rAAV5阴离子交换层析工艺的开发.pdf

doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2023.04.107rAAV5 阴离子交换层析工艺的开发许 琳1,梁欢欢1,李红英2,韩 旭2,戴柳冰2,马 超2,朱 涛1,2(1.天津科技大学 生物工程学院,天津 300457;2.康希诺生物股份公司,天津 300000)摘 要 建立一种有效提高重组 5 型腺相关病毒(rAAV5)实心载体比率的阴离子交换层析的纯化方法。对亲和层析捕获的 rAAV5 样品,使用多种阴离子交换层析柱进行离子强度线性梯度洗脱,CIMmultus QA(CIMQ)层析柱能够有效分离不含目的基因组的病毒(病毒空颗粒)和含目的基因组的病毒(实心载体)。基于 CIMQ 层析柱,进行纯化缓冲液体系、紫外目标峰收集范围的优化。通过 qPCR 检测病毒基因组(Vg)含量计算回收率,高效液相色谱法(HPLC)或体积排阻色谱-多角度静态光散射技术(SEC-MALS)测定实心载体比率。使用 Tris,Na2HPO4,pH 8.0 缓冲体系,洗脱时收集紫外吸收值 UV260/UV280比值大于 1 的部分,收集的样品实心载体比率达到 80.3%。成功建立一种简单方便的阴离子交换层析方法,能去除 rAAV5 样品中的病毒空颗粒,使实心载体比率达到基因治疗临床产品要求。关键词 rAAV5;阴离子交换层析;实心载体比率;回收率;纯化中图分类号 TQ425文献标识码 B文章编号 2095-1736(2023)04-0107-07Development of rAAV5 anion exchange chromatography processXU Lin1,LIANG Huanhuan1,LI Hongying2,HAN Xu2,DAI Liubing2,MA Chao2,ZHU Tao1,2 1.College of Bioengineering Tianjin University of Science and Technology Tianjin 300457 China 2.Cansino Biologics Inc.Tianjin 300000 China Abstract A purification method was established for effectively increasing the proportion between vector capsids of rAAV5-a viral prod-uct containing the therapeutic DNA sequence and empty capsids viral vectors lacking the therapeutic gene.For the rAAV5 samples obtained from affinity chromatography several anion exchange chromatography and related gradient elution methods were tested in which CIMmultus QA CIMQ can effectively remove empty capsids from vector capsids.For the CIMQ purification the buffer matrix and the collection of rAAV5 fractions were optimized.Subsequently qPCR was used to quantify the recovery rate of the virus genome Vg content and high-performance liquid chromatography HPLC or size exclusion chromatography-multi-angle static light scattering SEC-MALS was used to determine the vector capsids proportion of rAAV5 samples.In the CIMQ purification process the proportion of vector capsids in the collected fraction at UV absorbance UV260/UV280 greater than 1 eluted with Tris-Na2HPO4 buffer at pH 8.0 reached 80.3%.A simple and convenient method using anion exchange chromatography was successfully established which can effec-tively