安石榴苷和类黄酮对生姜茎基腐病的防治效果研究.pdf

安石榴苷和类黄酮对生姜茎基腐病的防治效果研究师慧娟1陈 萍1聂言顺2蒋 鑫1张 宁1王思齐1李佳林1王文波1何文兴1*（1济南大学生物科学与技术学院，山东济南 250022；2丰唐生态农业科技研发（山东）有限公司，山东泰安 271400）摘要生姜是一种重要的香辛调味品，且有一定的药用价值。但由于长期采用无性繁殖和重茬种植，病原菌不断积累，严重影响了生姜的品质和产量。生姜茎基腐病是生姜严重的病害之一，目前对其致病菌的生物学特性研究较少，而且现有的防治措施多存在环境污染和食品安全方面的问题。基于此，本研究拟从莱芜染病生姜植株中分离筛选病原菌，明确其种属和致病性。同时，探究安石榴苷和类黄酮2种外源物质的抑菌效果和对生姜植株防御酶和防御基因的影响。结果表明：本研究共发现7 株致病菌，分别为 Fusarium verticillioides、Fusariumproliferatum、Penicillium oxalicum、Trichoderma longibrachiatum、Nigrospora oryzae、Fusarium solani、Globisporangiumspinosum；2 种外源物质对病原菌均有抑菌效果，并且类黄酮的抑菌效果更加显著。20 g/L 类黄酮对病原菌Globisporangium spinosum、Trichoderma longibrachiatum 的抑制率可达 100.0%，对病原菌 Penicillium oxalicum、Fusarium proliferatum、Fusarium verticillioides、Fusarium solani、Nigrospora oryzae 的抑制率分别为 63.4%、64.0%、67.9%、70.8%、91.7%。20 g/L 安石榴苷对病原菌 Penicillium oxalicum、Fusarium proliferatum、Globisporangiumspinosum、Fusarium verticillioides、Trichoderma longibrachiatum、Fusarium solani、Nigrospora oryzae的抑制率分别为27.8%、43.8%、100.0%、30.0%、23.3%、62.5%、83.3%。外源物质类黄酮可明显增加生姜中防御酶（过氧化物酶和多酚氧化酶）活力和防御基因（PAL、GLU、ERF、HMGS、WRKY8）表达，在不同浓度（20、10 g/L）类黄酮处理48 h的生姜叶片中，过氧化物酶和多酚氧化酶活力增高，PAL、GLU、WRKY8防御基因的表达量增加。关键词生姜茎基腐病；安石榴苷；类黄酮；抑菌率；防御酶；防御基因中图分类号S436.32文献标识码A文章编号 1007-5739（2023）18-0107-09DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.18.028开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Control Effects of Punicalagin and Flavonoids on Ginger Stem RotSHI Huijuan1CHEN Ping1NIE Yanshun2JIANG Xin1ZHANG Ning1WANG Siqi1LI Jialin1WANG Wenbo1HE Wenxing1*(1School of Biological Science and Technology,University of Jinan,Jinan Shandong 250022;2Fengtang Ecological Agriculture Technology Research and Development(Shandong)Company Limited,Taian Shandong 271400）AbstractGinger is an important spicy condiment and has some medicinal value,but long-term asexual repro-duction and continuous cropping lead to continuous accumulation of pathogenic bacteria,which seriously