菠萝SLF_SFB基因家族全基因组鉴定与表达分析.pdf

热带作物学报 2023,44(7):13171327 Chinese Journal of Tropical Crops 收稿日期 2022-08-03；修回日期 2022-09-22 基金项目 国家重点研发计划专项（No.2019YFD1001104）；海南省自然科学基金项目（No.322QN377）；农业农村部物种品种资源保护项目（No.125163006000160001）。作者简介 井敏敏（1990），女，硕士，研究实习员，研究方向：热带果树种质资源。*通信作者（Corresponding author）：陈晶晶（CHEN Jingjing），E-mail：。菠萝 SLF/SFB 基因家族全基因组鉴定与表达分析 井敏敏，李小针，李栋梁，戴小红，顾帅磊，马朝明，陈志辉，陈晶晶*中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/国家热带果树种质资源圃（湛江）/农业农村部热带果树生物学重点实验室，广东湛江 524091 摘 要：自交不亲和性是高等植物通过抑制自花授粉来阻止近亲繁殖的一种繁殖机制。在以茄科、蔷薇科、车前草科为代表的配子体自交不亲和机制中，花粉和雌蕊之间的自我/非自我识别由多态性 S 位点决定，其中 SLF（S-locus F-box）/SFB（S-haplotype-specific F-box）基因是配子体自交不亲和花粉 S 决定因子。本研究通过生物信息学方法从菠萝基因组中筛选鉴定出 21 个 SLF/SFB 家族基因（AcSLF1AcSLF21），各 AcSLF 基因在 N 端具有 F-box 保守结构域，其氨基酸长度、理论等电点、分子量存在较大差异，编码氨基酸序列大小范围为 242612 aa，分子量为 27.77869.070 kDa，其中 18 个 AcSLFs 蛋白偏碱性，总体蛋白稳定性较差，预测 18 个 AcSLFs 蛋白亚细胞定位于细胞核中，蛋白二级结构60%以上由-螺旋和无规则卷曲组成。通过染色体定位分析发现其不均匀地分布在 14 条染色体上，其中 AcSLF21 未定位到具体染色体位置，并发现 AcSLF4、AcSLF5、AcSLF6、AcSLF8、AcSLF14 和 AcSLF15 与菠萝 RNase T2 家族基因发生连锁。从进化关系中发现，菠萝 SLF/SFB 家族与蔷薇科、车前科、茄科植物 SLF/SFB 进化关系较远。利用 qRT-PCR对 AcSLFs 基因在菠萝雌蕊、雄蕊、叶片、果肉、茎和根的表达量进行分析，结果发现 AcSLFs 基因在菠萝不同组织中具有明显的表达差异性，其中 AcSLF1、AcSLF2、AcSLF4、AcSLF9、AcSLF10、AcSLF11、AcSLF15、AcSLF19、AcSLF20、AcSLF21 基因在菠萝雄蕊中呈高表达量，AcSLF3、AcSLF7 在果肉中表达量最高，AcSLF5、AcSLF12、AcSLF18 在根中表达量显著高于其他组织，总体来说，大部分菠萝 AcSLFs 基因主要在菠萝雄蕊或叶片中高表达。同时分析了雌蕊自花、异花授粉前后的表达变化，发现 AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15 三个基因在授粉雌蕊中的表达量较未授粉显著上调，尤其在授粉 6 h 表达量急剧上调，随着花粉管的伸长其表达量降低，但在授粉 24 h 仍具有较高的表达量，推测这些基因可能在菠萝自交不亲和中起到重要作用。该研究为菠萝 SLF/SFB 家族基因的克隆提供参考，并为菠萝自交不亲和机制研究奠定良好基础。关键词：菠萝；SLF/SFB 基因家族；生物信息学；表达量分析 中图分类号：S668.3 文献标识码：A Genome-wide Identification and Expressions Analysis of SLF/SFB Gene Family in Pineapple JING Minmin,LI Xiaozhen,LI Dongliang,DAI Xiaohong,GU Shuailei,MA Chaoming,CHEN Zhihui,CHEN Jingjing*South Subtropical Crops Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/National Field Genebank for Tropical Fruit(Zhanjiang)/Key Laboratory of Tropical Fruit Tree Biology,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Zhanjiang,Guangdong 524091,China Abstract:Self-incompatibility is a genetic mechanism to prevent self-fertilization and the consequent