eliminate empty capsids of rAAV5 from vector capsids so that vector capsids proportion can meet the requirements of clinical ap-plication of gene therapy.Keywords rAAV5 anion exchange chromatography vector capsids proportion recovery purification腺相关病毒(Adeno-Associated Virus,AAV)最早于 20 世 纪 60 年 代 在 实 验 室 腺 病 毒 制 剂 中 发现1-2,随后不久在人体中发现3。AAV 是一类无包膜、直径 20 26 nm 的二十面体结构,含有 4.7 kb的单链 DNA 基因组,属于细小病毒家族4-6。由于其安全性好、宿主范围广(分裂和非分裂细胞)、物理性质稳定,并且感染人体后不会导致任何生理或病理变化而成为基因治疗最具应用前景的载体之一7-8。目前,以 AAV 为载体成功用于临床基因治疗的药物有 3 种,即 Glybera(AAV1)、Luxturna(AAV2)701第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023收稿日期:2022-05-10;最后修回日期:2022-08-17基金项目:天津市自然科学基金项目(No.18JCQNJC09700)作者简介:许琳,硕士研究生,研究方向为基因治疗,E-mail:通信作者:朱涛,博士,教授,研究方向为疫苗及其他生物制品的开发,E-mail:tao.zhu 和 Zolgensma(AAV9)。不同的 AAV 血清型具有不同的组织趋向性,已被证明在肺、肌肉、大脑、脊髓、视网膜和肝脏等多种组织中可以进行长期有效的表达9-10。基因治疗产品的质量对临床药物的安全性至关重要。使用三质粒转染人胚肾细胞(HEK293)时,病毒包装成实心载体的过程往往是低效的,导致在生产制备过程中形成缺乏载体基因组的空颗粒11-12,病毒空颗粒被认为是最难以去除的杂质。Gao 等13研究表明去除 AAV 制剂中的病毒空颗粒会提高 AAV 在临床应用中的治疗效果和安全性。使用氯化铯梯度超速离心法纯化的 AAV 载体已被用于一些临床试验中,然而这些纯化方法并不容易工艺放大14。最近阴离子交换层析、阳离子交换层析和凝胶过滤层析被报道用于分离病毒空颗粒,然而这些方法主要是针对 AAV1-6、AAV8和 AAV915-17。本研究使用亲和捕获后的 rAAV5 样品,进行层析填料与层析柱的筛选,根据筛选结果作进一步纯化体系和方法的优化。最终可以得到符合产品质量要求的病毒载体,为 rAAV5 载体工业生产放大提供了一种方法。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病毒载体采用三质粒共转染的方式进行上游发酵,收获的发酵液需粗纯(裂解,酶解与澄清)去除杂质,然后进行亲和层析,但是亲和层析捕获的 rAAV5 样品中仍然含有大量的病毒空颗粒(一般在 70%95%),需进一步进行精纯优化,使得样品符合质量要求(实心载体比率大于 70%)。1.1.2 填料与层析柱 SOURCE 30Q(Cytiva 公司);Q ImpRes(Cytiva 公司);NanoQ-30L(苏州纳微科技有限公司);MC30-Q(苏州赛分科技股份有限公司);CIMmultus QA 层析柱(BIA Separations 公司);CIMQ AAV full/empty 0.1 mL analytical column(BIA Separations 公司)。1.1.3 主要仪器与试剂AKTA avant 150 层析系统(Cytiva 公司);新型 XP Cycler PCR 基因扩增仪(杭州博日科技股份有限公司);QuantStudio 3 荧光定量 PCR 仪(Thermo 公司);al-liance e2695 高效液相色谱仪(Waters 公司);Optilab 示差折光仪(Wyatt 公司);DAWN 18 角度静态光散射仪(Wyatt 公司);JEM-2010FEF 场发射透射电子显微镜(JEOL 公司);Elx808 酶标仪(BioTek 公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris,Angus Chemical Company);Bis-Tris propane(BTP,BBI);NaCl(天津市海光药业有限公司);Na2HPO4(天津市科密欧化学试剂有限公司);NaAC(四川金山制药有限公司);AAVpro Titration kit(for Real Time PCR)(TaKaRa 公 司);resDNASEQ Quantitative Human DNA Kit(Thermo 公司);PrepSEQTM Nucleic Acid Extraction Kit(Thermo 公司);PrepSEQTM Residual DNA Samplle Perparation kit(Thermo 公司);HEK 宿主细胞蛋白检测试剂盒(Cygnus Technologies公司)。