柴胡三参胶囊调控HIF-1α_BNIP3_NIX介导的线粒体自噬通路减轻心肌缺血再灌注损伤作用的研究.pdf

Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化心脑血管疾病研究柴胡三参胶囊调控HIF-1/BNIP3/NIX介导的线粒体自噬通路减轻心肌缺血再灌注损伤作用的研究曹蛟，刘建和，张杼惠，何涛，谭彩（湖南中医药大学第一附属医院 长沙 410007）摘要：目的从 HIF-1（Hypoxia-Inducible Factor-1）/BINP3（B lymphocytoma-2 gene-homology 3）/NIX（Nip-like protein X）介导的线粒体自噬通路探讨柴胡三参胶囊保护心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）大鼠的生物学机制。方法选取50只SD大鼠，随机分为假手术（Sham）组、模型（I/R）组、柴胡三参胶囊（CHSS）组、HIF-1抑制剂（2ME2，二甲氧基雌二醇）组、HIF-1抑制剂柴胡三参胶囊（2ME2CHSS）组，每组10只。大鼠灌胃给药，每日1次，连续灌胃4周。末次给药24 h后，结扎左前降支冠状动脉30 min，再灌注120 min建立大鼠MIRI模型。采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清中CK-MB（Creatine kinase-MB）、cTn I（Troponin）及 LDH（Lactate dehydrogenase）含量；HE 染色（Hematoxylin-eosin staining）观察心肌组织改变；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠心肌组织自噬相关蛋白HIF-1、BNIP3、NIX、微管相关蛋白1轻链3-（Microtubule-associated protein 1 light chain 3 B-，LC3-）、微管相关蛋白1轻链3-（Microtubule-associated protein 1 light chain 3 B-，LC3-）表达；流式细胞法检测线粒体膜电位水平；电镜观察线粒体内自噬小体数量。结果与Sham组相比，I/R组血清CK-MB、cTn I、LDH含量升高（P0.05），心肌组织不同程度损伤，HIF-1、BNIP3、NIX表达及LC3-/LC3-比值升高（P0.05），线粒体膜电位水平降低（P0.05），线粒体自噬小体数量增多（P0.05）；与I/R组相比，CHSS组血清CK-MB、cTn I、LDH含量降低（P0.05），心肌组织损伤程度较轻，HIF-1、BNIP3、NIX表达及LC3-/LC3-比值升高（P0.05），线粒体膜电位水平升高（P0.05），线粒体自噬小体数量增多（P0.05）；与CHSS组相比，CHSS+2ME2组血清CK-MB、cTn I、LDH明显降低（P0.05），心肌组织损伤程度加重，HIF-1、BNIP3、NIX表达及LC3-/LC3-比值最低（P0.05），线粒体膜电位水平降低（P0.05），线粒体自噬小体数量减少（P0.05）。结论柴胡三参胶囊对缺血再灌注大鼠心肌具有保护作用，这种机制与其促进HIF-1/BNIP3/NIX介导的心肌细胞线粒体自噬通路有关。关键词：柴胡三参胶囊 缺氧诱导因子-1 心肌缺血再灌注损伤 线粒体自噬doi:10.11842/wst.20220119003 中图分类号:R285.5 文献标识码:A中国心血管健康与疾病报告2020 显示：我国急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）患者2002-2018 年死亡率总体呈上升态势1。目前，针对AMI的主要治疗方法为短时间内进行血运重建，包括血管内溶栓、经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous coronary intervention，PCI）及冠状动脉旁路术（Coronary artery by pass surgery，CABG）,其中PCI术最为常见，此手术方式可在短时间内使狭窄的冠状动脉再通，恢复 收稿日期：2022-01-19 修回日期：2022-06-16 湖南省中医药管理局2021年度湖南省中医药科研计划重点项目（2021011）：基于ROS与HIF-1通过线粒体自噬实现的crosstalk探讨柴胡三参胶囊对心肌缺血再灌注损伤的干预机制，负责人：刘建和。