inbreeding and fitness decay in plant populations.In the gametophyte self-incompatibility mechanism represented by Solanaceae,Rosaceae and Plantaginaceae,the self/non-self recognition between pollen and pistil is determined by the polymorphic S locus.SLF(S-locus F-box)/SFB(S-haplotype-specific F-box)gene is the pollen S determinant of gametophyte 1318 热带作物学报 第 44 卷 self-incompatibility.In this study,21 SLF/SFB family genes were screened and identified based on the genome-wide of the pineapple.Each AcSLF gene had an F-box conserved domain at the N-terminal.There were great differences in amino acid length,theoretical isoelectric point and molecular weight.The size range of the encoded amino acid se-quence was 242-612 aa,and the molecular weight was 27.778-69.070 kDa.The isoelectric point ranged from 5.70 to 9.57.18 AcSLF proteins were alkaline and most proteins were unstability,only AcSLF19,AcSLF21 were stability.It was predicted that 18 AcSLF proteins were located in the nucleus,one AcSLF protein in chloroplast,two AcSLF protein in both chloroplast and nucleus,and more than 60%of the secondary structure of the protein was composed of alpha helix and random coil.Bioinformatics analysis showed that the pineapple SLF/SFB family genes,which were unevenly distributed on 14 chromosomes,and the chromosome location of AcSLF21 was undetermined.Furthermore,AcSLF4,AcSLF5,AcSLF6,AcSLF8,AcSLF14 and AcSLF15 were linked with RNase T2 family genes,this was one of the main characteristics of pollen SLF gene.AcSLF genes contained different numbers of introns,most of which contained 12 introns,and AcSLF3 contained 4 introns.Based on the above analysis results,it showed that AcSLF proteins had dif-ferent characteristics.Phylogenetic analysis indicated that the evolutionary relationship of AcSLFs in pineapple was far away from the SLF/SFB in Rosaceae,Plantaginaceae and Solanaceae,the degree of clustering was low on the branches of evolutionary tree.The expression levels of the AcSLF genes in pistil,stamen,leaf,sarcocarp,stem and root were analyzed by qRT-PCR.The results showed that AcSLFs had obvious expression differences in different tissues of