miR-1299通过靶向调控CCND1对非小细胞肺癌细胞增殖、转移和凋亡的影响.pdf

1578:D0I:10.3969/j.issn.1671-4695.2023.15.003miR-1299 通过靶向调控 CCND1对非小细胞肺癌细胞增殖、转移和凋亡的影响于瀚宇聂双双张军李然*（青岛大学附属青岛市中心医院1全科医学科；2 肿瘤内科青岛山东2 6 6 0 42）【摘要】目的探讨miR-1299通过靶向调控细胞周期蛋白D1（CCND 1）对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖、转移和凋亡的影响。方法回顾性收集2 0 2 1年1月至2 0 2 2 年1月入青岛大学附属青岛市中心医院胸外科行原发性NSCLC手术的患者2 9 例,取癌组织和癌旁正常肺组织，培养人正常肺上皮细胞16 HBE和NSCLC细胞系H1299、A 549、PC-9、H 19 7 5、SPC-A 1,RT-q PCR法检测组织和细胞中miR-1299和CCND1的表达,取生长良好的H1299细胞,将其分为对照组（转染miR-control）、m iR-12 9 9 NC 组（转染miR-1299NC）、m iR-12 9 9 m im ic 组（转染miR-1299mim-ic）、m iR-12 9 9 in h ib it o r 组（转染miR-1299 inhibitor）、PC D NA 组（转染pcDNA3.1-NC）、PC D NA-C C ND 1组（转染pcDNA3.1-CCND1真核表达载体）、miR-1299mimic+PCDNA组（共同转染miR-1299mimic和pcDNA3.1-NC）和miR-1299mimic+PCDNA-CCND1组（共同转染miR-1299mimic和pcDNA3.1-CCND1真核表达载体）。检测各组细胞增殖、迁移、凋亡、CCND1蛋白的表达及miR-1299与 CCND1 的靶向关系。结果癌组织中miR-1299的相对表达明显低于癌旁正常肺组织,癌组织中CCND1的相对表达明显高于癌旁正常肺组织,差异均有统计学意义（P0.05）。NSCLC细胞系H1299、A 549、PC-9、H 19 7 5、SPC-A 1中miR-1299的相对表达明显低于人正常肺上皮细胞16 HBE，NSCLC细胞系H1299、A 549、PC-9、H 19 7 5、SPC-A 1中CCND1的相对表达明显高于人正常肺上皮细胞16 HBE,差异均有统计学意义（P0.05）。与对照组相比,miR-1299mimic组H1299细胞增殖和迁移能力明显降低,凋亡能力明显升高，差异均有统计学意义（P0.05）；而miR-1299 inhibitor组H1299细胞增殖和迁移能力明显升高，凋亡能力明显降低,差异均有统计学意义（P0.05）。m iR-12 9 9 m im ic 组的CCND1-WT的荧光素酶活性明显低于miR-1299NC组,与miR-1299 NC组相比,miR-1299 mimic组中 CCND1蛋白表达明显下调,差异均有统计学意义（P0.05）。m iR-1299和CCND1呈负相关（r=-0.535，P=0.0 0 3）。与PCDNA组相比,PCDNA-CCND1组H1299细胞增殖和迁移能力明显升高，凋亡能力显著降低，差异均有统计学意义（P0.05）；与miR-1299mimic+PCDNA组相比,miR-1299mimic+PCDNA-CCND1组H1299细胞增殖和迁移能力明显升高，凋亡能力明显降低，差异均有统计学意义（P0.05）。结论在NSCLC组织和细胞中,miR-1299表达降低,CCND1表达升高,过表达miR-1299可能通过靶向抑制CCND1表达,抑制 NSCLC 细胞的增殖、转移和促进其凋亡。【关键词】非小细胞肺癌miR-1299CCND1增殖转移凋亡Effects of miR-1299 on proliferation,metastasis and apoptosis of non-smallcell lung cancer cells by targeting CCNDI.YU Han-yu,NIE Shuang-shuang,ZHANG Jun,et al.Department of General Practice,Qingdao Central Hospital Afiliated to Qingdao University,QingdaoShandong 266042,China.Abstract Objective To investigate the effects of miR-1299 on proliferation,metastasis and apoptosis of non-small cell lung cancer(NSCLC)cells by targeting cell Cyclin DI(CCND1).Methods A total of 29 patients admitted to the Department of Thoracic Surgery of QingdaoCentral