1.2 方法1.2.1 阴离子交换层析柱筛选缓冲液配制:A 液:20 mmol/L Tris,pH 9.0;B 液:20 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,pH 9.0。使用直径约 16 mm 柱管,对 SOURCE 30Q、Q ImpRes、NanoQ-30L、MC30-Q 等 4 种阴离子层析填料进行装柱,高度均为 0.8 cm,CIMQ 为 1 mL 阴离子交换层析柱。层析过程:(1)平衡:90%A 液,10%B 液,流速 4 mL/min 进行柱平衡;(2)上样:流速 4 mL/min;(3)再平衡:90%A液,10%B 液,流速 4 mL/min 进行柱平衡;(4)洗脱:10%100%B 液,200 个柱体积,进行离子强度线性梯度洗脱,流速 4 mL/min;(5)清洗:2 mol/L NaCl,流速4 mL/min,进行柱清洗。根据病毒基因组(Vg)含量和实心载体比率检测结果,初步筛选出表现良好的阴离子交换层析柱。1.2.2 CIMQ 层析柱工艺优化(1)纯化缓冲体系的筛选。使用 UNICORN 7.6 软件中的交互过程模型,采用全因子混合设计方案,根据不同缓冲体系,设计方案包含 2 个中心点(实验编号7、8),8 个实验,筛选出重要的影响因素,实验方案见表 1。表1 中缓冲体系的配制:Na2HPO4缓冲体系 A 液:10 mmol/L BTP,5 mmol/L Na2HPO4,B 液:10 mmol/L BTP,65 mmol/L Na2HPO4;NaAC 缓 冲 体 系 A 液:10 mmol/L BTP,5 mmol/L NaAC,B 液:10 mmol/L BTP,185 mmol/L NaAC;NaCl 缓 冲 体 系 A 液:10 mmol/L BTP,5 mmol/L NaCl,B 液:10 mmol/L BTP,185 mmol/L NaCl。所有缓冲体系按照表 1 调节至所需 pH。层析过程:使用平衡液 90%A 液,10%B 液进行柱平衡,样品上样流速 2 mL/min,平衡后使用3%100%B 液,200 个柱体积,进行离子强度线性梯度洗 脱,流 速 4 mL/min,使 用 2 mol/L NaCl,流 速4 mL/min 进行柱清洗。基于峰宽和峰距,根据公式分辨率 RS=2(V2-V1)/(W1+W2)计算病毒空颗粒和实心载体峰的分辨率。其中,V1、V2分别为病毒空颗粒和实心载体洗脱峰最高点对应的体积;W1、W2为相邻两峰的峰宽。以病毒空颗粒和实心载体峰的分辨率作为响应值,根据Mixed Logistic Regression(MLR)混合逻辑回归模型,分析预测合适的层析缓冲体系。801第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023表 1 全因子混合设计方案及实验结果Table 1 Full factorial mixed design scheme and experimental results编号Number缓冲体系Buffering system分辨率Resolution1NaCl,pH 8.00.522Na2HPO4,pH 8.00.643NaAC,pH 8.00.684NaCl,pH 10.00.585Na2HPO4,pH 10.00.626NaAC,pH 10.00.567Na2HPO4,pH 9.00.648Na2HPO4,pH 9.00.65 (2)目标峰收集范围优化。为提高分离效果,洗脱时将离子强度线性梯度调整为 10%60%B 液。缓冲液配制:A1 液:10 mmol/L BTP;B1 液:10 mmol/L BTP,50 mmol/L Na2HPO4;B2 液:10 mmol/L BTP,150 mmol/L NaAC。以 上 缓 冲 液 pH 值 均 为 8.0。Na2HPO4缓冲体系层析过程:使用平衡液 90%A1 液,10%B1 液,流速 4 mL/min 进行柱平衡,样品上样流速2 mL/min,平衡后使用 10%60%B1 液,200 个柱体积,进行离子强度线性梯度洗脱,流速 4 mL/min,设置收集器 0.8 mL/管收集目标峰,使用 2 mol/L NaCl,流速 4 mL/min 进行柱清洗。针对 NaAC 缓冲体系使用相同过程进行层析。所收集目标峰根据峰面积 UV260/UV280和实心载体比率检测结果确定最终收集范围。(3)纯化缓冲液体系优化。