lncRNA RARB-AS2对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、细胞周期和侵袭的影响及分子机制.pdf

基金项目：国家自然科学基金项目（）作者简介：李曦雯，女，生，硕士，主治医师，：收稿日期：对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、细胞周期和侵袭的影响及分子机制李曦雯，王瑾，朱瑶琪，宋晓萌（湖北省第三人民医院口腔科，武汉 ；南京医科大学附属口腔医院口腔颌面外科；通讯作者，：）摘要：目的观察长链非编码 （）在口腔鳞状细胞癌组织中的表达，探讨 对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、细胞周期和侵袭的影响及分子机制。方法癌症基因组图谱（）数据库分析 在口腔鳞状细胞癌组织和癌旁组织中表达水平。实时荧光定量 （）检测 在 种口腔鳞状细胞癌细胞 、以及口腔上皮角质细胞 中表达水平。通过脂质体转染法在 细胞中分别转染 高表达质粒和对照质粒，定义为 组和对照组。检测 细胞中 表达水平。平板克隆实验、流式细胞术和 实验分别检测 细胞增殖、细胞周期和侵袭能力。双荧光素酶报告实验验证 和 的靶向关系。数据库分析口腔鳞状细胞癌组织中 和 表达的相关性。检测 细胞中 表达水平。法检测 细胞中 信号通路蛋白 、表达。结果口腔鳞状细胞癌组织中 表达显著低于癌旁组织（）。与口腔上皮角质细胞 比较，口腔鳞状细胞癌细胞系 、中 呈低表达（），在 细胞中 表达最低（）。与对照组比较，组 细胞的增殖能力显著降低（），细胞位于 期比例显著升高（），期比例显著下降（），期比例显著下降（），细胞的侵袭能力显著降低（）。与 间存在互补关系（）。口腔鳞状细胞癌组织中 与 表达呈负相关（）。与对照组比较，组 细胞中 表达显著降低（），信号通路蛋白 、表达减少（）。结论口腔鳞状细胞癌组织和细胞系中 呈低表达，可能通过调控 信号通路，抑制口腔鳞状细胞癌 细胞的增殖、侵袭。关键词：口腔鳞状细胞癌；细胞增殖；细胞侵袭中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，；，：）：（），（）（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）（）（），（），（），：；口腔鳞状细胞癌是常见的口腔恶性肿瘤，其复发率以及病死率均很高 。手术和药物治疗是口腔鳞状细胞癌的主要治疗方式，其耐药性和易复发导致患者预后较差 。长链非编码 （），一种内源性核酸序列，没有编码蛋白的功能，其在细胞炎症、线粒体功能、氧化应激等活动方面发挥重要作用 。随着转录组学的发展，被发现与恶性肿瘤的发展进程有关 。在各种肿瘤的发病机制中表现为促癌因子或抑癌因子的作用，影响肿瘤细胞的凋亡、化疗耐药、炎性因子释放等过程 。人类基因命名法（，）数据库显示，基因定位于 染色体区域，是由 个核苷酸组成的 。目前关于 的研究报道很少，其对口腔鳞状细胞癌细胞恶性生物学行为的影响值得研究。本研究观察 在口腔鳞状细胞癌组织中的表达，探究 对口腔鳞状细胞癌增殖、细胞周期和侵袭的作用及分子机制，以期为治疗口腔鳞状细胞癌提供新的分子靶点。材料和方法 细胞株及主要试剂口腔上皮角质细胞 、口腔鳞状细胞癌细胞（、）均购自上海中乔新舟生物科技有限公司。培养基、口腔角质细胞培养基购自美国 公司。胎牛血清、试剂盒购自美国 公司。细胞周期试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国 公司。