Hospital Affiliated to Qingdao University for primary NSCLC surgery from January 2021 to January 2022 were collected.Cancer tissues andnormal lung tissues adjacent to cancer were collected and cultured into human normal lung epithelial cells 16HBE and NSCLC cell lines H1299,A549,PC-9,H1975,and SPC-A1.The expression of miR-1299 and CCND1 in tissues and cells was detected by RT-qPCR,and well-grown H1299 cells were selected.They were divided into control group(transfected miR-control),miR-1299 NC group(transfected miR-1299 NC),miR-1299 mimic group(transfected miR-1299 mimic),and miR-1299 inhibitor group(transfected miR-1299 inhibitor group)inhibitor),PCDNA group(transfected with pcDNA3.1-NC),PCDNa-CCND1 group(transfected with pcDNA3.1-CCND1 eukaryotic expres-sion vector),miR-1299 mimic+PCDNA group(co-transfected with miR-1299 mimic and pcDNA3.1-NC)and miR-1299 mimic+PCD-NA-CCND1 groups(co-transfected miR-1299 mimic and pcDNA3.1-CCNDI eukaryotic expression vectors).Cell proliferation,migration,apoptosis,the expression of CCNDI protein and the targeting relationship between miR-1299 and CCNDI were detected.Results The relativeexpression of miR-1299 in cancer tissues was significantly lower than that in normal tssues,and the relative expression of CCND1 in cancer tis-sues was significantly higher than that in normal tissues,the differences were statistically significant(P 0.05).The relative expression of miR-1299 in NSCLC cell lines H1299,A549,PC-9,H1975 and SPC-A1 was significantly lower than that of 16HBE in human normal lung epi-thelial cells,the relative expression of CCND1 in NSCLC cell lines H1299,A549,PC-9,H1975 and SPC-A1 was significantly higher than thatin human normal lung epithelial cells,the differences were statistically significant(P 0.05).Compared with the control group,the proliferation基金项目：国家自然科学基金项目辅助支持项目（编号：8 2 0 7 2 9 2 7）*通讯作者：李然,E-mail:Journal of Clinical and Experimental Medicine Vol.22,No.15Aug.2023文章编号：16 7 1-46 9 5(2 0 2 3)15-157 8-0 6临床和实验医学杂志2 0 2 3年8 月第2 2 卷第15期and migration ability of H1299 cells were significantly decreased,and the apoptosis ability was significantly increased,the differences were statisti-cally significant(P 0.05).However,the