通讯作者：刘建和，教授，主任医师，博士生导师，主要研究方向：中医药防治心血管疾病研究。993 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 缺血部位的血液供应，然而当血流恢复后可继发心肌缺 血 再 灌 注 损 伤（Myocardial ischemia rePerfusion injury，MIRI），其主要临床表现包括出现严重的室性心律失常、原有的梗死面积扩大、心衰症状加重、心肌顿抑等2。MIRI的发生已成为AMI治疗后所面对的临床难题，其严重影响了PCI术的临床疗效和AMI的预后，成为不可忽视的临床问题。HIF-1由和两个亚单位组成，其中HIF-1是重要功能单位，可通过调控多种基因表达而参与氧化应激、能量生成、细胞迁移等生理过程3。HIF-1的产生能够激活其下游的众多信号传导路径，以减少氧消耗、促进无氧代谢过程，使机体能够更好地适应低氧环境，此外，HIF-1可诱导缺氧靶基因的激活，调节心肌细胞线粒体自噬，参与MIRI的病理过程4。研究表明，HIF-1可预防MIRI的发生，且具有心脏保护作用，在心肌缺血早期，HIF-1 的表达水平明显升高，急性心肌缺血时心肌组织中HIF-1的表达也明显高于正常心肌组织，其可促进受损心肌毛细血管形成，有效构建了缺血区的侧枝循环，此外HIF-1可以减少心肌细胞活性氧（Reactive oxygen species，ROS）生成，促进线粒体抗氧化剂产生，抑制心脏成纤维细胞凋亡，从而发挥抗心肌缺血作用5-6。MIRI的病理过程涉及自由基损伤、钙超载、炎症反应与线粒体自噬等多种生物学机制，线粒体自噬是机体进行自我调节的一种方式，通过自噬途径可将受损的线粒体进行分解后再利用，以维持机体物质与能量代谢平衡7。Yamaguchi8认为适当的线粒体自噬行为可促进机体清除受损细胞器，从而对受损心肌产生保护作用，而过度自噬反应可损伤心肌细胞，因此调节线粒体自噬反应可能成为治疗心脏疾病新的突破口。BNIP3和 NIX位于线粒体外膜，BNIP3在缺氧期间可调节线粒体自噬，而在红细胞谱系发育过程中NIX是线粒体自噬所必需的，二者均为单通道跨膜蛋白，跨膜结构域是甘氨酸拉链，形成同型二聚体9。激活HIF-1基因可促进BNIP3和NIX的表达，参与调节线粒体自噬10-11。Wu 等12证实，褪黑激素通过激活MT2（Membrane matrix metalloproteinase）/SIRT3（Silencing information regulator 2 related enzymes 3）/FoxO3a（Forkhead box transcription factor O3a）通路，抑制线粒体过度自噬，保护MIRI后H9C2心肌细胞作用。肖钰雪等13证 实 中 药 乌 头 赤 石 脂 丸 可 通 过 调 控 PI3K（Phosphatidylinositol 3 kinase）/Akt（Protein kinase B）/GSK-3（Glycogen synthase kinase 3）信号通路，抑制心肌细胞过度自噬反应，对MIRI大鼠起到保护作用。贾飞凡14证实中药双参宁心胶囊可通过抑制 PINK1（Putative kinase 1 induced by phosphatase and tensin homologous genes）/Parkin（E3泛素连接酶）通路介导的线粒体自噬过度激活，减轻心肌组织结构损伤及维持线粒体功能相对完整性，发挥抗MIRI功能。本实验分析各实验组大鼠血清心肌坏死标志物水平，HIF-1及线粒体自噬相关蛋白表达，流式细胞术观察线粒体膜电位变化，透射电镜观察胞内自噬小体数量，证实中药柴胡三参胶囊可通过调节HIF-1/BNIP3/NIX途径，促进HIF-1表达，促进线粒体自噬发生，发挥抗MIRI的生物学效应，为中医药在该领域的研究领域提供新的实验数据支撑。