pine-apple.AcSLF1,AcSLF2,AcSLF4,AcSLF9,AcSLF10,AcSLF11,AcSLF15,AcSLF19,AcSLF20 and AcSLF21 genes were highly expressed in pineapple stamens.The expression of AcSLF3 and AcSLF7 in sarcocarp was higher than that of other tissue,and AcSLF5,AcSLF12,AcSLF18 were higher expression in root than other tissues.In general,most pine-apple AcSLF genes are mainly expressed in pineapple stamens or leaves.It was found that the expression of AcSLF1,AcSLF2,AcSLF15 genes in pollinated pistil were significantly up-regulated than that in non-pollinated pistil.Especially at 6 h after cross-pollination,the expression level was significantly higher than that of non-pollinated pistils.With the extension of the pollen tube in the pistil,the expression level decreased,but it still had a high expression at 24 h after pollination.And the expression trend of AcSLF1,AcSLF2 and AcSLF15 in cross-pollination was consistent with the growth of pollen tube in the pistil.Therefore,it is speculated that AcSLF1,AcSLF2 and AcSLF15 play an important role in pineapple self-incompatibility.This is the first time to analyze the expression pattern of SLF/SFB family genes in pineapple.This study would provide a reference for the cloning of pineapple SLF/SFB family genes,and basis for the study of pineapple self-incompatibility mechanism.Keywords:pineapple;SLF/SFB gene family;bioinformatic;expression analysis DOI:10.3969/j.issn.1000-2561.2023.07.002 植物自交不亲和性（self-incompatibility,SI）是指绿色开花植物能产生正常的配子，但自花不能正常授粉或授粉后不能正常结籽的一种生殖隔离现象1。菠萝属于典型的自交不亲和植物，除了部分野生种外，多数菠萝品种自交不亲和，无法产生种子，而菠萝类群 Ananas comosus var.Comosus（主要是栽培菠萝）自交不亲和表现尤为突出。目前普遍认为菠萝属于配子体自交不亲和类型2-3，配子体自交不亲和是植物界分布最广泛的自交不亲和调控机制，目前在蔷薇科、玄参科、茄科、罂粟科等配子体自交不亲和类型植物的研究中表明，花柱自交不亲和的决定因子被确定为 S-RNase 基因，花粉决定因子为编码 F-box蛋白的 SLF(S-locus F-box)/SFB(S-haplotype-spe-cific F-box)基因4-5。花柱分泌的 S-RNase 可进入花粉管，通过自身的核糖核酸酶活性降解自花花核糖核酸酶活性降解自花花粉管中的 rRNA，造成花粉管细胞骨架解体6-7，从而抑制花粉管生长，造成自交不亲和，与 S-RNase 互作的 SLF/SFB 可通过形成 SCF 复合体泛素化非自我 S-RNase，泛素化的 S-RNase 最终被 26S 蛋白酶体降解8，从而消除了 S-RNase 的细胞毒性作用，花粉管可在花柱中继续生长。迄今为止，已经从茄科、蔷薇科和玄参科等多种配子体型自交不亲和植物中分离出近百个花柱关键基因 S-RNase9，且其作用机制已研究较深入，但花粉关键控制基因研究稍滞后。LAI 等10通过对金鱼草 S 基因座进行长片段测序，首次发现了 1 个与 S2-RNase 紧密连锁的编码 F-box 蛋白的基因 AhSLF-S2，该基因在花粉中特异性表达。