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992不同酶组合致兔眼玻璃体液化的实验研究Modern Practical Medicine,August 2023,Vol.35,No.8陈萍萍，骆阳，徐博怀，杨路【摘要】目的探讨透明质酸酶(HA)联合纤溶酶(PL)及软骨素酶(CA)联合基质金属蛋白酶3(MMP-3)诱导免眼玻璃体液化及玻璃体后脱离（PVD）的快速性、安全性及有效性。方法通过完全随机分组法将2 4只新西兰白免分成3组，A组11只，B组11只，C组2 只作为空白组，A组和B组白免均以右眼为实验眼，左眼为对照眼。两组实验眼分别注射2 0 IUHA+1IUPL及0.2 UCA+10ngMMP-3于视盘前玻璃体后1/3处，两组对照眼相同部位注射BSS0.1ml,C组不做任何处理。注药前后，进行肉眼、裂隙灯显微镜、间接检眼镜和眼部B超检查。注射后3、7、14d摘除眼球，进行冰冻切片行HE染色观察。结果HE染色显示两组实验眼视网膜结构清晰完整，排列整齐，未见明显视网膜异常。0.2 UCA联合10 ngMMP-3及2 0 IUHA联合1IUPL应用玻璃体内注射均可以诱导玻璃体液化和完全性PVD的发生，0.2 UCA联合10 ngMMP-3诱导玻璃体液化及PVD更具快速性且在第7 天诱导效果更佳。结论两组药物均对视网膜和其他眼内组织是安全的，均可有效诱导PVD,0.2UCA联合10 ngMMP-3所致免眼玻璃体液化效果更为快速。【关键词】玻璃体液化；透明质酸酶；纤溶酶；软骨素酶；基质金属蛋白酶-3doi:10.3969/j.issn.1671-0800.2023.08.004【中图分类号】R776.4Experimental study on vitreous liquefaction induced by different enzyme combinations in rabbitsChen Pingping,Luo Yang,Xu Bohuai,Yang Lu(Ningbo Eye Hospital,Ningbo 315000,Zhejiang,China)AbstractJObjective To investigate the rapidity,safety and effectiveness of hyaluronidase(HA)combined withplasmin(PL)and chondroitin enzyme(CA)combined with matrix metalloproteinase 3(MMP-3)in inducing vitreousliquefaction and posterior vitreous detachment(PVD)in rabbits.Methods Twenty-four rabbits were randomly di-vided into three groups,including eleven rabbits in group A,eleven rabbits in group B and two rabbits in group C asthe blank group.One eye of each rabbit in either group A and B were experimental eye and the other eye was controleye.The position of drug injection was in posterior 1/3 of vitreous before papillary.The experimental eyes of group Awere treated with 20IU HA and 1IU PL.Also,the experimental eyes of group B were treated with 0.2U CA and 10ngMMP-3.The control group was received equivalent dose of balanced salt solution(BSS).Group C would not acceptany processing.Before and after injection,visual examination,slit lamp microscope,indirect ophthalmoscope,B-ultrasound examination were performed.Eyes were removed on the 3rd,7th,and 14th day after