1 材料与方法 1.1动物50只SPF级雄性SD大鼠，体质量220-240 g，由湖南斯莱克景达公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。饲养于湖南中医药大学实验动物中心，每笼3只，温度22-26，湿度50%-70%，大鼠均自由进食饮水。1.2主要药物、试剂柴胡三参胶囊（柴胡、法半夏、黄连、党参、丹参、苦参、青篙、甘草组成，剂量比例15 10 6 15 10 10 10 6），由湖南中医药大学第一附属医院提供（批号：140403）。CK-MB试剂盒（武汉华美生物工程有限公，批号：F10039076）、cTn I试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号：F09039075），LDH活性试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A202-2）、HIF-1一抗（美国 proteintech 公司，批号：20960-1-AP）、BNIP3 一抗（英国 abcam 公司，批号：ab109362），NIX 一抗（美国proteintech公司，批号：12986-1-AP）、LC3一抗（英国abcam公司，批号：ab192890）、HRP羊抗兔二抗（美国proteintech公司，批号：ab109362）。1.3主要仪器小动物呼吸机（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，WD407型）；台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，H1650R）；全自动酶标洗板机（深圳市汇松科技发展有限公司，PW-812）；多功能酶994 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化心脑血管疾病研究标分析仪（深圳市汇松科技发展有限公司，MB-530）；MB-530电热恒温培养箱（北京市永光明医疗仪器有限公司，DHP-500）；透射电镜（日本电子 JEM1400型）；数码相机（morada G3）。1.4分组、造模及给药将50只雄性大鼠适应性喂养7天后按随机数字表法分为 Sham 组、I/R 组、CHSS 组、2ME2 组、2ME2+CHSS组，每组10只。柴胡三参胶囊按照成人等效剂量换算为大鼠剂量，按此剂量，CHSS组大鼠每日灌胃0.6 g；Sham组和I/R组分别给予相同体积生理盐水灌胃；2ME2 组给予剂量（2ME2）0.15 mgkg-1，造模前30 min腹腔注射；2ME2+CHSS组给予柴胡三参胶囊内容物溶液剂量同 CHSS 组，造模前 30 min 腹腔注射2ME2 0.15 mgkg-1；所有实验大鼠每日均灌胃 1 次。末次给药 24 h 后，用 10%水合氯醛腹腔注射麻醉老鼠，用心电图机采集大鼠导联心电图，切开气管，连接呼吸机。在胸骨左缘纵行切开皮肤，依次分离组织，暴露心脏，结扎冠状动脉左前降支。以导联T波高耸或ST段明显抬高，结扎线以下心脏表面区域颜色变暗、搏动减弱为造模成功的标准。结扎30 min后再灌注120 min。观察灌注后ECG的变化，观察结束后取材。Sham组：麻醉开胸方法同上，但只穿线，不结扎。1.5检测方法1.5.1ELISA 法测血清CK-MB、cTn I、LDH含量再灌注结束后，立即抽取大鼠腹主动脉血，3000 rmin-1，4离心15 min，吸取上清液，严格按照试剂盒说明书检测方法进行操作，检测血清 CK-MB、cTnI LDH含量。1.5.2心肌组织病理检查再灌注结束后，取一份心脏组织，切取梗死部位心肌，多聚甲醛固定后脱水、利用石蜡对组织进行包埋，连续切出0.5 m切片，然后脱蜡、水化、染色、封片，用普通光学显微镜4010倍数下采集图片并进行结果分析。1.5.3Western blot法检测HIF-1、BNIP3、NIX、LC3B-、LC3B-I表达取一份心脏组织，切取梗死部位心肌，用冰预冷PBS洗组织，加入300 L RIPA裂解液于生物样品均质仪中反复研磨组织，4，12000 rmin-1离心15 min，将上清液转移入1.5 mL离心管中，严格按照说明书要求进行实验。