对照质粒、高表达质粒、荧光素酶表达载体野生型 和突变型 购自上海碧云天生物技术有限公司。、小室购自美国 公司。和基质胶购自上海生工生物工程公司。一抗兔源 、购自美国 公司。生物信息学分析癌症基因组图谱（，）数据分析 在口腔鳞状细胞癌组织及癌旁组织中的表达。在线网站预测 和 间 的 靶 向 关 系。数据库分析 和 在口腔鳞状细胞癌组织中表达的相关性。细胞培养和转染将 细胞接种在含 胎牛血清的口腔角质细胞培养基中培养，将 、细胞接种在含 胎牛血清的 培养基中培养，培养箱参数设定为 、。将 细胞接种在 孔板，每孔汇合度达 ，在 细胞中分别转染对照质粒或 高表达质粒，定义为对照组和 组，操作按照 说明进行，后收集细胞。检测口腔鳞状细胞癌组织和细胞中 、表达水平按照 使用说明，提取细胞总 ，配制逆转录反应体系，以生成的 为反应模版。引物序列：正向引物序列：，负向引物序列：山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 ；正向引物序列：，负向引物序列：；正 向 引 物 序 列：，负向引物序列：；正向引物序列：，负向引物序列：。反应条件：，个循环。法计算 、表达量。平板克隆实验检测 细胞增殖能力收集对照组和 组 细胞，采用无血清培养基重悬为 个 的单细胞悬液，分别接种在 孔板。培养第 天，取出 孔板，甲醛固定 ，结晶紫染色 ，用 溶液清洗 次，肉眼观察、拍照。每组随机选 个视野，统计克隆数。流式细胞术（）检测 细胞周期分布将收集的对照组和 组 细胞重悬于 乙醇中，固定。离心弃上清，将 细胞重悬在结合缓冲液，每孔分别加 的 试剂，在避光环境中处理 。加入 结合缓冲液，流式细胞仪检测，软件分析各组 细胞的周期比例。实验检测 细胞侵袭能力预先将基质胶加到 上室，室温下固定 。收集对照组和 组 细胞，采用无血清培养基重悬为 个 的单细胞悬液，上室加入 悬液，同时在下室加入 含血清培养基，其中下室的血清作为诱导剂。常规培养 ，甲醛固定 ，结晶紫染色 ，用 溶液清洗 次，采用显微镜观察、拍照。每组随机选 个视野，统计穿膜细胞数。双荧光素酶报告基因实验检测 和 的靶向关系将 细胞接种在 孔板，每孔汇合度达 ，将 、分 别 与 、共转染 细胞。转染第 小时，收集各组 细胞，采用发光检测仪检测各组 细胞的荧光素酶活性。法检测 信号通路蛋白表达加入中性裂解液至对照组和 组，冰上裂解 ，低温超声破碎，加入上样缓冲液后变性蛋白。蛋白电泳后经湿转法至硝酸纤维素膜，脱脂牛奶封闭 。加入一抗 、，一抗均以 比例稀释，过夜孵育。二抗以 稀释，室温下处理 。通过 化学发光法，在暗室中显影。统计学分析所有实验均重复 次。采用统计学软件 分析数据，计量数据以均数 标准差（珋 ）表示，两组间数据比较行 检验，多组间数据比较行单因素方差分析，以 表示差异有统计学意义。结果 口腔鳞状细胞癌组织和细胞中 呈低表达 数据库分析显示，与癌旁组织相比，口腔鳞状细胞癌组织中 明显低表达（，见图 ）。检测结果显示，与 细胞比较，口腔鳞状细胞癌细胞 、中 呈低表达（，见图 ），在 细胞中 表达最低，因此选择 细胞行后续实验。高表达 的 细胞构建成功 检测显示，组和对照组 细胞 表达分别为 和 ，组 表达水平显著高于对照组（），表明高表达 的 细胞构建成功。转染 高表达质粒抑制 细胞的增殖平板克隆实验显示，组和对照组 细胞克隆形成数分别为（）个和（）个，组 细胞克隆形成数显著下降（，见图 ）。转染 高表达质粒抑制 细胞周期流式细胞术显示，与对照组相比，组 期比例显著升高（），期比例显著下降（），期比例显著下降（，见图 ）。