生物样品超薄切片技术公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件.pptx

生物样品生物样品常规制样技术常规制样技术超薄切片技术超薄切片技术负染色技术负染色技术扫描样品制作技术扫描样品制作技术透射电镜透射电镜特殊制样技术特殊制样技术冷冻蚀刻技术冷冻蚀刻技术电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术免疫电镜技术免疫电镜技术 X射线微区别析技术射线微区别析技术第1页第1页第四章第四章 透射电镜生物样品透射电镜生物样品 制备技术制备技术第一节第一节 载网和支持膜载网和支持膜第二节第二节 超薄切片制作超薄切片制作第三节第三节 负染色技术负染色技术第2页第2页第一节 载网和支持膜一、载网：用于承载样品一、载网：用于承载样品(直径为直径为3mm)网状材料。网状材料。1.载网类型及选择：载网类型及选择：非金属网非金属网：载网载网金属网金属网铜网铜网：惰性网：惰性网：70透过率2.载网清洗：酸碱法或有机溶剂、蒸馏水等洗净干燥。载网清洗：酸碱法或有机溶剂、蒸馏水等洗净干燥。X射线元素分析射线元素分析常规超薄切片常规超薄切片(200目以上目以上)细胞化学细胞化学第3页第3页二、样品支持膜二、样品支持膜为了增强样品强度，在载网表面先覆一层薄膜。为了增强样品强度，在载网表面先覆一层薄膜。1.对膜要求：对膜要求：v本身没有结构，薄而透明，电子束易通过；本身没有结构，薄而透明，电子束易通过；v有足够机械强度，经得住电子束轰击；有足够机械强度，经得住电子束轰击；v不与样品发生化学反应。不与样品发生化学反应。v厚度在厚度在1015nm2.惯用支持膜及其制备惯用支持膜及其制备福尔莫瓦膜（福尔莫瓦膜（Formvar):化学名称：聚乙烯醇缩甲醛化学名称：聚乙烯醇缩甲醛.特点：机械强度高，制作简便特点：机械强度高，制作简便.制作：制作：0.20.5氯仿溶液，玻璃片汆出氯仿溶液，玻璃片汆出,水面剥离法。水面剥离法。火棉胶膜：火棉胶膜：12%醋酸戊脂溶液，平皿沉淀法醋酸戊脂溶液，平皿沉淀法。碳膜：稳定性好，高分辨制样。碳膜：稳定性好，高分辨制样。第4页第4页操作办法0.20.5%氯仿溶液氯仿溶液蒸馏蒸馏水水膜膜1.福尔莫瓦福尔莫瓦支持膜制作办法支持膜制作办法2.火棉胶膜用平皿水面展开法：火棉胶膜用平皿水面展开法：平皿中盛有双蒸馏水，滴两滴平皿中盛有双蒸馏水，滴两滴13%火棉胶膜液，火棉胶膜液，待半晌溶剂挥发后，在膜上摆放洁净铜网，滤纸捞起。待半晌溶剂挥发后，在膜上摆放洁净铜网，滤纸捞起。3.碳膜制作：用真空喷镀法制膜。碳膜制作：用真空喷镀法制膜。第5页第5页第二节 超薄切片制作超薄切片超薄切片：是指厚度小于是指厚度小于100(5070)纳纳米米切片。切片。要求要求：厚薄均匀、厚度符合原则；：厚薄均匀、厚度符合原则；无皱褶刀痕、震颤和沉淀；无皱褶刀痕、震颤和沉淀；细胞结构保留良好，含有良好电子反差；细胞结构保留良好，含有良好电子反差；含有一定程度机械强度。含有一定程度机械强度。制作流程制作流程：包括六大步，：包括六大步，40多次操作多次操作取材取材固定固定脱水脱水包埋包埋切片切片染色染色 镜检镜检第6页第6页超薄切片制作流程图超薄切片制作流程图04室温室温2323760染色染色观测聚合聚合修块修块切片切片捞片捞片取材取材固定固定漂洗漂洗50%70%80%包埋包埋90%95%100%过渡过渡浸透浸透第7页第7页一、取材一、取材 从动、植物机体上或细胞及微生物培养物中从动、植物机体上或细胞及微生物培养物中获取所需要研究材料操作过程。获取所需要研究材料操作过程。1.取材原则要求：取材原则要求：准、快、小、冷、轻准、快、小、冷、轻五字原则。