缓冲液配制:A1 液:10 mmol/L BTP;B1 液:10 mmol/L BTP,50 mmol/L Na2HPO4;B2 液:10 mmol/L BTP,150 mmol/L NaAC;A2 液:20 mmol/L Tris;B3 液:20 mmol/L Tris,50 mmol/L Na2HPO4。以上缓冲液 pH 值均为 8.0。BTP、Na2HPO4缓冲体系层析过程:使用平衡液 90%A1 液,10%B1 液进行柱平衡,样品上样流速 2 mL/min,平衡后使用10%60%B1 液,200 个柱体积,进行离子强度线性梯度洗脱,流速 4 mL/min;BTP、NaAC 缓冲体系,Tris、Na2HPO4缓冲体系使用相同的过程进行层析。1.2.3 rAAV5 Vg 含量检测、实心载体比率检测、杂质残留检测以及电镜观察 纯化后的样品用 DNase I 消化去除宿主细胞核酸(HCD)残留和质粒转染相关的游离核酸,然后使用裂解液使病毒的衣壳蛋白变性,完成简单的目的病毒基因组提取后,利用 qPCR 对病毒基因组进行定量。实心载体比率通过高效液相色谱系统,采用 CIMac AAV分析柱来定量 AAV 实心载体比率,或运用尺寸排阻色谱(SEC)与多角度散射(MALS)相结合,检测 rAAV 实心载体比率。HCD 残留和质粒 DNA(pDNA)残留检测,从纯化后的样品中提取残留 DNA,使用相应的引物,采用 qPCR 技术检测 HCD 和 pDNA。宿主细胞蛋白(HCP)是使用双抗体夹心法测定 HEK293 宿主细胞中蛋白残留水平。最后利用透射电镜观察纯化后rAAV 病毒的形态和颗粒完整性。2 结果与分析2.1 阴离子交换层析柱筛选rAAV5 实心载体衣壳内含有完整的病毒载体基因组,而病毒空颗粒衣壳内缺乏病毒基因组,两者之间的电荷差异微弱,需选择分辨率相对较高的,填料粒径相对较小(约 30 m)的填料,或者选择 CIMQ 整体柱(通道孔径约 6 m),进行阴离子交换层析柱的筛选。实心载体因含有完整的病毒载体基因组,在纯化图谱中表现出相对较高的 UV260紫外吸收峰,而病毒空颗粒在纯化图谱中会显示相对较高的衣壳蛋白 UV280吸收峰。基于两者在纯化图谱中的紫外吸收峰差异,如图 1 所示,当 UV260UV280时,收集实心载体(洗脱 2)样品。层析图谱,CIMQ 层析柱具有较好分离病毒空颗粒与实心载体的效果图 1(e)。将收集的样品进行 Vg 和实心载体比率检测(HPLC 法),检测结果见表 2。结果显示,使用 4 种阴离子填料进行离子强度线性梯度洗脱所收集的实心载体洗脱液中,实心载体比率相对较低,不能 有 效 分 离 病 毒 空 颗 粒 与 实 心 载 体,这 与图 1(a)(d)的结果是一致的。相比之下,CIMQ 层析柱分离 rAAV5 空颗粒和实心载体的效果相对较好,实心载体比率最高。2.2 CIMQ 层析柱工艺优化2.2.1 纯化缓冲体系筛选为进一步提高 CIMQ 层析柱的回收率和实心载体比率,需对纯化缓冲体系进行筛选,使用软件进行交互过程模型中的全因子混合方案设计,实验结束后,根据公式计算不同缓冲体系纯化图谱中,实心载体和病毒空颗粒洗脱峰的分辨率 Rs,将分辨率 Rs 作为响应值,实验方案及结果如表 1,中心点(实验编号 7、8)的平行实验,分辨率差别很小,表明实验误差较小。同时,根据响应值结果,显示该模型 R2(拟合度衡量标准0.75)为0.986,Q2(模型预测能力0.5)为 0.895,模型效度(标准0.25,模型缺乏数据则低)为 0.682,重现性(标准0.75,比较重复点的变异和整体变异)为 0.982,显示本模型中数据拟合程度较高,模型有较佳的预测能力。图 2 纵坐标显示传递函数的系数,相对 NaCl 缓冲体系,Na2HPO4 缓冲体系的系数是显著的,可以将Na2HPO4 缓冲体系作为首选,pH 为表 1 中缓冲体系的pH 值,pHSalt(Na2HPO4)的系数为负值,表示在选用Na2HPO4缓冲体系时,pH 值相对越低,病毒空颗粒和实心载体的洗脱峰的分辨率越高;pHSalt(NaAC)的系数为负值,表示 pH 值相对越低,洗脱峰的分辨率越901第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023高,而 pHSalt(NaCl)的系数为正值,表示 pH 值相对越高,洗脱峰的分辨率越高。(a)SOURCE 30Q;(b)Q ImpRes;(c)NanoQ-30L;(d)MC30-Q;(e)CIMQ monolithic chromatography columns。