affects thequality and yield of ginger.Ginger stem rot is one of the serious diseases in ginger.Currently,there is little research onthe biological characteristics of its pathogenic bacteria,and available prevention and control measures have problems inenvironmental pollution and food safety.Based on this,this study aimed to isolate and screen pathogenic bacteria fromdiseased ginger plants in Laiwu,clarified their species and pathogenicity,as well as the antibacterial effects of twoexogenous substances(punicalagin and flavonoids)and their effects on defense enzymes and genes in ginger plants.The基金项目 山东省外专双百人才项目（WSG20200001）；济南大学博士基金项目（XBS2103）；泰安市农业科技特派员科技项目（2020TPY023）。第一作者 师慧娟（1997），女，硕士，从事微生物学研究工作。E-mail：*通信作者 E-mail：chm_收稿日期 2023-01-06现代农业科技2023 年第 18 期植物保护学107现代农业科技2023 年第 18 期植物保护学results showed that a total of 7 pathogenic bacteria were found in this study,namely Fusarium verticillioides,Fusariumproliferatum,Penicillium oxalicum,Trichoderma longibrachiatum,Nigrospora oryzae,Fusarium solani,and Globisporan-gium spinosum.Both exogenous substances had antibacterial effects on pathogenic bacteria,and the antibacterial effectof flavonoids was more significant.The inhibition rates of 20 g/L flavonoids on the pathogenic bacteria Globisporangiumspinosum and Trichoderma longibrachiatum reached 100.0%,and the inhibition rates on the pathogenic bacteria Peni-cillium oxalicum,Fusarium proliferatum,Fusarium verticillioides,Fusarium solani and Nigrospora oryzae were 63.4%,64.0%,67.9%,70.8%and 91.7%,respectively.The inhibition rates of 20 g/L punicalagin on pathogenic bacteria Peni-cillium oxalicum,Fusarium proliferatum,Globisporangium spinosum,Fusarium verticillioides,Trichoderma longibrachia-tum,Fusarium solani and Nigrospora oryzae were 27.8%,43.8%,100.0%,30.0%,23.3%,62.5%and 83.3%,respective-ly.Exogenous substances flavonoids could significantly increase the activity of defense