五字原则。准确：根据研究目的拟定取材部位，取到典型部位。快速：材料离体后应在1分钟内投入固定液。体积小：固定液渗入力所限，样品体积为1mm 或13mm长条。低温：固定液及器材需预冷(04)，以减少自溶酶活性。防损伤：器械要锋利，切割轻巧，防挤压、牵拉损伤 组织细胞内部结构。取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检第8页第8页2.取材办法取材办法：动物材料获取动物材料获取：急性处死或麻醉后，在急性处死或麻醉后，在12分钟解剖出所需材料，切成分钟解剖出所需材料，切成原则块马上投入固定液，低温原则块马上投入固定液，低温(04)保留；特殊难保留；特殊难取材料必须原位固定或灌流固定，再取材投入固定液。取材料必须原位固定或灌流固定，再取材投入固定液。植物材料获取植物材料获取：注意部位和方向性。注意部位和方向性。叶片叶片切取切取13长条；长条；根、茎根、茎切取原则块；切取原则块；表面有毛刺表面有毛刺材料先用酶处理使之软化，材料先用酶处理使之软化，表面有蜡质表面有蜡质叶片先脱蜡，叶片先脱蜡，蒸馏水洗净后再取材固定。蒸馏水洗净后再取材固定。悬浮样品获取悬浮样品获取：加入适量固定液加入适量固定液悬浮固定悬浮固定后，低速离心搜集成团块再固定后，低速离心搜集成团块再固定。需抽气使样品沉底需抽气使样品沉底保低温保低温 野外取材：野外取材：携带冰壶保留固定液和材料，确保携带冰壶保留固定液和材料，确保动物材料现场固定动物材料现场固定；植物材料植物材料可可保湿保湿带回试验室再取材固定。带回试验室再取材固定。取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检第9页第9页二、固定二、固定用化学或物理办法快速杀死细胞过程用化学或物理办法快速杀死细胞过程1.固定目的：固定目的：在分子水平上真实地保留组织细胞生活状态细节，尽也许降低细胞死后改变。2.固定类型：固定类型：固定固定物理固定法物理固定法：化学固定法化学固定法：3.固定液作用：固定液作用：快速均匀渗入到细胞内部，稳定各种细胞成份；快速均匀渗入到细胞内部，稳定各种细胞成份；破坏细胞酶系统，制止细胞自溶；破坏细胞酶系统，制止细胞自溶；通过化学作用建立分子交联，形成细胞骨架；通过化学作用建立分子交联，形成细胞骨架；提供一定电子反差。提供一定电子反差。超低温快速冷冻固定法超低温快速冷冻固定法使用化学试剂快速杀死细胞使用化学试剂快速杀死细胞取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检第10页第10页12.0%4.惯用固定剂及其特点惯用固定剂及其特点u 醛类醛类：甲醛、甲醛、戊二醛戊二醛、多聚甲醛和丙烯醛、多聚甲醛和丙烯醛戊二醛戊二醛：穿透力强，能较好固定蛋白质和糖元、保留核穿透力强，能较好固定蛋白质和糖元、保留核酸、核蛋白，对微管、内质网等细胞膜系统保酸、核蛋白，对微管、内质网等细胞膜系统保存较好；不能保留脂类物质，无电子染色作用。存较好；不能保留脂类物质，无电子染色作用。配制办法：惯用配制办法：惯用0.1M磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(pH6.87.2)配成配成2.05.0。选取选取：单细胞单细胞 微生物微生物 动物组织动物组织 植物组织植物组织 厚壁组织厚壁组织浓度高高5.0%u 锇酸锇酸(OsO4)是唯一能保留脂肪固定剂，含有电子染是唯一能保留脂肪固定剂，含有电子染色作用。能固定脂蛋白、核蛋白，不能保色作用。能固定脂蛋白、核蛋白，不能保存核酸和糖类。存核酸和糖类。