proliferation and migration capacity of H1299 cells in miR-1299 inhibitor group was significantly in-creased,while the apoptosis capacity was significantly decreased,the differences were statistically significant(P 0.05).The luciferase activityof CCND1-WT of miR-1299 mimic group was significantly lower than that of miR-1299 NC group,the expression of CCND1 protein in miR-1299 mimic group was significantly down-regulated compared with miR-1299 NC group,the dfferences were statistically significant(P 0.05).miR-1299 was negatively correlated with CCND1(r=-0.535,P=0.003).Compared with the PCDNA group,the proliferation and migrationability of H1299 cells in PCDNa-CCND1 group were significantly increased,and the apoptosis rate was significantly decreased,the dfferenceswere statistically significant(P0.05).Compared with the miR-1299 mimic+PCDNA group,the proliferation and migration ability of H1299cells in the miR-1299 mimic+PCDNA-CCNDI group were significantly increased,while the apoptosis ability was significantly decreased,thedifferences were statistically significant(P 0.05).Conclusion In NSCLC tissues and cells,the expression of miR-1299 is decreased,whilethe expression of CCND1 is increased.Overexpression of miR-1299 may inhibit the proliferation,metastasis and apoptosis of NSCLC cells by tar-geting the expression of CCND1.Key words Non-small cell lung cancer;miR-1299;CCND1;Proliferate;Transfer;Apoptosis肺癌发生于支气管和肺泡上皮细胞的恶性肿瘤,已成为当今世界上对职业人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之二1。其中非小细胞肺癌（non s ma l l c e l llungcancer,NSCLC）占8 5%以上，临床症状出现时，超过6 0%的患者已经发展为肺癌的II V 期,5年的生存率更是低于2 0%2 。因此,对 NSCLC 的早期诊断和干预十分重要。基因结构和功能是肺癌分子生物学研究的核心，目前已发现对肺癌发生、发展起作用的分子机制很多,虽然已研究出大量的转化研究成果用于临床，但患者从中获益程度有限，主要与肺癌进展的潜在分子机制尚未完全明确有关,所以识别肺癌相关的主要基因及分子机制，仍然是目前肺癌分子生物学研究的重点。miRNA参与了癌症患者体内的多种生物学行为,包括细胞的增殖、凋亡、转移和疾病的预后等多种过程3。不同的miRNA在恶性肿瘤中扮演着不同的角色,研究表明,miR-1299在食管癌组织中表达下调,而且可能抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力4。也有研究表明,胶质瘤组织中miR12 9 9 表达水平降低,靶向调控miR-1299的表达可以抑制胶质瘤细胞增殖及促进细胞调亡5。但关于miR-1299 表达在NSCLC 尚未发现相关报道。细胞周期蛋白 D1（c e ll C y c lin D 1,C C ND 1）被视为癌基因,在多种癌症中均出现异常表达6 ,与前列腺癌等不良预后具有一定的关系7 ,但关于CCND1在NSCLC中的表达及意义尚未见报道。本研究探讨miR-1299和CCND1在NSCLC组织和细胞中的表达水平和作用,旨在为 NSCLC 在临床中提供可能治疗的靶点。