之后向下输导，有利于对维管束病害的防治。本研究发现，在供试化合物浓度为 0.5mmol/L 时，除了 3b 和00102030A9.133510时间 Time/min信号 Signal/mAU152000102030B6.373510时间 Time/min信号 Signal/mAU152000102030C9.168510时间 Time/min信号 Signal/mAU152000102030D6.448510时间 Time/min信号 Signal/mAU1520A：3b 标准样品；B：4b 标准样品；C：3b 韧皮部渗出液样品；D：4b 韧皮部渗出液样品。A:3bstandardsample;B:4bstandardsample;C:phloemsapsampleof3b;D:phloemsapsampleof4b.图 2 HPLC 测试目标化合物 3b 和 4b 的韧皮部传导性Fig.2 HPLC test of the phloem translocation of target compounds 3b and 4b814农药学学报Vol.254b 对水稻纹枯病菌和小麦赤霉病菌的抑制效果优于对照大黄酸外，其他化合物对 6 种供试植物病原菌的抑菌效果并不明显，甚至低于大黄酸。Kleier等28曾指出，前体农药(pro-pesticide)往往不能兼具良好的“生物活性”和“韧皮部传导性”，这种现象在合成的糖基-氟虫腈耦合物29、拌种咯衍生物30-31和氨基酸-申嗪霉素耦合物27,32中也有报道。Yang 等29采用 D-葡萄糖-氟虫腈耦合物处理4 叶期蓖麻幼苗子叶，待其吸收 7h 后，通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用仪检测发现，蓖麻幼苗韧皮部渗出液中该耦合物的浓度可达90mol/L，但同时发现，耦合物对 3 龄小菜蛾 Plutella xylostella幼虫的 LC50值(167.28mg/L)显著高于对照氟虫腈(21.39mg/L)。待 D-葡萄糖-氟虫腈耦合物经蓖麻成株叶片吸收 4872h 后，通过 HPLC-MS 检测其在根部和下端茎中的含量发现，该耦合物可发生降解作用，从而将先导化合物氟虫腈释放出来，发挥杀虫作用，实现防控效果。-氨基丁酸-大黄酸耦合物是否存在水解作用以及如何保持较高的生物活性，并能拥有良好的韧皮部传导性有待进一步研究。本研究以天然产物大黄酸为先导化合物，以BABA 为导向基团，合成了 4 个目标化合物，且4 个目标化合物均保留了先导化合物的部分抑菌活性。BABA 是一种植物次生代谢产物。作为非蛋白氨基酸，其自身具有诱导植物产生抗性且能在植物体内传导等性质，在农药分子中引入该基团，既能保留农药本身的活性，又能赋予耦合物传导性和诱导抗性，这对于内吸传导型诱抗杀菌剂的分子设计具有重要意义。参考文献(References):邵旭升,杜少卿,李忠,等.中国绿色农药的研究和发展J.世界农药,2020,42(4):16-24.SHAOXS,DUSQ,LIZ,etal.ResearchanddevelopmentofgreenpesticidesinChinaJ.WorldPestic,2020,42(4):16-24.1CHENGD,FENGMX,JIYF,etal.EffectsofcelangulinIVandVfromCelastrus angulatusmaximonNa+/K+-ATPaseactivitiesoftheorientalarmyworm(Lepidoptera:Noctuidae)J.JInsectSci,2016,16(1):59.2SU J J,ZHOU Q,ZHANG