injection,and frozensections were performed for HE staining observation.Results HE staining showed that the retinal structures of thetwo experimental groups were clear and complete,arranged neatly,and no obvious retinal abnormalities were ob-served.Both 0.2 U CA combined with 10 ng MMP-3 and 20 IU HA combined with 1 IU PL intravitreal injectioncould induce vitreous liquefaction and complete PVD.0.2 U CA combined with 10 ng MMP-3 induced vitreous li-quefaction and PVD more quickly and had better induction effect on the 7th day.Conclusions Both groups of drugsare safe for the retina and other intraocular tissues,and both can effectively induce PVD.The effect of 0.2 U CA com-bined with 1Ong MMP-3 on vitreous liquefaction in rabbit eyes is taken more quickly.Key words】Vi t r e o u s l i q u e f a c t i o n;H y a l u r o n i d a s e;Pl a s mi n;Ch o n d r o i t i n a s e;M a t r i x me t a l l o p r o t e i n a s e-3玻璃体是眼晴屈光介质的一个组成部分，水占玻璃体的9 8%，大分子物质占玻璃体的0.15%，包括作者单位：3150 40 宁波，宁波市眼科医院（陈萍萍）；宁波大学医学部(骆阳)；宁波大学附属第一医院（徐博怀、杨路）通信作者：杨路，Email：y a n g l u n b u.e d u.c n【文献标志码】A【文章编号】16 7 1-0 8 0 0(2 0 2 3)0 8-0 9 9 2-0 4Modern Practical Medicine,2023,35(8):992-995透明质酸、胶原纤维和可溶性的蛋白质。主要结构成分是细纤维网状支架中的I型胶原纤维和交织于支架间的透明质酸粘多糖，其中II型胶原纤维是玻璃体中的主要胶原成分，占胶原纤维总量的7 0%80%。胶原纤维的支架结构随着年龄增长而收缩现代实用医学2 0 2 3年8 月第35卷第8 期和塌陷，进一步导致玻璃体液化和玻璃体后脱离(PVD)。玻璃体的液化与许多眼病有关，如黄斑裂孔、视网膜脱离及玻璃体积血等。因此，构建玻璃体液化模型，进一步研究玻璃体液化机理，寻求更好的预防和治疗方法具有重要意义。目前已发现有多种酶可诱发玻璃体液化，如软骨素酶（CA）、基质金属蛋白酶3（MMP-3）、透明质酸酶（HA）、纤溶酶(PL)、胶原酶、中性蛋白酶及纳豆激酶等。本研究应用2 0 IUHA联合1IUPL及0.2 UCA联合10 ngMMP-3两种组合酶进行兔眼玻璃体腔内注射,对兔眼进行临床检查及HE染色，旨在观察及比较两种组合酶诱导玻璃体液化及PVD的快速性、有效性和安全性，现报道如下。1资料与方法1.1动物准备健康成年新西兰白兔2 4只（由宁波大学医学部实验动物中心提供），雌雄不拘，月龄为45个月，体质量为2.53.0 kg。将2 4只白兔采用完全随机分组法分成3组，A组11只，B组11只，C组2 只作为空白组，A及B组均以右眼为实验眼，左眼为对照眼。实验前复方托吡卡胺眼药水散瞳，做常规眼科检查，包括肉眼、裂隙灯显微镜（十9 0 D前置镜）、间接检眼镜及眼部B超检查等，以排除免眼疾患。本研究经宁波大学实验动物伦理委员会审批通过。1.2实验试剂HA（北京索莱宝产品）、PL（美国Sigma产品）、CA（美国Sigma产品）、MMP-3（美国Sigma产品），在注射前均用平衡盐溶液(BSS液)稀释，浓度分别为2 0 IU/0.05ml、1I U/0.0 5m l、0.2U/0.05 ml 和 10 ng/0.05 ml。