BCA法测总蛋白剂量。每孔各取20 L蛋白上样，电泳恒定电压78 V，时间为2.5 h，待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。切下目的条带后进行转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗室温孵育90 min，二抗室温孵育 90 min，孵育结束，1PBST 洗 3次，每次 10 min，使用 ECL化学发光液与膜孵育1 min，在凝胶成像系统中成像，Quantity one专业灰度分析软件进行分析。1.5.4线粒体膜电位检测取一份心脏组织，切取梗死部位心肌，严格遵循JC-1线粒体膜电位检测试剂盒说明书实验步骤，配置并稀释 JC-1工作液，稀释后将其加入纯化的线粒体中，用流式细胞仪检测 JC-1单体（激发波长 488 nm，发射波长527 nm）和聚集体（激发波长488 nm，发射波长590 nm）。线粒体膜电位高时JC-1形成聚集体，表现为红色荧光（右上象限，Q1-UR）；线粒体膜电位低时 JC-1 单体较多，表现为绿色荧光（右下象限，Q1-LR）。红/绿荧光比值越高，线粒体膜电位越高。1.5.5电镜观察线粒体内自噬小体取一份心脏组织，切取梗死部位心肌，固定到2.5%戊二醛6-12 h；弃掉固定液，将组织置于PBS缓冲液中 1-6 h；再将组织置于 1%锇酸后固定 1-2 h。梯度乙醇、乙醇醋酸铀、环氧丙烷脱水。环氧树脂包埋、切片，3%醋酸铀-硝酸铅双染色。在透射电镜下观察、拍摄，选取各组代表性电镜图片，人工计数自噬小体数目，并对各组图片自噬小体求平均值。1.6统计学方法采用SPSS 22.0软件对实验结果进行分析，计量资料以均值标准差（x s）表示，多组件比较前进行方差分析，方差齐者用LSD法，若方差不齐，用Dunnett T3法，不满足正态分布用秩和检验，以P0.05表示差异具有统计学意义。2 结果 2.1各组大鼠血清CK-MB、cTn I、LDH含量比较结果见表1，与Sham组相比，I/R组血清CK-MB、cTn I、LDH含量升高（P0.05）；与I/R组相比，CHSS组血清CK-MB、cTn I、LDH含量降低（P0.05）；与CHSS组相比，CHSS+2ME2组血清CK-MB、cTn I、LDH含量降低（P0.05）。2.2各组大鼠心肌组织病理改变结果见图1，HE染色结果显示Sham组心肌组织结构正常，纤维组织排列整齐，无断裂；2ME2组病变最严重，心肌细胞纤维断裂，丧失完整结构；I/R组与2ME2995 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 CHSS组心肌组织结构紊乱，但损伤程度较2ME2组轻；CHSS组结构较完整，心肌损伤程度轻，结构较完整。2.3各组大鼠 HIF-1、BNIP3、NIX 表达及 LC3-/LC3-比值结果见表 2，Western blot 结果显示与 Sham 组相比，I/R组HIF-1、BNIP3、NIX表达及LC3-/LC3-比值升高（P0.05）；与 I/R 组相比，CHSS 组 HIF-1、BNIP3、NIX表达及LC3-/LC3-比值升高（P0.05）；与CHSS组相比，CHSS2ME2组HIF-1、BNIP3、NIX表 达 及 LC3-/LC3-比 值 降 高（P0.05），具 体见图2。2.4各组大鼠线粒体膜电位水平结果见图3，与Sham组相比，I/R组线粒体膜电位水降低（P0.05）；与 I/R 组相比，CHSS组膜电位升高（P0.05）；与CHSS组相比，CHSS2ME2组膜电位降低（P0.05）。2.5电镜观察线粒体自噬小体由图4可知（箭头所指），与Sham组相比，I/R组单位面积自噬小体数量增多；与I/R组相比，CHSS组数图1各组大鼠心肌组织病理学改变（HE染色，400倍）ABCDEHIF-1BNIP3NIX120 KD30 KD70 KD16 KD14 KD36 KDLC3-LC3-GAPDH图2各组大鼠心肌组织HIF-1、BNIP3、NIX表达及LC3-/LC3-比值蛋白灰度分析注：A：Sham组；B：为I/R组；C：CHSS组；D：2ME2组；E：2ME2+CHSS组。