图 1 阴离子交换层析离子强度线性梯度洗脱层析图谱Figure 1 Linear gradient elution chromatography profile of ion intensity for anion exchange chromatography表 2 层析样品 Vg 回收率和实心载体比率检测结果Table 2 Chromatography sample Vg recovery and vector capsids proportion test results样品名称Sample name上样浓度Concentration/(vg/mL)洗脱样品浓度Concentration/(vg/mL)上样体积Volume/mL洗脱样品体积Volume/mL总 Vg xsTotal Vg xs回收率Recovery/%实心载体比率Vector capsidsproportion/%SOURCE 30Q 洗脱 22.33E+128.34E+107.947.7(3.980.23)E+12b2255.9Q ImpRes 洗脱 22.33E+129.70E+107.937.3(3.620.13)E+12b2035.1NanoQ-30L 洗脱 22.33E+124.29E+107.9105.1(4.510.25)E+12b2544.9MC30Q 洗脱 22.33E+121.50E+117.952.3(7.850.77)E+12a4357.0CIMQ 洗脱 22.33E+122.75E+114.915.5(4.260.41)E+12b3790.5 注:不同小写字母表示差异显著(P UV280时收集实心载体目标峰,0.8 mL/管收集,直到紫外吸收曲线 UV260和 UV280出现交叉时停止收集。经 SEC-MALS 检测,结果见表 4,在 Na2HPO4和 NaAC 两种缓冲体系中,当峰面积 UV260/UV280比值大于 1.15 时,实心载体比率大于 75%,考虑到临床产品要求实心载体比率需大于70%,以及生产工艺的便捷性,可以从实心载体洗脱峰UV260和 UV280紫外吸收交叉点开始收集,即当 UV260 UV280时,立即收集样品,而洗脱峰尾部 CIMQ 洗脱 7图 3(a),CIMQ 洗脱 6图 3(b)的实心载体比率均大于 90%,直到紫外吸收曲线 UV260和 UV280出现交叉时,停止收集样品。即洗脱时收集紫外吸收值UV260/UV280的比值大于 1 的部分。表 4 实心载体比率检测结果Table 4 Vector capsids proportion test results样品名称Sample name峰面积UV260/280Peak areaUV260/280实心载体比率Vector capsidsproportion/%CIMQ 上样-19.0CIMQ 洗脱 1(BTP、Na2HPO4)1.1575.1CIMQ 洗脱 2(BTP、Na2HPO4)1.2588.5CIMQ 洗脱 3(BTP、Na2HPO4)1.2897.8CIMQ 洗脱 4(BTP、Na2HPO4)1.2998.7CIMQ 洗脱 5(BTP、Na2HPO4)1.28100.3CIMQ 洗脱 6(BTP、Na2HPO4)1.28103.1CIMQ 洗脱 7(BTP、Na2HPO4)1.25100.4CIMQ 洗脱 1(BTP、NaAC)1.1875.5CIMQ 洗脱 2(BTP、NaAC)1.2586.2CIMQ 洗脱 3(BTP、NaAC)1.2896.7CIMQ 洗脱 4(BTP、NaAC)1.28103.3CIMQ 洗脱 5(BTP、NaAC)1.28102.8CIMQ 洗脱 6(BTP、NaAC)1.1491.12.2.3 纯化缓冲液体系优化采用 2.2.2 收集方式,针对 BTP、Na2HPO4缓冲体系,BTP、NaAC 缓冲体系和 Tris、Na2HPO4缓冲液体系,在连续线性梯度下进行洗脱,评估实验的回收率、实心载体比率和各种残留检测是否符合预期。根据层析图谱(图 4),可以观察到 3 种缓冲液体系分离病毒空颗粒与实心载体的效果相近,这与表 5 所示的实心载体比率结果一致,均达到 80%左右。对其过程样品进行qPCR 分析,结果见表 5,使用 BTP、Na2HPO4 缓冲液体系的实心载体回收率达到 57%,使用 BTP、NaAC 缓冲液体系的回收率达到 62%,使用 Tris、Na2HPO4缓冲液体系的回收率相对最高,达到 73%。对其过程样品进行 HCD、HCP、pDNA 检测,结果见表 6,显示 3 种缓冲液体系的洗脱样品各项指标均符合质量要求。因此,综合简便的收集方式和较高的 Vg 回收率,采用收集洗脱峰紫外吸收值 UV260/UV280比值大于 1 的方式收集样品,选用 Tris、Na2HPO4、pH 8.0 缓冲体系,作为 CI-MQ 层析柱纯化的缓冲体系。(a)Na2HPO4 buffer;(b)NaAC buffer。图 3 目标峰收集范围的优化层析图谱Figure 3 Optimized chromatogram for target peak collection range(a)10 mmol/L BTP,50 mmol/L Na2HPO4 buffer;(b)10 mmol/L BTP,150 mmol/L NaAC buffer;(c)20 mmol/L Tris,50 mmol/L Na2HPO4 buffer。