1.3方法玻璃体腔注射：注射前1d两组兔眼均用加替沙星眼膏涂眼2 次，全身麻醉后两组实验眼于视乳头前玻璃体后1/3部位分别注射2 0 IUHA联合1IUPL及0.2 UCA联合10 ngMMP-3，两组对照眼相同部位注射BSS0.1ml,C组不做任何处理。术后加替沙星眼药膏涂眼，继续2 次/d，用3d。所有操作均为同一组人员完成。1.4?观察指标在注射后1h进行第一次观察，之后每天观察1次直至其被处死。在每次观察之前，用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，丙美卡因眼药水眼表麻醉，而后将兔子固定于兔子固定器内，用开脸器撑993开上下眼脸进行眼部检查。观察项目：肉眼、裂隙灯显微镜、十9 0 D前置镜及间接检眼镜检查，主要检查是否有炎症反应，晶状体、玻璃体和视网膜的变化。如果在第一次检查中发现手术引起的眼部损伤，则该兔眼不纳入实验。检查后滴用乳酸左氧氟沙星滴眼液。每天进行眼部B超检查，检查后用加替沙星眼药膏涂眼。注射后3、7、14d采用简单随机抽样法分别从A组及B组中各随机选择2 只兔子（4只眼），并于第14天从空白组中随机抽取兔一只(2 只眼）。眼球摘除后，从3组中随机抽取的兔子里再任取1只兔子（2 只眼）进行冰冻切片后HE染色，用光学显微镜检查。另一只兔子(2 只眼)放在一8 0 冰箱内存储。1.5统计方法采用SPSS25.0统计软件进行数据分析，计数资料比较采用Fisher精确概率法,P0.05表示差异有统计学意义。当进行两组之间比较时，值采用Bonferroni调整后的水平进行判断，调整水平为0.0 17，为原水平（0.0 5)与分组数量(3)的比值，两两比较时P0.05)，在注射后第7 天，3组PVD差异有统计学意义(P0.017)，两组药物引起完全性PVD及部分性PVD差异有统计学意义(P0.017);A、B组实验眼与对照组 PVD差异均有统计学意义（均P0.017)。注药后第14天，3组PVD差异有统计学意义（P0.017)，两组药物引起完全性PVD及部分性PVD差异无统计学意义(P0.017);A、B组实验眼与对照组PVD差异均有统计学意义(均P0.017)。A 组药物注射后3、7、14d形成PVD差异有统计学意义(P0.05);B组药物注射后3、7、14d形成PVD差异有统计学意义(P0.05),且在3d与7 d以及3d与14d形成PVD差异均有统计学意义（均P0.017）。B组3d与7 d药物诱导完全性PVD及部分性PVD差异有统计学意义(P0.017)，见表3。3讨论药物的眼内注射部位对PVD的形成非常重要。由于玻璃体胶原纤维和透明质酸在玻璃体后皮质具有高密度，并且玻璃体后皮质紧密地黏附于黄斑、视乳头及血管周围。因此，本研究将药物注射到兔眼GainS5dBDDIRIOha注：a为裂隙灯检查免眼前节组织，b为裂隙灯（+9 0 D前置镜）检查兔眼底的正常视网膜，c为裂隙灯（+9 0 D前置镜）检查兔眼玻璃体，可见浓缩玻璃体后皮质（箭头），d为眼部B超检查兔眼玻璃体，可见玻璃体完全后脱离（箭头）b图1裂隙灯显微镜联合眼部B超观察免眼结果Cda注：a为A组实验眼的后极部视网膜，b为B组实验眼的后极部视网膜，c为对照组的后极部视网膜，d为C组空白组的后极部视网膜；为神经节细胞核，为双极细胞层，为光感受器细胞核，为视网膜色素上皮细胞只眼组别术后3dNPVDPPVD实验眼A8/11实验眼B7/11对照眼A11/11对照眼B11/11b图2 视网膜冰冻切片光学显微镜检查结果(HE染色，40 0)表3注射后不同时间实验组和对照组兔眼PVD的形成情况CPVDNPVD3/110/114/110/110/110/110/110/11C术后7 dPPVD3/96/90/91/98/91/99/90/9d术后14dCPVDNPVD0/90/78/90/70/96/70/96/7PPVD2/70/71/71/7CPVD5/77/70/70/7现代实用医学2 0 2 3年8 月第35卷第8 期玻璃体中后1/3处，很好的诱导出兔眼PVD。本实验研究发现两组联合酶均能有效诱导玻璃体液化及PVD，H A 可以快速有效地降解存在于玻璃体胶原纤维之间的透明质酸聚合物，导致玻璃体凝缩并促使玻璃体支架塌陷，这有利于PL快速扩散到玻璃体视网膜交界处5-。PL能够降解在玻璃体视网膜交界面的层粘连蛋白、纤连蛋白及其他分子胶。PL能激活基质金属蛋白酶，促使视网膜内界膜IV型胶原降解，从而诱导完全性PVDI7。虽然PL不能直接降解玻璃体视网膜交界面的IV型胶原，但它可以间接将IV型胶原纤维暴露，使其被其他酶消化8-1,还通过激活胶原酶,释放弹性蛋白酶,产生纤维连接蛋白降解产物，起到消化IV型胶原纤维的作用 10-11。MMP-3能在玻璃体视网膜交界面特异性水解细胞外基质，如纤连蛋白及层粘连蛋白等12 。