表2各组大鼠HIF-1、BNIP3、NIX蛋白水平表达量及LC3B-/比值（x s，n=5）组别Sham组I/R组CHSS组2ME2组2ME2+CHSS组HIF-1/GAPDH0.170.022)3)0.260.041)3)0.420.051)2)3)0.110.021)2)0.260.051)3)BNIP3/GAPDH0.200.032)3)0.280.031)3)0.430.071)2)3)0.110.021)2)0.270.031)3)NIX/GAPDH0.190.022)3)0.270.061)3)0.440.031)2)3)0.130.031)2)0.280.051)3)LC3-/LC3-0.500.062)3)0.870.191)3)3.790.261)2)3)0.300.401)2)0.950.151)3)注：与Sham组比较，1)P0.05；与I/R组比较，2)P0.05；与CHSS组比较，3)P0.05。表1各组大鼠血清CK-MB、cTn I水平及LDH含量（UL-1）（x s，n=5）组别Sham组I/R组CHSS组2ME2组2ME2+CHSS组CK-MB0.090.012)3)0.240.021)3)0.140.021)2)3)0.330.021)2)0.230.031)3)cTn I80.3312.072)3)287.1812.321)3)137.9217.961)2)3)366.429.251)2)281.212.111)3)LDH74.4813.952)3)170.8212.371)3)107.138.371)2)3)211.2315.321)2)174.5524.761)3)注：与Sham组比较，1)P0.05；与I/R组比较，2)P0.05；与CHSS组比较，3)P0.05。996 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化心脑血管疾病研究图3各组大鼠线粒体膜电位情况注：与Sham组相比，*P0.05；与I/R组相比，#P0.05；与CHSS组相比，P0.05。图4各组大鼠心肌细胞线粒体内自噬小体数量分布情况（电镜，20000倍）。注：与Sham组相比，*P0.05；与I/R组相比，#P0.05；与CHSS组相比，P0.05。997 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 量增多（P0.05）；与CHSS组相比，2ME2CHSS组数量减少（P0.05）。3 讨论 柴胡三参胶囊是全国名老中医程丑夫教授依据小柴胡汤化裁而来，全方由柴胡、法半夏、黄连、党参、丹参、苦参、青篙、甘草组成，是我院心血管病科治疗MIRI的常用院内制剂，本方以柴胡为君，疏肝解郁，调畅气机；黄芩入少阳胆经，配伍柴胡清泄少阳之邪，二者为和解少阳的经典配伍；半夏消痞散结，燥湿化痰，丹参为血中之气药，活血通经，清心除烦，此二者为臣，为化瘀祛痰之要药；青蒿清透少阳之邪，辟秽化浊，配伍黄芩则内清湿热，透邪外出，苦参专治心经之火；党参补中益气，杜绝生痰之源；甘草和中缓急，共为佐使之药。诸药合用，共奏益气活血，清热化痰之功。柴胡三参胶囊由八味临床常见中药组成，每味中药含有多种化合物，可对心肌产生保护作用，如柴胡可抑制心肌细胞过度自噬，减轻心肌细胞凋亡及纤维化15；黄芩可通过逆转MAPK（Mitogen activated protein kinase）/Nrf-2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2）/HO-1（Heme oxygenase 1）/NF-B（Nuclear transcription factor，核转录因子-B）信号通路，升高SOD（Superoxide dismutase）活性，降低MIRI大鼠CK与LDH水平16；丹参有效成分丹参多芬酸通过调节激活素A/卵泡抑素系统，改善AMI后心衰大鼠心肌细胞纤维化程度17；苦参有效成分苦参碱可通过抗氧化、抗凋亡等生物学过程，改善高糖诱导的H9C2心肌细胞损伤18。