蔷薇科植物梅、扁桃中也鉴定出多个在花粉中特异性表达，同时具有较高序列多态性的编码 F-box第 7 期 井敏敏等：菠萝 SLF/SFB 基因家族全基因组鉴定与表达分析 1319 蛋白的基因11-12。在金鱼草及矮牵牛中利用转基因技术证实了 S 基因座中的 F-box 基因决定了花粉自交不亲和特异性反应，并命名为 S-locus F-box（SLF）13。在蔷薇科植物中，花粉 S 决定因子缺乏统一的命名，苹果亚科花粉 S 候选基因被命名为S-locus F-box Brothers（SFBB）14，李属植物被命名为 S-haplotype-specific F-box（SFB）15。目前，关于菠萝自交不亲和的研究主要集中在组织细胞学和田间杂交试验上，菠萝自交不亲和的主要控制基因尚不明确。本研究利用生物信息学技术在菠萝基因组中分离出 21 个 SLF/SFB家族成员，并对其理化特性、基因结构、染色体分布、保守结构域以及系统进化关系进行详细分析，并对各基因在菠萝不同组织中的表达模式进行分析，同时对雌蕊授粉前后 AcSLF 基因的表达变化进行分析，以期为菠萝自交不亲和机制等方面研究提供理论基础。1 材料与方法 1.1 材料 供试材料金菠萝（MD2）、巴厘菠萝（Comte De Paris）种植于广东省湛江市南亚热带作物研究所国家热带果树种质资源圃，2 种材料均为自交不亲和材料，且巴厘菠萝授粉金菠萝为亲和可育。收集金菠萝、巴厘菠萝成熟花粉至离心管，用小毛刷蘸取花粉授于金菠萝柱头，分别于授粉 2、6、24 h 后取花柱，立即液氮冷冻，同时采集金菠萝叶片、雄蕊、未授粉雌蕊、果肉、茎、根组织样品进行冷冻，于80 保存备用。1.2 方法 1.2.1 菠萝SLF/SFB基因全基因组鉴定及理化特性分析 菠萝基因组数据从 Pineapple Genomics Database（http:/ NCBI 中下载已报道的 SLF/SFB 序列，采用 MEGA 5 软件17进行 Clustal W 核苷酸序列比对，然后利用 HMMER 软件的Hmmbuild 生成 SLF/SFB 的 HMM 种子文件，基于此种子文件，筛选菠萝 SLF/SFB 基因。利用 Expasy（https:/web.expasy.org/protparam/）在线软件进行理论等电点、蛋白分子量、不稳定指数、脂溶系数、疏水指数等分析。利用 Cell-PLoc 2.0（http:/ SOPMA（https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在线软件分析蛋白质二级结构。1.2.2 菠萝AcSLF基因染色体定位 利用TBtoo-ls18软件对菠萝 AcSLF 基因进行染色体定位作图。1.2.3 菠萝 AcSLF 系统进化树构建 利用 ME-GA5.0 软件构建菠萝 AcSLF 系统发育树，进化树构建方法为邻接法（Neighbor-joining method），bootstrap 值设置为 1000。1.2.4 菠萝 AcSLF 基因结构及蛋白结构域分析 从菠萝基因组数据库获得 21 个 AcSLFs 的基因组和 CDS 序 列，使 用 GSDS（http:/ SMART（http:/www.smart.embl-heidelberg.de/）在线软件进行分析，并由 TBtools 软件进行可视化作图。1.2.5 菠萝 AcSLF 基因表达分析 利用 OMGA RNA 提取试剂盒从菠萝不同组织（叶片、雄蕊、雌蕊、果肉、茎、根以及授粉后雌蕊）中提取总RNA，使用逆转录试剂盒合成 cDNA。利用 SYBR Green qPCR Master Mix 在 Quant StudioTM 6 Flex System 实时荧光定量 PCR 系统进行 qRT-PCR 分析，内参基因为 PP2A20（引物序列信息见表 1）。使用 2CT方法21计算各基因的相对表达水平。2 结果与分析 2.1 菠萝 SLF/SFB 基因鉴定与理化特性分析 通过对菠萝基因组检索和鉴定，共获得 21 个SLF/SFB 基因，按照其在染色体位置命名为AcSLF1AcSLF21。对 21 个菠萝 AcSLFs 进行理化特性分析，结果显示，AcSLFs 在氨基酸长度、理论等电点、分子量有较大差异，AcSLFs 的氨基酸序列大小范围为242612 aa，分子量介于27.778 69.070 kDa 之间，预测的 AcSLFs 的理论等电点（pI）为 5.709.57，除 AcSLF1、AcSLF5、AcSLF10、AcSLF15 外，其他蛋白偏碱性（pI7）。总体AcSLFs 蛋白稳定性较差，仅 AcSLF19、AcSLF21较稳定（表 2）。利用 Cell-PLoc 2.0 软件预测蛋白质亚细胞定位，预计有 18 种 AcSLFs 蛋白只定位于细胞核，AcSLF4 定位在叶绿体，AcSLF7、AcSLF17 在细胞核与叶绿体中均有分布。