enzymes(peroxidase andpolyphenol oxidase)and the expression of defense genes(PAL,GLU,ERF,HMGS,WRKY8)in ginger plants.In gingerleaves treated with flavonoids at different concentrations(20 g/L,10 g/L)for 48 hours,the activities of peroxidase andpolyphenol oxidase increased,and the expression levels of PAL,GLU and WRKY8 defense genes increased.Keywordsginger stem rot;punicalagin;flavonoids;inhibition rate;defense enzyme;defense gene生姜（Zingiber officinale Rosc.）为姜科姜属多年生单子叶草本植物，在我国多作一年生作物栽培。其原产东印度和我国热带多雨地区，性喜温暖气候1，在我国主要分布在四川、贵州、广西、山东和江西等地。山东省主要是在莱芜、安丘、昌邑、岱岳等地区种植生姜，尤其是莱芜市被誉为全国最大的生姜产地2。生姜既是一种重要的香辛调味品，又有一定的药用价值，具有健胃、驱寒、发汗、解毒等功效1。生姜因种植效益高、收益快、国内外市场需求量大，近年发展迅猛。但是，由于生姜在生产上长期采用无性繁殖且重茬种植，各种病原菌不断积累，导致生姜病害发生日益严重，尤其是高温多雨时最容易发生生姜茎基腐病，严重影响生姜的产量与质量，现已成为生姜生产中的重要问题之一，受到国内外研究者的广泛关注3。生姜茎基腐病又称生姜软腐病，俗称烂脖子病、黑脚病等4，是在生姜生产各个阶段均有可能发生的一种较为严重的土传病害。该病主要发生在生姜茎基部和地下块茎上，在发病初期茎基部会出现水渍状黄褐色病斑，随后变软腐烂，以致植株地上部叶片黄化凋萎甚至枯死，地下块茎变软但不腐烂发臭5。国外最早报道是在 1907 年由 Butle 首次发现绚丽腐霉（Pythium gracile）可引起病害的发生，后续研究者不断发现茎基腐病可能是由多种腐霉菌引起的，目前报道的有十多种，又因地理环境、天气气候等因素的影响，引发病害的腐霉菌有所差异6。国外研究发现，瓜果腐霉（P.aphanidermatum）、德里腐霉（P.deliense）、巴特勒腐霉（P.butleri）、群结腐霉（P.myriotylum）、刺腐霉（P.spinosum）、终极腐霉（P.ultimum）、钟器腐霉（P.vexans）、华丽腐霉（P.splendens）、完整腐霉（P.com-plectens）、禾生腐霉（P.graminicola）等均可引起生姜茎基腐病的发生7，此外镰孢菌（Fusarium spp.）也能引起茎基腐病的发生8。国内研究发现，群结腐霉（P.myriotylum）、瓜果腐霉（P.aphanidermatum）、简囊腐霉（P.monospermum）、周雄腐霉（P.periilum Drechsler）、喙腐霉（P.rostratum Butler）和禾生腐霉（P.graminico-la）等均能引起茎基腐病的发生9。有研究表明，甲壳胺可以抑制生姜茎基腐病，引起相关跨膜运输的基因和酶活发生改变10。还有一些细菌可以导致病原菌的菌丝细胞顶端膨大，改变菌丝结构，起到抑制病原菌生长的作用，减少病害的发生11-12。植物在受到外源刺激后，植物体内的防御酶活性会发生变化，从而可以减弱外界刺激对植物造成的不利影响。防御酶活性是研究植物抗病性的一个重要指标。过氧化物酶、多酚氧化酶与植物抗逆性有密切关系，其活性与植物的抗病性成正相关关系13。在外源物质的刺激下，植物体内的防御基因也会发生变化，本研究选用了上调表达的 5 个防御基因。蛋白内切酶（GLU）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）在包括生姜在内的植物抗病系统中发挥作用14。转录因子 ERF 是乙烯和茉莉酸合成途径的整合蛋白，可发挥抗病作用。HMGS 通过控制甾醇的合成增加抗病性。转录因子WRKY8 在参与植物体 MAPK 途径中被激活，可增强植物体抗病性。在芒果姜中，防御基因在早期出现峰值水平的表达，可能在防止病原菌入侵方面发挥重要作用15。