取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检第11页第11页5.固定办法：固定办法：(1)单固定法：单固定法：用于易于渗入材料和酶细胞化学用于易于渗入材料和酶细胞化学(2)双固定法：双固定法：戊二醛戊二醛锇酸双重固定锇酸双重固定(3)原位固定法原位固定法：用于难解剖、对缺氧敏感组织器官，用于难解剖、对缺氧敏感组织器官，在保持血液供应状态，边解剖边滴加固定液，在保持血液供应状态，边解剖边滴加固定液，待组织适度硬化后再取材作常规固定。待组织适度硬化后再取材作常规固定。(4)灌流固定灌流固定：惯用惯用醛类醛类固定：用于脑组织、植物叶片气孔状态等固定：用于脑组织、植物叶片气孔状态等通过血液循环路径，将固定液灌注到相应部位，通过血液循环路径，将固定液灌注到相应部位，待组织适度硬化后再解剖取材，作常规固定待组织适度硬化后再解剖取材，作常规固定。用于解剖关系复杂组织（神经组织、脑垂体）用于解剖关系复杂组织（神经组织、脑垂体）戊二醛戊二醛取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检第12页第12页直接影响被固定细胞原有特定形态直接影响被固定细胞原有特定形态6.影响固定效果原因影响固定效果原因(1)固定液酸碱度固定液酸碱度：固定液酸碱度必须与被固定材料酸碱度基本一致固定液酸碱度必须与被固定材料酸碱度基本一致。比如比如多数动物多数动物pH值平均为值平均为7.4，因此惯用，因此惯用PH7.27.4；植物体植物体pH值为值为6.87.1，因此惯用，因此惯用PH7.07.2；原生动物及胚胎适于原生动物及胚胎适于pH为为8.08.5，胃黏膜，胃黏膜pH为为8.5 效果最佳；效果最佳；(2)固定液渗入压固定液渗入压：固定液与被固定组织之间必须固定液与被固定组织之间必须保持渗入平衡保持渗入平衡。电解质：钾钠钙电解质：钾钠钙(0.5%CaCl)可预防膨胀可预防膨胀非电解质：蔗糖、葡萄糖膜系统稳定剂非电解质：蔗糖、葡萄糖膜系统稳定剂取材固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检第13页第13页（3）缓冲液类型）缓冲液类型磷酸盐缓冲液：磷酸盐缓冲液：仿效细胞外液成份配制，无毒且富有生仿效细胞外液成份配制，无毒且富有生理功效。适于配各种固定液和材料漂洗液。理功效。适于配各种固定液和材料漂洗液。二钾胂酸盐二钾胂酸盐 缓冲液缓冲液有毒，稳定性好。适合用于细胞化学和有毒，稳定性好。适合用于细胞化学和保留脂肪样品处理、钙离子定位研究保留脂肪样品处理、钙离子定位研究不宜长期保不宜长期保留留可长期保留可长期保留取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检第14页第14页(4)固定期间、温度及样品块大小固定期间、温度及样品块大小时间时间：因材料而异，单细胞和动物材料较短，植物材料因材料而异，单细胞和动物材料较短，植物材料 及厚壁组织较长。及厚壁组织较长。112小时小时。温度：温度：低温以克制酶活性，通常在低温以克制酶活性，通常在04条件固定条件固定。样品块大小：样品块大小：受固定液渗入能力影响，小块材料易得到受固定液渗入能力影响，小块材料易得到良好固定良好固定。取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检第15页第15页7.注意事项注意事项（1）控制固定温度）控制固定温度04利于利于克制酶活性克制酶活性，减少细胞，减少细胞 自溶。自溶。（2）掌握固定期间：依据材料类型和特点而定，后固定）掌握固定期间：依据材料类型和特点而定，后固定 时间不宜太长，不然易造成碎片时间不宜太长，不然易造成碎片。