通过分析 AcSLFs 蛋白二级结构，发现由-螺旋（alpha helix）、延伸链（extended strand）、-转角（beta turn）和无规则卷曲（random coil）4 种构型组成，其中-螺旋和无规则卷曲占 60%以上，延伸链和-转角占 1320 热带作物学报 第 44 卷 表 1 qRT-PCR 引物序列 Tab.1 Sequence of qRT-PCR primers 引物名称 Primers name 正向引物序列（5-3）Forward primer sequence(5-3)反向引物序列（5-3）Reverse primer sequence(5-3)AcSLF1 TTCAAATGCGTGTCCAAGTC GCAGTAGAACACCCCAGAGG AcSLF2 GCATCAAACTCCCAATCGCCAT ATGAACTGCTTCCACGAGCC AcSLF3 TAACACCACCACCTTCTA TGACTGCTAACCATACCT AcSLF4 CCTATTGCTACCGGAATGGCTT ATTGCCGCCCATGAATTCGT AcSLF5 GGCAGTCGTTAATAATGAG CAGAGTGATCCAAGTGTT AcSLF6 GGTGAAGTCCCTCCTCCGAT ACGTAGGTTGCTTTGCCCTT AcSLF7 ACCACCACTTCCTCCAGATG CTGCAGGGGGAAGTATTCAG AcSLF8 TGATGAACAACTGCTTAT TAGACCACTCCTATGAAT AcSLF9 CCTAATTCCGGTGATCGTTGC CGGTCAACACCTACAACGAGA AcSLF10 GGCATTTGGGAGCTTGATAA CAAACTCCCCAAAACCTTGA AcSLF11 ACCTGGTGCGAAATTCCCT CCACTGAAGAAAATCGCCAGGA AcSLF12 ATGGGCCTTGTCTTCTTACGTT ACCAACCAGAATGCCCACTCG AcSLF13 CTTGCTATGATGGCTGCAAA GCATAGATGCTCCCATTGGT AcSLF14 ATGAACGGAGAGTTGTAT ATGATGGAATGGAGGATT AcSLF15 ATTCTGAGTCGCCGTACTTGC ACTCTCCATAGCCGCGTCCA AcSLF16 ATCCCTAGTGTTGCCCACTG GCCTTCCATCTCCAAAATGA AcSLF17 GCTGCCAACGAAATCTGTGCTT ACCCAGCCCAAAATAGCTCT AcSLF18 TGGATGCGAAGAAGACAGTG CGAGTGCCATTGCTTACAAA AcSLF19 AAGATCACGTTGCCCGACGA CCTATCCACCAGAGCCCACT AcSLF20 GCAGACAAACTTGCCGCCTA ACACGCACAGCATAAAGAGC AcSLF21 GTTGAAGGATCGCGCTAAAG CTTCTGGGTGGCCATAAAAA PP2A TTGTCATCGCTTCCTCCAAG GTGTTGTCCACCACAGTATGA 表 2 菠萝 SLF/SFB 基因家族成员特征 Tab.2 Characteristics of SLF/SFB family genes in pineapple 基因名称 Gene name 基因 ID Gene ID 氨基酸 Amino acid 理论等电点 Theoretical pI分子量 Molecular weight/kDa 不稳定指数Instability index 脂肪系数 Aliphatic index 总平均亲水性 Grand average of hydropathicity AcSLF1 Aco011265 346 5.95 38.794 45.41 79.51 0.171 AcSLF2 Aco015095 447 8.46 50.346 47.20 88.79 0.013 AcSLF3 Aco012216 258 8.74 29.555 51.15 91.51 0.067 AcSLF4 Aco001170 580 7.15 65.386 48.92 82.36 0.333 AcSLF5 Aco001134 438 5.70 48.506 54.17 79.95 0.277 AcSLF6 Aco000868 383 9.17 43.604 41.60 87.23 0.317 AcSLF7 Aco013971 390 8.20 44.503 54.68 80.77 0.181 AcSLF8 Aco014282 426 9.27 48.072 56.43 80.31 0.307 AcSLF9 Aco007541 421 8.42 48.790 49.48 92.57 0.092 AcSLF10 Aco010730 440 5.86 50.237 57.07 83.95 0.193 AcSLF11 Aco005545 407 6.12 46.666 52.50 81.67 0.131 AcSLF12 Aco018964 428 8.77 49.195 