目前，国内外防治生姜茎基腐病的方法以化学农108药防治为主6，但由于该病主要发生在土壤中，药剂防治很难从根本上防治；并且大量使用化学农药，又会产生食品安全和环境污染等问题。有研究表明，安石榴苷和类黄酮可以在不同程度上抑制菌株的生长，如安石榴苷可以抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙门菌（Salmonella sp.）等多种菌株的生长16-17，类黄酮化合物橙皮素可对烟草青枯病有明显防控效果18，红叶小檗中的类黄酮对大肠杆菌有抑制作用19，马齿苋类黄酮对大肠杆菌和酵母菌有较强的抑制作用20。相较于化学农药而言，安石榴苷和类黄酮对环境友好，并且不会产生环境污染问题。探究安石榴苷和类黄酮对病原菌的抑制作用，有效减少化学农药的使用，对维系生态平衡、促进生态农业可持续发展有着重要作用。基于此，本研究利用染病生姜植株分离筛选相关的病原菌，通过分子生物学鉴定和致病性测试明确病原菌的分类种属和致病性，探究安石榴苷和类黄酮对染病植株的 2 种防御酶（过氧化物酶和多酚氧化酶）和 5 个防御基因（GLU、PAL、ERF、HMGS 和 WRKY8）的影响，明确其防治效果。本研究结果可为进一步研究生姜茎基腐病的发生规律和有效防治措施提供重要参考。1材料与方法1.1试验材料供试材料为 2021 年从莱芜市采集的明显感染生姜茎基腐病生姜根、茎、叶或姜块。供试安石榴苷来源于石榴提取物，类黄酮来源于茶叶提取物。供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂 1520 g、无菌水 1 000 mL，121 蒸汽灭菌 1520 min）。1.2试验方法1.2.1病原菌的筛选分离及显微观察将采集到的感染生姜茎基腐病的生姜根、茎、叶和姜块用自来水冲洗干净，然后用消毒的医用手术刀将各组织部位的病健交界处切成小块，并用流水冲洗510 min，取出组织小块后用灭菌的滤纸吸干组织表面的残留水分，最后将组织小块放置于 PDA 培养基上，在 28 恒温培养箱中培养。待长出新鲜菌丝，及时用菌丝顶端分离技术分离，数代后得到单一纯化的菌种。1.2.2病原菌测序鉴定纯化 35 代后的菌落平板提取 DNA，用特异性引物 ITS1 和 ITS4 扩增，将扩增条带经过测序得到的cDNA-ITS 序列与 NCBI 数据库已有的相关菌株进行同源比对，利用 MAGA 软件进行序列比对并构建系统发育树，确定菌株种属。1.2.3致病性测定将健康的生姜姜块去皮清理干净后，用灭菌的滤纸将表面水分吸干，切成大小重量接近 5 g 的小姜块，分装好放进无菌超净工作台；用 75%乙醇对姜块表面消毒 35 min，再用无菌水冲洗干净，反复 23 次，然后用无菌滤纸将表面水分吸干，接种病原菌。28 连续培养 14 d，其间每天观察姜块的染菌情况，并拍照记录发病症状。1.2.4不同浓度安石榴苷和类黄酮抑菌试验采用菌丝生长速率法测定安石榴苷和类黄酮对病原菌的抑菌活性。将安石榴苷和类黄酮加入灭菌的 PDA 培养基中，分别配成 0（CK）、1、10、20 g/L 的培养基，摇匀，冷却后接种。在 28 条件下培养并逐日观察病原菌的生长情况。待对照组菌落几近长满平板时，测量各处理菌落直径，计算菌丝生长抑制率。计算方法如下：抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）1001.2.5不同浓度安石榴苷和类黄酮对生姜防御酶的影响配制好不同浓度0（CK）、1、10、20 g/L的安石榴苷和类黄酮，待姜苗长出第 3 片叶时对其进行浇灌，使土壤充分浸湿培养 24、48 h，然后取生姜叶片用液氮研磨，将所得到的粉末转移到离心管中。使用伊势久生物公司试剂盒测定过氧化物酶和多酚氧化酶的酶活力。1.2.6不同浓度安石榴苷和类黄酮对生姜防御基因的影响为了分析防御基因的表达，从经不同浓度0（CK）、1、10、20 g/L安石榴苷和类黄酮处理 0、24、48 h 的生姜植株上采集叶片获得叶样品，在液氮的存在下用研钵和研杵将样品磨成粉末，提取 RNA 后进行逆转录PCR。使用以下引物（表 1）进行防御基因的半定量RT-PCR，基因表达检测根据 Wang 等21描述的方法进行。每个基因的分析使用了 3 个独立的生物重复，师慧娟等：安石榴苷和类黄酮对生姜茎基腐病的防治效果研究109现代农业科技2023 年第 18 期植物保护学以 Actin（内参蛋白基因，生姜中的管家基因）为对照。