现将结果报道如下。1材料与方法1.1实验材料回顾性收集2 0 2 1年1月至2 0 2 2 年1月人青岛大学附属青岛市中心医院胸外科行原发性NSCLC手术的患者2 9 例,分别取癌组织和周围5cm处正常肺组织,样本离体后30 min采用无菌核酸酶水冲洗,放于液氮快速冷冻,保存在8 0 冰箱中。所有患者在术前均未接受过放疗、化疗及靶向等治疗,均经过病理证实为 NSCLC患者。本研究通过青岛大学附属青:1579岛市中心医院伦理委员会批准。人正常肺上皮细胞16HBE和NSCLC细胞系H1299、A 549、PC-9、H 19 7 5、SPC-A1购买于美国ATCC公司。1.2主要试剂RPMI1640培养基购自北京索莱宝科技有限公司；CCK-8 试剂盒购自日本同仁化学研究所；膜联蛋白V（A n n e x i n V）异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC)/碘化丙啶（propidium iodide,PI）试剂购自江苏凯基生物技术股份有限公司；Trizol试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；Lipofectamine3000（脂质体）购自美国Invitrogen公司；CCND1一抗、羊抗免二抗购自英国Abcam公司;miR-1299mimic和miR-1299inhibitor购自上海吉凯基因化学技术有限公司。1.3方法1.3.1丝细胞培养将人正常肺上皮细胞16 HBE和NSCLC细胞系H1299、A 549、PC -9、H 19 7 5、SPC-A 1使用含有10%胎牛血清、10 0 U/mL青霉素、10 0 mg/L链霉素的DMEM培养基培养,置于37、5%CO2的恒温培养箱中,待生长状态处于对数生长期时，进行后续实验。1.3.2RT-qPCR检测miR-1299 和 CCND1 的表达使用Trizol试剂盒提取癌组织、癌旁正常肺组织及人正常肺上皮细胞16 HBE和NSCLC细胞系H1299、A 549、PC-9、H 19 7 5、SPC A 1的总RNA,按照说明书逐步进行操作,逆转录反应合成cDNA,进行RT-PCR反应，miR-1299上游引物:5AGCGCGCGAGCGAGCTCTA-3，下游引物:5-CTCAGCGCCATGCCTCCA-3;CCND1上游引物:5ACTTCGAGCGGACGTGCTA-3，下游引物:5CTCGCGGCTCGCGCGCAGCGA3。构建总计2 0 L的PCR反应体系：ddH,013.7L,10缓冲液（Mg*）2 L,dNTP1.6L,上下游引物各 0.8 L,Template 1 L,Taq enzyme 0.1 L。PCR反应条件如下：9 5预变性2 min,变性9 530 s、退火30 s、延伸7 2 30 s，共循环40 次，7 2 终延伸10min。采用相对定量2-ACT计算miR-1299和CCND1的表达水平。1.3.3纠细胞转染和分组取生长良好的H1299细胞，1580将其分为对照组（转染miR-control）、m iR-12 9 9 NC 组（转染 miR-1299 NC）、m i R-12 9 9 m i m i c 组（转染 miR-1299 mimic）、m i R-12 9 9 i n h i b i t o r 组（转染miR-1299inhibitor）、PCD NA 组(转染 pcDNA3.1-NC)、PCD NA-CCND1组（转染pcDNA3.1CCND 1真核表达载体）、miR-1299 mimic+PCDNA组（共同转染miR-1299mimic 和 pcDNA3.1-NC)和 miR-1299 mimic+PCD-NA-CCND1 组（共同转染miR-1299 mimic 和 pcD-NA3.1CCND 1真核表达载体），使用Lipofectamine3000（脂质体）按照使用说明书进行转染，转染后48 h，进行下一步实验。1.3.4CCK-8法检测细胞增殖将重悬成单细胞悬液后依照每孔细胞数2 10 接种至9 6 孔板中，每孔加入10 0 L培养基,2 4h后，向各组细胞中加人10 L/孔CCK-8试剂,置于37,5%CO2细胞培养箱中孵育1h,酶标仪检测450 nm的光密度值。1.3.5细胞划痕实验检测细胞迁移将重悬成单细胞悬液后依照每孔细胞数510 5个细胞接种至6 孔板中,置于37,5%COz细胞培养箱中培养,待细胞生长覆盖时,使用10 L的灭菌吸头做细胞划痕,采用PBS取出漂浮细胞，加人5%RPMI1640培养基，记录0 和48h 的细胞划痕愈合情况,拍照留存,并计算细胞迁移率。1.3.6流式细胞检测细胞凋亡将细胞调整细胞密度为510,弃上清，加人50 0 L的缓冲液，制成细胞悬液,并在细胞悬液中加人5LAmexinv-FITC/PI试剂，混匀后，再加人5LPI试剂，避光孵育10 min，上流式细胞仪进行检测。