49.26 88.57 0.083 AcSLF13 Aco024998 432 7.82 48.687 44.48 89.37 0.073 AcSLF14 Aco004199 502 9.11 55.829 57.93 85.92 0.166 AcSLF15 Aco004110 476 5.97 52.626 52.27 86.64 0.214 AcSLF16 Aco003507 464 8.18 52.066 58.94 85.50 0.172 AcSLF17 Aco003647 242 8.38 27.778 44.13 91.03 0.258 AcSLF18 Aco021447 440 9.57 50.436 47.67 89.75 0.281 AcSLF19 Aco007352 372 9.09 42.378 38.24 83.04 0.065 AcSLF20 Aco013003 612 9.21 69.070 47.72 74.54 0.459 AcSLF21 Aco031303 372 9.01 42.350 38.04 83.04 0.062 第 7 期 井敏敏等：菠萝 SLF/SFB 基因家族全基因组鉴定与表达分析 1321 30%左右，无规则卷曲占比最大约 50%（表 3）。2.2 菠萝 AcSLFs 基因染色体定位 为明确菠萝 AcSLFs 基因在染色体上的分布，利用菠萝基因组数据库中的基因位置信息，使用Tbtools 软件对基因在染色体上位置进行可视化（图 1）。结果显示，AcSLF21 位于 scaffold_1507，尚未定位到具体染色体位置，其余染色体不均匀地分布在 14 条染色体上，其中 AcSLF3、AcSLF4、AcSLF5、AcSLF6 位于 LG02 号染色体，大部分基因位于染色体两端。同时发现部分 AcSLFs 基因与菠萝 RNase T2 家族基因发生连锁，其中 AcSLF4、AcSLF5、AcSLF6 与 Aco001100 紧密连锁，AcSLF8与 Aco004758 连锁，AcSLF14、AcSLF15 与 Aco00-4148 连锁。表 3 菠萝 AcSLFs 蛋白亚细胞定位及二级结构分析 Tab.3 Subcellular localization and protein secondary structure analysis of AcSLFs in pineapple 基因名称 Gene name 亚细胞定位 Subcellular location-螺旋 Alpha helix/%延伸链 Extended strand/%-转角 Beta turn/%无规则卷曲 Random coil/%AcSLF1 Nucleus 18.50 28.61 3.18 49.71 AcSLF2 Nucleus 26.17 22.60 4.25 46.98 AcSLF3 Nucleus 45.35 12.02 2.33 40.31 AcSLF4 Chloroplast 29.83 16.38 7.07 46.72 AcSLF5 Nucleus 17.35 24.20 6.62 51.83 AcSLF6 Nucleus 17.75 26.63 3.92 51.70 AcSLF7 Chloroplast/Nucleus 16.41 29.74 5.38 48.46 AcSLF8 Nucleus 28.40 18.78 9.62 43.19 AcSLF9 Nucleus 16.86 26.60 4.04 52.49 AcSLF10 Nucleus 25.45 24.32 6.14 44.09 AcSLF11 Nucleus 22.60 24.57 6.14 46.68 AcSLF12 Nucleus 18.93 24.07 4.21 52.80 AcSLF13 Nucleus 22.69 24.77 4.17 48.38 AcSLF14 Nucleus 17.73 23.31 6.37 52.59 AcSLF15 Nucleus 25.63 16.81 6.09 51.47 AcSLF16 Nucleus 20.26 24.78 5.17 49.78 AcSLF17 Chloroplast/Nucleus 29.83 16.38 7.07 46.72 AcSLF18 Nucleus 20.45 25.91 5.45 48.18 AcSLF19 Nucleus 18.82 29.57 5.91 45.70 AcSLF20 Nucleus 28.27 18.14 4.74 48.86 AcSLF21 Nucleus 19.62 27.69 6.18 46.51 图 1 菠萝 AcSLFs 基因染色体定位 Fig.1 Localization of AcSLF genes on pineapple chromosome 1322 热带作物学报 第 44 卷 2.3 菠萝 AcSLFs 进化树构建 为了解菠萝 AcSLFs 蛋白之间进化关系，将21 个 AcSLFs 蛋白序列与苹果、梅、樱桃等蔷薇科植物、金鱼草车前科植物、番茄、矮牵牛等茄科植物的 SLF/SFB 蛋白序列进行多重序列比对，通过 NJ的方法使用 MEGA 6.0软件构建系统进化树，结果如图 2 所示（蓝色表示茄科植物，红色表示金鱼草车前科植物，绿色表示蔷薇科植物，黄色表示菠萝）。