图 4 层析柱层析缓冲体系优化层析图谱Figure 4 Chromatographic chromatogram optimized forchromatographic column chromatography buffer system2.3 电镜分析将纯化后的病毒样品经磷钨酸负染,透射电镜下可以观察到典型的 rAAV5 形态(图 5),病毒颗粒呈球111第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023形,直径在 2026 nm,有明显的正二十面体衣壳结构,形态完整,大小均一,并且大部分均为实心载体(明亮的球形),少数为病毒空颗粒(带有深色斑点的球体,箭头所示)。表 5 CIMQ 层析柱层析过程样品 qPCR 分析Table 5 CIMQ chromatography column chromatography process sample qPCR analysis样品名称Sample name浓度Concentration/(vg/mL)体积Volume/mL总 Vg xsTotal Vg xs回收率Recovery/%实心载体比率Vector capsids proportion/%CIMQ 上样5.83E+1117.1(9.960.56E)+12-17.9BTP、Na2HPO4 洗脱 12.17E+1024.0(5.210.23)E+115-BTP、Na2HPO4 洗脱 21.33E+1142.7(5.660.12)E+12a5780.3BTP、NaAC 洗脱 16.95E+0928.5(1.980.11)E+112-BTP、NaAC 洗脱 27.47E+1083.3(6.220.05)E+12b6279.6Tris、Na2HPO4 洗脱 18.87E+0922.5(1.990.13)E+112-Tris、Na2HPO4 洗脱 21.06E+1168.3(7.250.09)E+12c7380.3 注:不同小写字母表示差异显著(P0.05)。表 6 CIMQ 层析柱层析样品残留检测结果Table 6 CIMQ chromatography column chromatography sample residuedetection results样品名称Sample name宿主细胞核酸残留HCD/ng/1E12 宿主细胞蛋白HCP/ng/1E12质粒 DNApDNA/ng/1E12CIMQ 上样27.702.1617.43BTP、Na2HPO4 洗脱 24.610.312.78BTP、NaAC 洗脱 24.020.352.65Tris、Na2HPO4 洗脱 24.130.423.38箭头所示为 rAAV5 空颗粒。图 5 rAAV5 电镜图Figure 5 Electron micrograph of rAAV53 讨论与结论重组腺相关病毒(rAAV)作为治疗人类严重疾病的 DNA 传递载体,已显示出巨大的前景。rAAV 载体由蛋白衣壳和包裹在衣壳内的治疗性 DNA 组成。rAAV 三质粒转染系统会包装出大量不包含靶治疗基因的病毒颗粒18。一方面,过量的病毒空颗粒通过中和抗体(NABs)、细胞毒性 T 淋巴细胞(CTLs)甚至模式识别受体(PRRs)对病毒粒子衣壳的免疫识别,降低了转导效率,影响有效治疗,甚至这些额外的抗原负载会增加免疫反应的风险;另一方面,病毒空颗粒可能使中和抗体饱和,保护功能性实心载体有效的感染目标细胞群,然而这就需要在功能性实心载体中精确地按比例混合经过序列修饰的、非受体结合的相同血清型的病毒空颗粒19-20。无论哪种情况,都需要在纯化工艺中去掉这些产品相关杂质,以满足临床产品质量要求和工业规模化生产条件。然而,由于实心载体和病毒空颗粒两者在大小和表面电荷上的相似性,使病毒空颗粒的去除具有挑战性21-23。传统的氯化铯或碘克沙醇梯度超速离心(UC)法,可以有效分离实心载体和病毒空颗粒,然而这两种梯度对样品的承载能力均有限,影响 rAAV 纯化的规模放大24。Qu 等14介绍了用阳离子交换树脂POROS 50HS 和阴离子交换树脂 Q-Sepharosexl,在醋酸钠和醋酸铵梯度下,实现 AAV2 空颗粒和实心载体分离,回收率达到 74%,实心载体比率大于 80%。Urabe等25使用三甲基硫酸铵梯度洗脱强阴离子 Mini Q 和POROS HQ 柱,去除了 90%以上的 AAV1 空颗粒。Kaludov 等26使用弱阴离子 POROS PI 和强阴离子POROS HQ 填料可以有效去除 AAV2、AAV4 和 AAV5空颗粒,实心载体比率可达到 90%以上,但是回收率相对低。Dickerson 等27使用 NaCl 和 MgCl2的组合进行CIMQ 洗脱,在病毒空颗粒和实心载体洗脱峰之间获得了接近基线的分辨率,在保证 AAV2 回收率大于 70%的同时,实心载体比率也大于 90%。AAV5 最初是从人类临床样本中分离出来的 AAV血清型,与其他从实验室腺病毒毒株分离出来的血清型同源性最低,具有与其他血清型载体不同的特征。