近年来对线粒体自噬分子机制和生物学功能的探索取得了一些进展，但是其在MIRI中主要作为细胞存活或死亡途径仍不清楚19。线粒体自噬是一种保守的生物学现象，在此作用下选择性地清除损伤或功能失常的细胞，使其可被生物体重新利用，与此同时，线粒体自噬也已成为心脏内稳态和功能的主要调节者，在心肌组织中，基础水平的自噬对维持心肌正常功能的维持具有重大的意义，研究表明，线粒体自噬是影响MIRI的重要生理病理学机制，增强线粒体自噬可以减少细胞应激，加速恢复，从而保护心肌细胞功能，而过度的线粒体自噬反应可损伤细胞，因此调节该反应可能成为治疗MIRI新的突破口20-22。Kroemer等23证实冠状动脉阻塞引起的血供减少，是引起心肌缺血的根本原因，在此过程中，通过线粒体自噬途径以分解受损线粒体，降低活性氧（Reactive oxygens Species，ROS）水平，以维持心肌细胞正常功能。Zhou等24研究显 示，凋 亡 蛋 白 RIPK3（Receptor interacting protein kinase 3）通过干扰FUNDC1（FUN14 domain containing 1）磷酸化使线粒体自噬减少，从而增加缺血再灌注小鼠心肌细胞凋亡及坏死，扩大心肌梗死面积，加重MIRI造成的心肌损伤。在长时间缺氧条件下，HIF-1表达升高，抑制细胞内ROS生成，促进细胞线粒体自噬，以提高细胞在缺氧环境下的生存能力25。CK-MB、cTn I、LDH是临床上评价心肌损伤程度的重要指标，也可作为观察 MIRI治疗效果的重要指标26-27。本研究结果表明，所有实验组中 CHSS组CK-MB、cTn I、LDH含量最低，说明柴胡三参胶囊可明显降低 MIRI 后大鼠心肌细胞中 CK-MB、cTn I、LDH 含量，从而改善受损心肌。线粒体不仅是细胞能量代谢中心和各种生存信号的效应器，也是活性氧攻击的“目标”，对I/R损伤引起的细胞死亡信号非常敏感28。MIRI导致ROS水平升高、ATP（Adenosine triphosphate）水平降低、线粒体膜电位降低，同时引起代谢产物堆积和Ca2+超载，受损线粒体产生的ROS是正常线粒体的10倍，大量活性氧可直接攻击线粒体蛋白质和DNA（Deoxyribonucleotide），加剧线粒体损伤，从而形成恶性循环，因此，打破这种恶性循环，及时清除受损线粒体是预防 MIRI 的关键29.30。Zhang等10证实在H9C2心肌细胞MIRI模型中，HIF-1可通过激活BNIP3基因，增强自噬效应。Yang等Yang L31发现，去铁胺联合七氟醚可通过恢复HIF-1/BNIP3介导的线粒体自噬反应，减轻糖尿病肾病大鼠 MIRI后心肌细胞损伤。LC3-及 LC3-是线粒体发生自噬的重要分子标志，而LC3-/LC3-的比值与自噬反应呈正相关32-33。线粒体自噬具有高度选择性，当线粒体受损时，不能得到有效清除时，一方面会发生聚集，损伤正常线粒体；此外还会释放细胞因子，促进细胞凋亡，因此调节心肌细胞线粒体自噬，可有效清除受损线粒体，降低心肌损伤程度34。HIF-1是影响线粒体自噬的重要转录因子，其表达和活性受到细胞氧浓度的密切调控35。BNIP3是线粒体自噬的关键受体，也是HIF-1的下游靶基因，其在自噬体-溶酶体融合的调控中发挥重要作用，此外，BNIP3可结合LC3促进线粒体自噬反应发生，因此BNIP3是评估线粒体自噬的重要标志物36。NIX 与 BNIP3 结构相998 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化心脑血管疾病研究似，在红细胞谱系发育过程中，NIX是线粒体自噬所必需的蛋白，HIF-1可诱导缺氧靶基因激活，促进NIX与BNIP3的表达，参与调节线粒体自噬37。本研究结果表明，与Sham组相比，I/R组HIF-1、BNIP3、NIX表达及 LC3-/LC3-比值明显升高，说明大鼠发生MIRI后，心肌组织缺血缺氧导致HIF-1蛋白升高，引起线粒体自噬发生；经过柴胡三参胶囊预处理后，HIF-1、BNIP3、NIX表达及LC3-/LC3-比值进一步升高，线粒体膜电位及线粒体内自噬小体数目也随之升高，说明柴胡三参胶囊可进一步促进MIRI后大鼠心肌组织HIF-1表达，促进线粒体自噬发生，以发挥心肌保护作用。