通过进化树分支聚类关系可以看出，番茄、多毛番茄和矮牵牛的 SLF、SLFL 聚为一类，苹果、梨、甜樱桃的 SLFL、FBX 和 SFBB聚为一类，甜樱桃、扁桃、梅的 SFB 聚为一类，而菠萝 AcSLFs 与已报道的 SLF/SFB 蛋白均未聚类到一起，说明菠萝 AcSLFs 与蔷薇科、车前科、茄科植物 SLF/SFB 进化关系较远，在进化树分支上聚类程度较低，这也说明了单子叶植物菠萝与双子叶植物亲缘关系较远。2.4 菠萝 AcSLFs 基因结构及蛋白结构域分析 在 21 个 SLF/SFB 家族成员中，11 个 AcSLFs基因均含有内含子，其中 AcSLF3 含有 4 个内含子，其他 10 个基因只包含 12 个内含子（图 3A），不同的 AcSLFs 基因含有内含子数量不同，而内含子与基因分类无显著相关性。对 21 个菠萝 AcSLFs基因进行蛋白结构域分析，结果表明各 AcSLFs基因在 N 端具有 F-box 保守结构域，其中AcSLF17、AcSLF19、AcSLF21、AcSLF3 只含有F-box 结构域，不含其他结构域，AcSLF13、AcSLF16 在 C 端具有 F-box 关联的 FBA 结构，另外 AcSLF20、AcSLF4、AcSLF15、AcSLF5、AcSLF8基因含有 Kelch 结构域（图 3B）。图 2 AcSLFs 系统进化树 Fig.2 Phylogenetic tree of AcSLFs 第 7 期 井敏敏等：菠萝 SLF/SFB 基因家族全基因组鉴定与表达分析 1323 图 3 菠萝 AcSLFs 基因结构及保守结构域分析 Fig.3 Gene structure and protein conserved domain analysis of AcSLF genes in pineapple 2.5 菠萝 AcSLFs 基因组织表达分析 为了研究菠萝 AcSLFs 基因组织表达模式，通过 qRT-PCR 技术对 21 个 AcSLFs 基因在菠萝雄蕊、雌蕊、叶片、果肉、茎和根不同组织的表达量进行分析。结果显示（图 4），不同的 AcSLFs基因在菠萝不同组织中表现出明显的表达差异，其中，AcSLF1、AcSLF4、AcSLF13、AcSLF14、AcSLF15、AcSLF16 和 AcSLF17 在叶片中呈最高表达量，AcSLF3、AcSLF7 在果肉中表达量最高，AcSLF5、AcSLF12、AcSLF18 在根中表达量高于其他组织，AcSLF6在6个组织部位表达量均较低，AcSLF1、AcSLF2、AcSLF4、AcSLF9、AcSLF10、AcSLF11、AcSLF15、AcSLF19、AcSLF20、AcSLF21在雄蕊中呈高表达量。总体来说，大部分菠萝AcSLFs 基因主要在菠萝雄蕊或叶片中表达量高。2.6 菠萝AcSLFs基因授粉前后的表达差异分析 通过对 21 个 AcSLFs 基因在未授粉金菠萝雌蕊、自花授粉 2、6、24 h 以及巴厘菠萝授金菠萝雌蕊 2、6、24 h 的表达分析发现，AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15 三个基因在授粉后表达显著上调，尤其是异花授粉后 6 h，表达量显著高于未授粉雌蕊，在授粉后 24 h 同样具有较高表达量，同时异花授粉表达量高于自花授粉（图 5）。AcSLF5 在自花授粉后表达上调，而异花授粉后几乎无表达，AcSLF10、AcSLF11、AcSLF17、AcSLF19、AcSLF20和 AcSLF21 在异花授粉 6 h 稍上调表达。在配子体自交不亲和植物中，亲和与不亲和花粉均可在柱头上萌发生长，并伸入花柱，S-RNase 主要聚集 在 花 柱 上 端，当 花 粉 管 受 到 雌 蕊 分 泌 的S-RNase 胁迫时，会启动相应保护机制，花粉管编码多个识别非自我 S-RNase 的 SLF 蛋白，SLF蛋白可识别并泛素化非自我 S-RNase，使 S-RNase丧失毒性，从而花粉管可继续生长，而“自身”花粉管在 S-RNase 的毒性下丧失活性停止生长22-23。在菠萝授粉后，AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15 基因异花授粉显著高于自花授粉，这说明“非自我”花粉 SLF 基因的高表达，有助于其更好地发挥解毒作用，暗示这 3 个基因在菠萝自交不亲和中发挥重要作用。3 讨论 本研究通过全基因组检索鉴定了 21 个菠萝AcSLFs，与矮牵牛 1620 个 SLF 基因数目相当24，与柑橘中报道 113 个 SLF/SLFL 基因相差较多25。AcSLFs 在氨基酸长度、理论等电点、分子量有较大差异，且绝大多数 AcSLFs 蛋白为碱性蛋白，总体 AcSLFs 蛋白稳定性较差，