2结果与分析2.1病原菌的筛选在发病姜块中分离纯化长出的菌丝，得到几种不同的单一菌落，将纯化得到的单一病原菌接种到 PDA培养平皿上培养，保存备用。根据培养平皿中菌落颜色及大小等形态特征，得到 7 种不同的单一病原菌（图 1），分别标记为 FS、S2、D3-L2、D1RH、D1-L1、D1-L2、D2-L1。2.2病原菌的形态特征分离纯化出真菌后，挑取活化菌丝制片，置于显微镜下观察孢子囊和游动孢子特征。病原菌 FS 在PDA 培养基上近似圆形，菌丝有许多隔膜，为有隔菌丝，没有分支，无泡囊和游动孢子。病原菌 S2 在 PDA培养基上近似圆形，菌丝分支，但分支很少，无泡囊和游动孢子。病原菌 D3-L2 在 PDA 培养基上无固定形态，菌丝分支，但分支很少，无泡囊和游动孢子。病原菌 D1RH 在 PDA 培养基上近似圆形，菌丝较粗，具有分支，泡囊及游动孢子近似椭球形，数量较多。病原菌 D1-L1 在 PDA 培养基上无固定形态，菌丝分支，较为发达，游动孢子数量较少。病原菌 D1-L2 在 PDA培养基上无固定形态，菌丝较粗，没有分支，游动孢子呈长条状。病原菌 D2-L1 在 PDA 培养基上无固定形态，菌丝有许多隔膜，为有隔菌丝，没有分支，泡囊及游动孢子呈球形或椭球形（图 2）。2.3菌株的分子鉴定将测序得到的 rDNA-ITS 序列与 GenBank 中已有的相关菌株的 ITS 序列进行同源序列比对并构建系统发育树，结果见图 3。病原菌菌株 FS 所属物种为腐皮镰刀菌（Fusarium solani），病原菌菌株 S2 所属物种为刺腐霉（Globisporangium spinosum），病原菌菌株D3-L2 所属物种为稻黑孢菌（Nigrospora oryzae），病原菌菌株 D1RH 所属物种为长枝木霉（Trichoderma lon-gibrachiatum），病原菌菌株 D1-L1 所属物种为轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioides），病原菌菌株 D1-L2 所属物种为层出镰刀菌（Fusarium proliferatum），病原菌菌株 D2-L1 所属物种为草酸青霉（Penicillium oxali-cum）。2.4菌株的致病性评价致病性测定结果表明，将分离到的 7 种单一病原菌分别接种到健康生姜块茎后，发病率平均达到85.71%。其中，接种 D1-L1、D1-L2、FS 发病率均达到100%。与对照姜块比较发现，接种后的姜块表面有大量真菌并且姜块表面发褐色，接种点周围呈水渍状（图 4）。发病组织上重新分离的病原菌与田间发病植株上分离的病原菌的菌落、孢子囊、藏卵器等形态完全一致，结果符合科赫法则。2.5不同浓度安石榴苷和类黄酮的抑菌效果针对不同的病原菌，施用外源物质安石榴苷和类表 1用于基因表达的半定量 RT-PCR 分析的引物防御基因ERFWRKY8HMGSGLUPALActin前后引物Forward（F）Reverse（R）Forward（F）Reverse（R）Forward（F）Reverse（R）Forward（F）Reverse（R）Forward（F）Reverse（R）Forward（F）Reverse（R）序列（5-3）ACCACCCTATCAGGATACATTTCGCTTCTTCTCGGTAAAGTGTTTCCATCTCCTACGTCTGGTTGGACTTGACCTCATCCTTAGATACGGAGCCAAGGATTGCATAATGTCGACGGTACATTCCTTCCCGCCTTCAAACTATGCGAGGGAGATTTGGGAATCGCAGCCATCGGAAAGGCCGCCAGAGAGATTAGACGGTATTGTGCTTGATTCGGGTTCTGTGAGGATCTTCATTAGGC图 17 种不同病原菌菌落形态特征图 27 种不同病原菌的显微形态特征FSS2D3-L2D1RHD1-L1D1-L2D2-L1110黄酮表现出不同的抑制效果（图 5、图 6），对病原菌D2-L1、D1-L2、S2、FS 的抑制率整体上呈现出随着安石榴苷和类黄酮浓度的增加而增加的趋势。其中，安石榴苷 20 g/L 和类黄酮 20 g/L 对病原菌 D2-L1 的抑制率分别为 27.8%和 63.4%，对病原菌 D1-L2 的抑制率分别为 43.8%和 64.0%，对病原菌 S2 的抑制率均高达 100.0%，对病原菌 FS 的抑制率分别为 62.5%和70.8%。