2ME2是HIF-1的抑制剂，与I/R组相比，2ME2 组 HIF-1、BNIP3、NIX 表达及 LC3-/LC3-比值明显降低，线粒体膜电位及线粒体内自噬小体数目也随之降低，说明2ME2可通过抑制HIF-1表达，间接抑制心肌细胞线粒体自噬发生，导致心肌组织进一步损伤。与 2ME2 组相比，2ME2+CHSS 组HIF-1、BNIP3、NIX表达及LC3-/LC3-比值明显升高，线粒体膜电位及线粒体内自噬小体数目也随之升高，说明柴胡三参胶囊可逆转2ME2对HIF-1的抑制作用，使心肌细胞HIF-1的表达与线粒体自噬反应得以恢复。HIF-1化学结构极不稳定，受细胞内氧感受器脯氨酸羟化酶（Proline hydroxylase，PHD）和天冬氨酸羟化酶（Aspartate hydroxylase，ASPH）调节，在常氧环境下，HIF-1 的亚基经过泛素化过程可被降解，缺氧时，泛素化过程被抑制，使其在细胞内蓄积38。此外，在常氧环境下，缺氧诱导因子抑制因子 1（Factor inhibiting hypoxia-inducible factor-1，FIH-1）会特异性地羟化HIF-1的天冬氨酸，阻止HIF-1与转录辅因子p300/CBP结合，抑制其靶基因的转录活性，当氧气浓度明显下降后，FIH-1活性降低，从而无法完成对HIF-1的羟基化修饰，使HIF-1稳定表达39。研究表明缺氧环境和药物影响均可引起 HIF-1 表达升高40。由于实验条件及其他原因，尚未得知柴胡三参胶囊对HIF-1发挥调控作用的具体机制，HIF-1调控线粒体自噬的机制，也是尚未解决的问题。线粒体自噬是一种心脏保护措施，可以清除有缺陷的线粒体并维持细胞内稳态，而过度的自噬也会损伤正常的线粒体功能41。尽管在某些领域，线粒体自噬在 MRIR中是否存在积极的治理作用仍具有广泛争议，但不可否认其在该病中的重要性，而调节线粒体自噬可使MIRI出现不同的转归。综上所述，调节 MIRI后心肌细胞线粒体自噬反应，可能成为治疗MIRI新的靶点，本实验在以往研究的基础上，从实验的角度出发，证实中药柴胡三参胶囊对MIRI有明确的治疗作用，其可能通过激活HIF-1/BNIP3/NIX通路，诱导心肌细胞发生线粒体自噬反应，清除损伤的线粒体，发挥其疗效，为该药治疗MIRI提供了一定的实验依据。参考文献 21中国心血管健康与疾病报告2020 编写组.中国心血管健康与疾病报告2020 概述.中国心血管病研究,2021,19(7):582-590.2Wang J,Toan S,Zhou H.New insights into the role of mitochondria in cardiac microvascular ischemia/reperfusion injury.Angiogenesis,2020,23(3):299-314.3Sousa Fialho M D L,Abd Jamil A H,Stannard G A,et al.Hypoxia-inducible factor 1 signalling,metabolism and its therapeutic potential in cardiovascular disease.BBiochim Biophys Acta Mol Basis Dis,2019,1865(4):831-843.4Semenza G L.Hypoxia-inducible factor 1 and cardiovascular disease.Annu Rev Physiol,2014,76:39-56.5Kido M,Du L L,Sullivan C C,et al.Hypoxia-inducible factor 1-alpha reduces infarction and attenuates progression of cardiac dysfunction after myocardial infarction in the mouse.J Am Coll Cardiol,2005,46(11):2116-2124.6Zheng J,Chen P 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