CA能特异性水解硫酸软骨素蛋白多糖,从而破坏玻璃体凝胶稳态，同时还可降低玻璃体视网膜界面的分子粘连明。虽然两组联合酶在形成PVD方面总体结果大致相同，但在注射后7 d形成完全性PVD和部分PVD时，0.2 UCA联合10 ngMMP-3的效果明显好于2 0IUHA联合1IUPL。而且，笔者在进一步比较每组联合酶的术后3、7、14d形成PVD时，发现A组在注射后7 d时，仍未全部形成PVD；在注射后14d时，仍有2 只兔眼未形成完全性PVD。而B组在注射后7 d已全部形成PVD；在注射后14d全部形成完全性PVD。这说明0.2 UCA联合10 ngMMP-3组诱导形成玻璃体液化及PVD的快速性优于2 0 IUHA联合1 IUPL 组。0.2 U CA 联合 10 ng MMP-3组也有不足之处，如药物引起眼前房炎症反应较重，不过在注射5d后均恢复正常且未见明显视网膜异常。综上所述，本实验证实了0.2 UCA联合10 ngMMP-3及2 0 IUHA联合1IUPL应用玻璃体内注射均可以诱导玻璃体液化和完全性PVD的发生，并且对眼组织无明显毒性作用，两组联合酶诱导形成玻璃体液化及PVD总体结果基本一致，这说明这两组联合酶均是药物诱导PVD的一种较为理想的试剂。但是0.2 UCA联合10 ngMMP-3诱导玻璃体液化及PVD更具快速性且在第7 天诱导效果更佳。因此，0.2 UCA联合10 ngMMP-3所致兔眼玻璃体液化效果更为快速、安全及有效。若使用其中一种995联合酶建立玻璃体液化模型进行研究，需综合考虑其研究目的，快速形成PVD且不需要前期采取房水研究，建议选用0.2 UCA联合10 ngMMP-3;需要采取房水做进一步研究且无时间限制，考虑到0.2 UCA联合10 ngMMP-3注射引起前期的前房炎症反应较重，可能会影响房水测定，建议选用2 0 IUHA联合1IUPL。利益冲突所有作者声明无利益冲突作者贡献声明陈萍萍：实验操作、论文撰写；骆阳、徐博怀：数据整理、统计学分析；杨路：研究指导、论文修改、经费支持参考文献1陈萍萍,杨路,陈曦.玻璃体液化机制的研究进展1.现代实用医学,2 0 18,30(6):8 38-8 40.2BISHOP P N,HOLMES D F,KADLER K E,et al.Age-relatedchanges on the surface of vitreous collagen fibrilsJ.Invest Oph-thalmol Vis Sci,2004,45(4):1041-1046.3吴煜波,王晨光,苏冠方.药物诱导玻璃体液化及后脱离的研究现状.中国实验诊断学,2 0 19,2 3(11):2 0 2 0-2 0 2 5.4 EZRA E.Idiopthicful thickness maeular hole:natural history andpathogenesisJ.Br JOphthalmol,2001,85(7):102-108.5李琪,韩静,严宏.纤溶酶联合透明质酸酶最佳组合诱导玻璃体后脱离的研究.眼科新进展,2 0 10,30(11):10 0 5-10 0 8.6 HUANG D,CHEN Y S,XU Q,et al.Effects of enzymatic degrad-ation on dynamic mechanical properties of the vitreous and intravi-treal nanoparticle mobilityJ.European Journal of PharmaceuticalSciences,2018,118:124-133.73王志良，施沃栋,张皙纤溶酶和透明质酸酶药物性玻璃体切割术的发生机制.眼科研究,2 0 10,2 8(2):149-152.8UNAL M,PEYMANG A.The efficacy of plasminogen-urokinasecombination in inducing posterior vitreous detachmentJ.Retina,2000,20(1):69-75.9】王莉菲.玻璃体视网膜交界面酶溶解分离研究D石家庄:河北医科大学,2 0 0 2.10 MAINARDI C L,DIXIT S N,KANG A H.Degradation of type IV(basement membrane)collagen by a proteinase isolated from hu-man polymorphonuclear leukocyte 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