对病原菌 D1-L1 的抑制率随安石榴苷浓度的增加反而下降，随类黄酮浓度的增加而增高，1 g/L安石榴苷的抑制率是 68.3%，20 g/L 类黄酮的抑制率是 67.9%。不同浓度的安石榴苷对 D1RH 的抑制率没有显著差异，而类黄酮则随着浓度的增加对 D1RH的抑制率增加，类黄酮 20 g/L 对 D1RH 的抑制率高达100.0%。中浓度的安石榴苷对病原菌 D3-L2 的抑制率最高，达 94.2%；随着类黄酮浓度的不断增加，对D3-L2 的抑制率也增加，类黄酮 20 g/L 对 D3-L2 的抑制率高达 91.7%（表 2）。综合来看，不同浓度的安石榴苷和类黄酮对于不同病原菌的抑制率有着明显的差异。相对而言，类黄酮的抑菌效果比安石榴苷的抑菌效果显著，且抑菌效果与类黄酮浓度成正相关。2.6不同浓度安石榴苷和类黄酮对生姜防御酶的影响由表 3 可以看出：在不同浓度安石榴苷和类黄酮处理 24 h 的生姜叶片中，1 g/L 类黄酮处理过氧化物酶活力最高；在不同浓度安石榴苷和类黄酮处理 48 h的生姜叶片中，1 g/L 类黄酮处理过氧化物酶活力也最高。在不同浓度安石榴苷和类黄酮处理 24 h 的生姜MF686809.1：43-591 Fusarium proliferatumD1-L2OP482320.1：11-564 Fusarium annulatumMN856297.1：4-554 Fusarium verticillioidesD1-L1FSMK409996.1：14-558 Fusarium solaniMK934494.1：12-606 Trichoderma longibrachiatumD1RHMK910133.1：3-987 Globisporangium spinosumS2MT588790.1：285-857 Penicillium sp.MN856292.1：21-595 Penicillium oxalicumD2-L1MN856247.1：10-563 Nigrospora oryzaeD3-L29996100100100100100100991006888100图 37 种病原菌的系统发育树图 47 种病原菌的致病性D2-L1FSCKS2D3-L2D1RHD1-L1D1-L2第 1 天第 14 天第 1 天第 14 天注：各处理左侧 3 瓶、右侧 3 瓶分别为 3 个重复培养第 1 天和第 14 天的染菌情况。师慧娟等：安石榴苷和类黄酮对生姜茎基腐病的防治效果研究111现代农业科技2023 年第 18 期植物保护学叶片中，同一浓度下类黄酮处理多酚氧化酶活力高于安石榴苷处理，但处理间差异不显著；在不同浓度安石榴苷和类黄酮处理 48 h 的生姜叶片中，除了 20 g/L类黄酮处理多酚氧化酶活力显著增加外，其他处理对于多酚氧化酶活力没有显著影响。相对而言，施用类黄酮可以增加生姜防御酶活力，效果比施用安石榴苷更明显。2.7不同浓度安石榴苷和类黄酮对生姜防御基因的影响为了探究施用安石榴苷和类黄酮对生姜防御基注：a 为安石榴苷；b 为类黄酮。图 5不同浓度安石榴苷和类黄酮对病原菌的抑制效果D2-L1FSCK1 g/L10 g/L20 g/LCK1 g/L10 g/L20 g/LS2D3-L2D1RHD1-L1D1-L2abD2-L1FSS2D3-L2D1RHD1-L1D1-L2表 2不同浓度安石榴苷和类黄酮对病原菌的抑制效果注：同列不同小写字母表示差异显著（P0.05）。添加物安石榴苷类黄酮浓度/（gL-1）1102011020抑制率/%D2-L112.2 b24.4 c27.8 c0.0 a46.3 d63.4 eD1-L2-4.5 a15.7 b43.8 c15.7 b57.9 d64.0 eS20.0 a93.3 c100.0 d0.0 a34.6 b100.0 dD1-L168.3 b37.9 a30.0 a36.3 a60.8 b67.9 bD1RH26.7 b22.9 b23.3 b0.0 a81.3 c100.0 dFS45.0 ab52.1 ab62.5 ab37.1 a44.6 ab70.8 bD3-L244.6 c94.2 e83.3 d4.2 a40.8 b91.7 