1.3.7双荧光素酶报告基因实验验证miR-1299和CCND1的靶向关系通过TargetScan预测miR12 9 9和CCND1的潜在结合位点，构建CCND1野生型（WT)和CCND1-突变型（MUT）,将H1299细胞接种于9 6 孔板中,每孔接种110 4个细胞,12 h后,将miR-NC、miR-1299 mimics 以及 CCND1-WT、C C ND 1-M U T 转染到H1299细胞中,2 4h后,采用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。1.3.8蛋白质印迹法检测CCND1的表达取H1299细胞,加入RIPA裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂PMSF提取细胞总蛋白，使用二喹啉酸蛋白检测试剂盒定量细胞总蛋白，取2.5L待测蛋白样品，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳,并将分离后蛋白转移至聚偏氟乙烯膜上,用5%脱脂牛奶的封闭液封存1h,，将抗体CCND1（1:50 0 0）用TBST稀释加到膜上，室温下孵育1h,TBST洗膜3次,加人羊抗兔二抗（1:10 0 0）,TBST洗膜，室温下孵育1h，电化学发光显影,采用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度值分析。1.4统计学处理统计学软件利用GraphPadPrism9版本进行统计学处理，计量资料以均数土标准差（xJournal of Clinical and Experimental Medicine Vol.22,No.15 Aug.2023s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验;采用Pearson相关性检验分析miR-1299和CCND1的相关性；P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1mmiR-1299 和 CCND1 在 NSCLC 组织和细胞中的表达癌组织中miR-1299 的相对表达明显低于癌旁正常肺组织,癌组织中 CCND1 的相对表达明显高于癌旁正常肺组织,差异均有统计学意义（P0.05）。见表1。NSCLC细胞系H1299、A 549、PC-9、H 19 7 5、SPC-A 1中miR-1299的相对表达明显低于人正常肺上皮细胞16HBE,NSCLC 细胞系 H1299、A 549、PC-9、H 19 7 5、SPC-A1 中 CCND1的相对表达明显高于人正常肺上皮细胞16 HBE,差异均有统计学意义（P0.05）。见表2。由于miR-1299 的相对表达在 H1299 中表达最低,所以选择H1299作为本次研究对象。表1癌组织和癌旁正常肺组织中miR-1299和CCND1的表达（xs）组织癌组织癌旁正常肺组织值P值细胞系中miR-1299和CCND1的表达（xs）细胞n16HBE7SPC-A17A5497PC-97H19757H12997F值P值注：与人正常肺上皮细胞16 HBE相比较，P0.05。2.2miR-1299对细胞增殖和转移的影响与对照组相比,miR-1299mimic组在2 4 7 2 h的H1299细胞增殖能力明显降低,而miR-1299 inhibitor组在2 4-7 2 h的H1299细胞增殖能力明显升高,差异均有统计学意义（P 0.0 0 1）。见表3。对照组、miR-1299mimic组、miR-1299 inhibitor组中H1299细胞迁移率为（9 8.37 11.24)%、(49.8 9 8.57)%和(16 2.43 2 2.7 3)%。与对照组相比,miR-1299 mimic 组中的H1299 细胞迁移能力明显降低，miR-1299 inhibitor组的H1299细胞迁移能力明显升高,差异均有统计学意义（P0.05）。见图1。表3各组2 4、48、7 2 h的细胞增殖情况比较（s）组别n对照组70.47 0.03miR-1299 mimic 组70.26 0.04miR-1299 inhibitor 组70.62 0.07F值F 组间=9.8 6 4;F 组内=13.57 5;F 交互=15.438P值P 组间 0.0 0 1;P 组内 0.0 0 1;P 交互 0.0 0 1n2929表2 人正常肺上皮细胞和NSCLCmiR-12991.03 0.080.58 0.11a0.46 0.03 a0.42 0.07a0.37 0.05 a0.21 0.03 ab15.7290.00124 hmiR-12990.37 0.111.01 0.168.1730.0010.69 0.090.42 0.070.83 0.19CCND12.14 0.531.02 0.1411.3640.001CCND11.01 0.091.69 0.35a1.82 0.43 41.97 0.53a2.03 0.51a2.36 0.67 ab16.8470.00148 h72 h0.81 0.230.63 0.11 1.17 0.29临床和实验医学杂志2023年8 月第2 2 卷第15期与miR-1299 NC 组相比,miR-1299 mimic 组中 CC-ND1蛋白表达明显下调（P0.001）,见图3B。