研究旨在开发一种针对 rAAV5 的阴离子交换层析方法,通过阴离子交换层析分离病毒空颗粒和实心载体。采用阴离子交换层析线性梯度洗脱,当 pH 值大于等电点时,病毒空颗粒带负电荷,病毒空颗粒的电负性小于实心载体,随着盐浓度的增加,病毒空颗粒将比实心载体更早被洗脱下来。病毒空颗粒和实心载体的电荷差别极小,两者的洗脱溶液电导差别也极小(甚至小于3.0 mS/cm),实际生产过程中洗脱条件容易受到环境的温度,称量的误差,不同仪器紫外检测器配置等因素的影响。在 rAAV5 的空颗粒与实心载体的分离上,可211第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023能微小的变化就会影响分离效果,采用线性梯度洗脱时,外界因素可能导致洗脱峰向左或者向右偏移,但不会影响病毒空颗粒与实心载体的分离,并且线性梯度还可以保证更好的重现性,其简单,易于扩大规模。研究首先通过不同的阴离子交换层析柱对亲和层析捕获的 rAAV5 样品在相同缓冲液条件下进行了离子强度线性梯度洗脱,结果显示基于对流相互作用介质的 CIMQ 层析柱22-23分离病毒空颗粒和实心载体有更好的效果,洗脱液回收率相对较高,实心载体比率高于其他 4 种阴离子填料。筛选出层析柱后,对该层析柱进行了缓冲体系筛选,收集方式以及缓冲液体系的优化,优化后采用洗脱时收集紫外吸收值 UV260/UV280的比值大于 1 部分,回收率达到 73%,实心载体比率达到 80.3%。综上所述,本研究通过对 rAAV5 阴离子交换层析过程进行优化,所获得的病毒颗粒实心载体比率和杂质符合质量要求,回收率相对较高,该方法有望应用于临床级 rAAV5 基因治疗产品的规模化生产,为 rAAV5载体大量制备提供了一种方法。参考文献 1 ATCHISON R W CASTO B C HAMMON W M.Adenovirus-asso-ciated defective virus particles J.Science 1965 149 3685 754-756.2 HOGGAN M D BLACKLOW N R ROWE W P.Studies of small DNA viruses found in various adenovirus preparations physical bio-logical and immunological characteristics J.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1966 55 6 1467-1474.3 BLACKLOW N R HOGGAN M D ROWE W P.Isolation of adeno-virus-associated viruses from man J.Proceedings of the National A-cademy of Sciences 1967 58 4 1410-1415.4 王立振 侯莹 成志云 等.腺相关病毒的受体研究进展 J.病毒学报 2017 33 3 462-468.5 ZHU D SCHIEFERECKE A J LOPEZ P A et al.Adeno-associat-ed virus vector for central nervous system gene therapy J.Trends in Molecular Medicine 2021 27 6 524-537.6 VERDERA H C KURANDA K MINGOZZI F.AAV Vector immu-nogenicity in humans a long journey to successful gene transfer J.Molecular Therapy 2020 28 3 723-746.7 COURA R NARDI N B.A role for adeno-associated viral vectors in gene therapy J.Genetics and Molecular Biology 2008 31 1 1-11.8 SMITH R H DING C KOTIN R M.Serum-free production and col-umn purification of adeno-associated virus type 5 J.Journal of Vir-ological Methods 2003 114 2 115-124.9 CARTER P J SAMULSKI R J.Adeno-associated viral vectors as gene delivery vehicles J.International 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