ed抑制率/%80706050403020100安石榴苷类黄酮浓度/（gL-1）11020浓度/（gL-1）11020安石榴苷类黄酮e120100806040200抑制率/%bbbaaabaceed浓度/（gL-1）11020浓度/（gL-1）11020安石榴苷类黄酮安石榴苷类黄酮fg抑制率/%80706050403020100120100806040200抑制率/%aababababbcaebed浓度/（gL-1）抑制率/%70605040302010080706050403020100-10抑制率/%安石榴苷类黄酮安石榴苷类黄酮120100806040200抑制率/%安石榴苷类黄酮11020浓度/（gL-1）11020浓度/（gL-1）11020abcabbcacbbadcccaabdd注：a 为 D2-L1；b 为 D1-L2；c 为 S2；d 为 D1-L1；e 为 D1RH；f 为 FS；g 为 D3-L2。图柱上不同小写字母表示差异显著（P0.05）。图 6不同浓度安石榴苷和类黄酮对病原菌的抑制效果112因的影响，采用半定量 RT-PCR 技术，研究了参与植物防御反应的 5 个基因的表达，以未处理的植物作为对照。在半定量凝胶成像结果中，GLU 和 PAL 都是在 20、10、1 g/L 类黄酮处理 48 h 下基因表达量增加的，ERF 和 HMGS 在不同浓度安石榴苷和类黄酮处理下基因表达没有明显的差异，WRKY8 在 10 g/L 安石榴苷处理 24、48 h 下和 20 g/L 类黄酮处理 48 h 下基因表达量明显增加（图 8）。3讨论与结论3.1讨论3.1.1安石榴苷和类黄酮对生姜茎基腐病病原菌和致病性的影响生姜发育的各阶段都有可能受到真菌和细菌的侵害，特别是生姜生产上长期依靠无性繁殖和重茬种植，加速了病原菌的积累，危害加重，严重影响了生姜的产量和质量1。在我国每年的 78 月，由于气温高、降水量大，会加速病害的发展。生姜茎基腐病可能由腐霉属的病原菌引起，也有可能由镰刀菌属的病原菌引起，甚至可能是由两者混合侵染引起的。本研究从发病的生姜不同组织部位分离培养出 7 种不同的病原菌种类。在致病性测定中，将这 7 株病原菌分别接种在生长状况良好的健康生姜块茎上，经过 14 d 培养，姜块开始出现腐烂症状，真菌生长迅速，平均致病率达到 85.71%，具有致病力的病原菌均符合科赫法则，其中 3 株镰刀菌（Fusarium verticillioides、Fusariumproliferatum、Fusarium solani）致病能力最强，接种这3 株病原菌的姜块发病率均为 100%。病原菌会导致姜块腐烂，这种情况通常发生在播种后至成苗阶段。生姜茎基腐病影响幼苗、成株，通常对于幼苗而言，可以导致植株死亡，产量下降；对于成株而言，表现出茎基腐病的症状。其他 4 株病原菌通过分子生物学鉴定分别为 Penicillium oxalicum、Trichoderma longibrac-hiatum、Nigrospora oryzae、Globisporangium spinosum。病原菌 Fusarium verticillioides 作为一个重要的植物病原菌，可影响作物生产和食品安全。该真菌主要存在于玉米作物中，在玉米收获期会产生伏马菌素22，可对动物和人类产生危害。Fusarium proliferatum 是首次从沙特阿拉伯地区的海枣树中分离出来的菌株，可以引起植物枯萎症状，也是造成枣果腐烂的病原菌之一23。由 Fusarium solani 引起的根腐病是我国茄科和豆科植物中最具破坏性的病害之一，该病原菌分布范围广、致病性强24。Nigrospora oryzae 是引起水稻穗部褐变的病原菌之一，会导致秕谷增多，影响水稻产量和品质25。在多项研究中表明，类黄酮对细菌的抑制作用较明显，对真菌的抑制作用较弱，可能是由于真菌细胞壁厚，类黄酮物质穿过细胞膜困难。安石榴苷对幽门螺杆菌、白念珠菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、梭状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌等均有抑制活性，其机理为抑制菌膜中的蛋白质使之发生沉淀而失活，抑制糖基转移酶的活性26。也有研究表明，安石榴苷具有一定的抗真菌活性27-28。已有研究报道，安石榴苷和类黄酮有不同程度的抑菌效果，但大多数研究主要针对细菌感染所引起的病害。本研究中安石榴苷和类黄酮对真菌病原菌有较为显著的抑菌效果，并且类黄酮的抑菌效果更加显著。