Pe a r s o nOh相关分析结果显示，miR12 9 9 和CCND1呈负相关（r=-0.535,P=0.003),见图3C。A48hPosition2853-2859ofCCND13UTR5.ACCGCCCACCC-UCCAGAC.hsa-miR-1299B对照组miR-1299mimic组图1各组0 和48 h的H1299细胞迁移情况2.3miR-1299 对细胞凋亡的影响1299mimic组、miR-1299 inhibitor组的H1299细胞调亡率分别为（13.12 2.9 8)%、（39.6 38.14)%和(6.271.49）%。与对照组相比，miR-1299mimic组中的H1299细胞凋亡能力明显升高,miR-1299 inhibi-tor组的H1299细胞凋亡能力明显降低,差异均有统计学意义（t=8.091、5.440,P 0.0 5）。见图2。10101022.4miR-1299和 CCND1靶向关系预测miR-1299和CCND1之间的结合位点，见图3A。采用双荧光素酶报告基因检测确认CCND1 能否直接与miR-1299结合,结果显示，miR-1299mimic组的CC-ND1-WT 的荧光素酶活性明显低于miR-1299NC 组，差异有统计学意义（P0.05）。见表4。组别24 h对照组7miR-1299 mimic 组7miR-1299 mimic+PCDNA组7miR-1299 mimic+PCDNA-CCND1 组7F值P值对照组、miR-1299 mimic 组、miR-1299 mimic+PCDNA组、miR-1299 mimic+PCDNA-CCND1 组中H1299细胞迁移率分别为（9 8.37 11.2 4）%、（49.8 9 8.57)%、(51.36 9.34)%和(8 4.9 6 12.7 2)%。与对照组相比,miR-1299mimic组中的H1299细胞迁移能力明显降低,差异有统计学意义（t=9.075，P0.001);与miR-1299 mimic+PCDNA组比,miR-1299mimic+PCDNA-CCND1组的H1299细胞迁移能力明显增加,差异有统计学意义（t=5.633，P0.001)。见图4。1581Predicted consequential pairing of target region(top)andsitemiRNA(bottom)type7mer-IA13AGGAGUGUGUCUUAAGGUCUUCmiR-1299inhibitor组2.5CCNDI2.0-1对照组、miR-GAPDH注：A：m i R-12 9 9 和CCND1结合位点;B：蛋白质印迹法检测CCND1的表达;C:miR-1299和CCND1相关性表4miR-1299和CCND1靶向关系组别CCND1-WTQ11051010Q31021310105Annexin-V.FITC对照组图2 各组H1299细胞凋亡情况n1.0-0.5-miR-1299NC组miR-1299mimic组图3miR-1299和CCND1靶向关系nmiR-1299 NC 组7miR-1299 mimic 组7t值93P值1021010105Annexin-VFITCmiR-1299mimic组0.0+0.00.20.40.6miR-1299CCND1-MUT1.03 0.091.02 0.070.36 0.040.99 0.0810.3460.0270.0010.983。1o 2103Annexin-VFITCmiR-1299inhibitor组使用 TargetScan表5各组2 4、48、7 2 h的细胞增殖情况比较0.47 0.030.26 0.040.28 0.060.32 0.020.81o*1051.072.5miR-1299靶向CCND1对细胞增殖和转移的影响与对照组相比，miR-1299mimic 组、miR12 9 9mimic+PCDNA 组、miR-1299 mimic+PCDNA-CC-ND1组在2 4、48、7 2 h的H1299细胞增殖能力明显降低,差异均有统计学意义（P0.001）；与miR-1299mimic+PCDNA组相比,miR-1299 mimic+PCDNA-CCND1组在2 4、48、7 2 h的H1299细胞增殖能力明显升高,差异均有统计学意义（P0.05）。见表5。交(xs)48 h0.69 0.090.42 0.070.43 0.080.58 0.12F组间=5.2 7 4F组内=8.316;F交互=10.52 9P 组间=0.0 11;P 组内 0.0 0 1;P 交T0.001Oh48h72h0.81 0.230.63 0.110.61 0.140.76 0.19对照组miR-1299 mimic组 miR-1299 mimic+PCDNA组miR-1299mimic+PCDNA-CCND1组图4各组0 h和48 h的H1299细胞迁移情况15822.6miR-1299靶向CCND1对细胞凋亡的影响对照组、miR-1299 mimic 组、miR-1299 mimic+PCDNA组、miR-1299 mimic+PCDNA-CCND1 组的 H1299 细胞调亡率分别为（13.12 2.9 8）%、（39.6 38.14）%、（39.8 58.2 1)%和（19.8 33.9 4）%。