，与 细胞相比，与癌旁组织相比，图 在口腔鳞状细胞癌组织以及细胞系中的表达 与对照组比较，图 高表达 对 细胞增殖的影响 与对照组比较，图 高表达 对 细胞周期的影响 转染 高表达质粒抑制 细胞侵袭 实验显示，组和对照组 侵袭细胞数分别为（）个和（）个，组 细胞侵袭能力显著降低（，见图 ）。山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期与对照组比较，图 实验检测高表达 对 细胞侵袭的影响（）（）与 存在靶向关系且两者负相关 在线网站预测显示，与 存在互补核苷酸序列（图 ）。双荧光素酶报告基因实验显示，与 组 相 比，组 细胞荧光素酶活性明显下降（，见图 ）。数据库分析显示，口腔鳞状细胞癌组织中 的表达与 表达呈现负相关（，见图 ）。图 与 的靶向关系 转染 高表达质粒负调控 表达 检测显示，组和对照组 细胞中 表达分别为 和 ，组 表达显著降低（）。转染 高表达质粒抑制 信号通路蛋白表达 显示，与对照组相比，组 细胞中 信号通路蛋白 、表达明显减弱（见图 ）。，与对照组比较，图 上调 表达对 细胞 信号通路蛋白表达的影响 讨论 是非编码 家族中的一类长链 ，参与喉癌、输尿管癌、视网膜母细胞瘤等各种肿瘤的病理进展，是潜在的肿瘤预后标志物和治疗靶点 。口腔鳞状细胞癌具有病死率高和易复发的特点，寻找口腔鳞状细胞癌的早期筛查和治疗靶点有助于早期干预肿瘤的进展 。近年来，作为口腔鳞状细胞癌的生物标志物和治疗靶点研究受到广泛关注 ，。等 研究发现，在口腔鳞状细胞癌组织和细胞中上调，沉默 可抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖迁移、侵袭，并促进细胞凋亡，通过激活 信号通路促进口腔鳞状细胞癌细胞中的上皮间充质转化过程。等 研究发现，口腔鳞状细胞癌中 过表达预示着较差的生存率，通过促进膜联蛋白 表达增强口腔鳞状细胞癌细胞的侵袭和迁移能力。目前，的研究报道很少，其在口腔鳞状细胞癌发生和发展中的作用并不明确。本研究旨在探究 在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及对口腔鳞状细胞癌增殖、细胞周期和侵袭的影响及分子机制。本研究结果显示，口腔鳞状细胞癌组织和细胞中 表达显著降低，推测 的表达与口腔鳞状细胞癌发生和发展相关。本研究通过转染 高表达质粒上调 细胞中 表达，结果显示 细胞在 表达上调后，其增殖和侵袭能力均减弱，细胞被明显抑制在 期。已被证实在肿瘤细胞中通过结合 ，降低 表达水平，从而发挥抑癌或致癌作用 ，。例如 等 研究显示，通过靶向 抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖。本研究经生物信息学分析显示，能够靶向 。本研究进一步通过双荧光素酶报告基因实验证实 能够竞争性吸附 。同时，本研究结果显示上调 的 细胞中 表达显著降低。多项研究显示，在口腔鳞状细胞癌组织和细胞中高表达，敲减 后，口腔鳞状细胞癌进展受到抑制，细胞周期被阻滞 ，。信号通路在口腔鳞状细胞癌细胞中被活化，显著促进口腔鳞状细胞癌的发生，而 能够激活 信号通路 ，。本研究结果显示，在 作用下，细胞中 信号通路蛋白表达均显著降低。以上结果表明，通过抑制 表达发挥作用。综上所述，口腔鳞状细胞癌组织和细胞中 呈低表达，能够通过调控 信号通路抑制口腔鳞状细胞癌 细胞的增殖、细胞周期和侵袭。可能成为口腔鳞状细胞癌的靶向治疗靶点。参考文献：，：，（）：山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 ，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，