20 g/L 类黄酮对 7 种病原菌的抑菌效表 3不同浓度安石榴苷和类黄酮对生姜叶片中防御酶的影响添加物安石榴苷类黄酮浓度/（gL-1）0（CK）110200（CK）11020过氧化物酶活力/（UL-1）24 h7 5605 0604 6205 9907 5609 560*6 6209 06048 h7 5278 0006 0205 6007 52711 280*8 1107 600多酚氧化酶活力/（UL-1）24 h30.025.833.623.430.030.037.231.848 h29.334.226.424.029.318.631.849.2*注：*表示差异显著（P0.05）；*表示差异极显著（P0.01）。图 8不同浓度安石榴苷和类黄酮对 5 种防御基因表达的影响注：M 为 maker；CK 为对照组；1、2、3 分别为 20、10、1 g/L 安石榴苷处理 24 h；4、5、6 分别为 20、10、1 g/L 类黄酮处理 24 h；7、8、9 分别为 20、10、1 g/L 安石榴苷处理 48 h；10、11、12 分别为 20、10、1 g/L 类黄酮处理 48 h；V-为阴性对照；V+为阳性对照。100 bp100 bp100 bp100 bp100 bp100 bpActinPALGLUERFHMGSWRKY8M CK 12345678910 11 12 V-V+M师慧娟等：安石榴苷和类黄酮对生姜茎基腐病的防治效果研究113现代农业科技2023 年第 18 期植物保护学果均可达 60.0%以上，而 20 g/L 安石榴苷对 7 种病原菌的抑制率均在 20.0%以上。3.1.2安石榴苷和类黄酮对生姜防御酶和防御基因表达的影响植物受到外界刺激时，会诱导防御酶活性发生改变，从而抵御外来伤害，防御酶活性升高表明植物的抗病性增强29。试验表明，外源物质安石榴苷和类黄酮会在一定程度上诱导防御酶活性增加。对于生姜而言，适宜浓度的安石榴苷和类黄酮抑菌效果明显，处理后生姜叶片中过氧化物酶和多酚氧化酶活性增加，相关的防御基因转录水平上调。通过这些结果可推测生姜对真菌感染的潜在防御反应。安石榴苷和类黄酮 2 种生物活性化合物诱导了生姜叶片中防御相关基因的表达。GLU 是最具特征的致病相关蛋白质之一，能够直接水解真菌病原体的细胞壁，从而释放激发子，如-1，3-葡聚糖，激活宿主防御反应。PAL 是植物苯丙烷途径中的第一个限速酶，在植物对病原体攻击的反应中发挥作用。在这条途径中，生物活性物质被合成，在增强植物细胞壁结构和抑制病原菌生长方面发挥作用30。根据报道，ERF 整合了乙烯和茉莉酸依赖途径的信号，并在植物抗病性方面发挥重要作用。TSRF1是一种番茄 ERF蛋白，在番茄感染青枯病菌后上调，并通过激活致病相关蛋白介导防御信号31。此外，在番茄中发现，ERF与 pto 抗性基因直接相互作用32。在拟南芥中，HMGS的过度表达上调了甾醇生物合成途径中的基因，导致甾醇含量增加，从而提高了拟南芥对胁迫的耐受性33。研究发现，本氏烟草中的 MAPK 激活 WRKY8 TFs，从而增加防御相关基因的表达34。在拟南芥中，WRKY8通过介导 ABA 和乙烯信号通路参与了对烟草花叶病毒（TMV）的抗性35。有研究发现，苹果果实中 GLU 防御基因的表达可增强对灰霉病的抗性36，樱桃果实中GLU 和 PAL 的上调表达也增强了对灰霉病的抗性37。目前，尚无其他研究表明安石榴苷和类黄酮对以上基因有影响。本研究结果中，施用不同浓度的类黄酮显著增加了 PAL 和 GLU 的基因表达量，尤其是在处理48 h 条件下。由此可推测，基因的上调表达会增强生姜的抗病性14。植物体复杂的抗病分子机制可能会使得各种信号通路之间串扰，导致防御相关基因转录产物积累模式出现差异。结果表明，适宜浓度的安石榴苷和类黄酮可以有效抑制病原菌，减少生姜茎基腐病的发生。类黄酮有望成为一种化学农药的替代品用于防治病害。3.2结论本研究从发生茎基腐病的生姜植株中分离筛选出 7 种病原菌，明确了其分类种属和致病力特性，同时探究了 2 种外源物质安石榴苷和类黄酮对生姜茎基腐病的防治效果。研究发现，安石榴苷和类黄酮可在不同程度上抑制病原菌的生长，并且类黄酮的抑菌效果更加显著。20 g/L 类黄酮对病原菌 Globisporan-gium spinosum、Trichoderma longibrachiatum 的抑制率可达 100.0%，对病原菌 Penicillium oxalicum、Fusariumproliferatum、Fusarium verticillioides、Fusarium solani、Nigrospora oryzae 的抑制率在 63%92%之间；20