与对照组相比,miR-1299 mimic 组、miR-1299 mimic+PCDNA组、miR-1299 mimic+PCDNA-CCND1组的H1299细胞凋亡能力明显升高,差异均有统计学意义（t=8.091、8.097、3.59 4,P 0.0 5);与 miR-1299 mimic+PCDNA组相比,miR 12 9 9 m im ic +PC D NA -C C ND 1 组的H1299细胞凋亡能力明显降低,差异有统计学意义（t=5.817,P0.05)。见图5。010102101010exin-vFITC对照组3讨论NSCLC 是一种高患病率和高病死率的疾病,诊断明确时大部分患者已处于晚期。尽管手术治疗在NSCLC中起了至关重要的作用，但是经过手术治疗后，不同阶段的NSCLC患者5年的总生存率不同，I期NSCLC患者的生存率能达到6 0%，I 期NSCLC患者的生存率能达到30%,术后2 年内的复发风险较高12 ,所以,驱需探究及筛选出关键的NSCLC早期诊断的生物标志物,对于 NSCLC 诊断、治疗及预后具有非常重要的作用。研究证明,miRNA能够调控诸多转录后调控因子，与很多疾病的发生和发展息息相关13。近年来，高通量测序和基因芯片的应用,发现了miRNA在癌症中的表达谱数据不断增加,从而揭示了肿瘤发生和发展是一个复杂的miRNA调控网络4。miRNA能够结合mR-NA非编码区上的互补序列来干扰靶基因的表达,从而影响了下游蛋白功能和蛋白的表达15。众所周知，miRNAs 能作为诊断和预后的候选分子标记,是恶性肿瘤转化和转移的重要调节因素。在表观遗传学中,miR-NAs扮演着两种身份,既是抑癌基因，也是促癌基因16 。相关研究表明,NSCLC 癌组织中miR-214表达降低,可能与NSCLC的发生、发展有关,有希望成为预测 NSCLC 发生、发展的肿瘤标志物17 。晚期NSCLC 中miR-151a-5p高表达与病理特征恶化、化疗效果不佳有关,靶向上皮间质转化基因可能是其分子机制18 。miR-146-5p通过调节靶蛋白Notch2表达水平，调节着非小细胞肺癌的增殖、凋亡和侵袭能力19 。本研究在NSCLC患者癌组织和细胞系H1299中发现,miR-1299的相对表达明显降低，过表达miR-1299能够抑制H1299细胞的增殖、迁移,促进其凋亡,而抑制miR-Journal of Clinical and Experimental Medicine Vol.22,No.15Aug.20231010105bEtin-VFITCmiR-1299mimic组图5各组H1299细胞凋亡情况1299的表达则反之。相关研究表明，上调miR12 9 9抑制Wnt/-catenin信号通路抑制口腔鳞癌细胞增殖，促进细胞凋亡2 0 ,本研究结果与之类似。CCND1 基因表达与星形细胞瘤的增殖活性和侵袭力以及病理级别密切相关,是决定预后的一个指标。相关研究表明,抑制CCND1基因表达，可以降低乳腺癌细胞侵袭转移2 1,靶向CCND1 抑制肾透明细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移2 2 。本研究在 NSCLC 患者癌组织和细胞系H1299中发现,CCND1的相对表达明显升高，过表达CCND1能够促进H1299细胞的增殖、迁移,抑制其凋亡。通过 TargetScanHuman 7.2网站预测,CCND1可能是miR-1299的靶基因,之间存在结合位点。双荧光素酶报告基因检测确认CCND1能否直接与miR-1299结合,而且过表达miR-1299能够抑制CCND1蛋白表达。通过Pearson相关分析结果显示，miR12 9 9和CCND1呈负相关。最后本研究为了验证miR-1299nnexis-VFITCAmexin-YFITCmiR-1299mimie+PCDNA组miR-1299mimic+PCDNA-CCND1组靶向 CCND1 对细胞增殖、转移和凋亡的影响,进一步将miR-1299 mimic 和 pcDNA3.1-NC 及 miR-1299mimic 和pcDNA3.1-CCND1共同转染到NSCLC 细胞系H1299中,结果发现,共同转染miR-1299mimic和pcDNA3.1-CCND1的H1299细胞增殖能力和迁移能力明显提高,调亡能力明显降低，一方面说明CCND1可以逆转miR-1299的表达,另一方面也可以说明,过表达miR-1299可以抑制CCND1 的表达。4结论综上所述,在NSCLC组织和细胞中,miR-1299表达降低,CCND1表达升高,过表达miR-1299可能通过靶向抑制 CCND1表达,抑制NSCLC细胞的增殖、转移和促进其调亡,miR12 9 9 可能成为NSCLC潜在的预后指标和治疗靶点。本研究在实验过程中存在一定的不足，仅以H1299细胞作为研究对象，而H1299细胞只能代表 NSCLC 的一个种系,并不能代表整体,后续还需要补充其他细胞株的相应实验进行对照分析。参考文献【1国家卫生健康委办公厅，赫捷