（3）充足漂洗：除去残留固定液）充足漂洗：除去残留固定液。（4）特殊材料特殊处理：）特殊材料特殊处理：植物及较疏松材料：抽气使其沉入固定液中；植物及较疏松材料：抽气使其沉入固定液中；厚壁组织：采用低压容器或振荡方式增进渗入；厚壁组织：采用低压容器或振荡方式增进渗入；表面有蜡质材料：应当先脱蜡后固定。表面有蜡质材料：应当先脱蜡后固定。取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检第16页第16页三、脱水三、脱水脱水指用适当有机溶剂，取代组织细胞中脱水指用适当有机溶剂，取代组织细胞中游离水过程。游离水过程。1.必要性必要性：水分存在会影响非水溶性包埋剂水分存在会影响非水溶性包埋剂渗入，进而影响切片完整性渗入，进而影响切片完整性2.惯用脱水剂惯用脱水剂：醇类醇类(乙醇乙醇)和丙和丙酮酮3.脱水办法：梯度系列脱水法。脱水办法：梯度系列脱水法。30%50%70%80%90%95%100%2次次4.注意事项：注意事项：脱水中断只能在脱水中断只能在70%，高浓度脱水剂易使组织变脆，成份抽提；，高浓度脱水剂易使组织变脆，成份抽提；末级脱水剂应先用吸水剂处理，以确保脱水彻底；末级脱水剂应先用吸水剂处理，以确保脱水彻底；高浓度脱水操作要快，以防样品内进入空气或吸水受潮。高浓度脱水操作要快，以防样品内进入空气或吸水受潮。取材取材 固定固定 脱水脱水 包埋包埋 切片切片 染色染色 镜检镜检第17页第17页四、浸透与包埋：四、浸透与包埋：用包埋剂逐步取代样品中脱水剂，使细胞内外用包埋剂逐步取代样品中脱水剂，使细胞内外所有孔隙都被包埋剂填充，聚合后形成适合机械切所有孔隙都被包埋剂填充，聚合后形成适合机械切割固体包埋块。割固体包埋块。1.包埋剂：包埋剂：抱负包埋剂特点抱负包埋剂特点：粘稠度低，容易渗入；聚合均匀，粘稠度低，容易渗入；聚合均匀，不产生体积收缩；耐电子束轰击，高温不变形，不升华；不产生体积收缩；耐电子束轰击，高温不变形，不升华；本身无结构，并含有良好切割性能，切片易染色本身无结构，并含有良好切割性能，切片易染色。惯用包埋剂：惯用包埋剂：非水溶性非水溶性(Epon812)和水溶性包埋剂。和水溶性包埋剂。包埋剂包埋剂 Epon812或或618固化剂固化剂 DDSA（十二烷基琥珀酸酐）（十二烷基琥珀酸酐）MNA（六甲酸酐）（六甲酸酐）增塑剂增塑剂 DBP（邻苯二甲酸二丁脂）（邻苯二甲酸二丁脂）催化剂催化剂 DMP-30调整塑性而调整塑性而改变切割性能改变切割性能用于用于618边脱水边包埋边脱水边包埋取材取材 固定固定 脱水脱水 包埋包埋 切片切片 染色染色 镜检镜检第18页第18页2.浸透浸透四四.浸透与包埋浸透与包埋脱水后经环氧丙烷过渡脱水后经环氧丙烷过渡,再逐步浸入包埋剂。再逐步浸入包埋剂。包埋剂包埋剂:过渡剂百分比为过渡剂百分比为 1:31:13:1纯包纯包埋剂埋剂浸透时间：因材料而异浸透时间：因材料而异 1:3 1:1 3:1单细胞单细胞 0.5 0.51 0.5动物材料动物材料 1 14 12植物材料植物材料 1 112 212百分百分比比时间时间材料材料3.包埋包埋常规包埋常规包埋：用牙签把材料挑入模具，注入包埋剂，做好标识用牙签把材料挑入模具，注入包埋剂，做好标识；定向包埋定向包埋：样品挑入浅槽，摆好方向、注剂、装标签；样品挑入浅槽，摆好方向、注剂、装标签；注意事项注意事项：样品块附近不能存在气泡。样品块附近不能存在气泡。4.聚合聚合循序渐进提升温度，增进聚合循序渐进提升温度，增进聚合37(12h)45(12h)60(24h)取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检第19页第19页五、超薄切片五、超薄切片制刀制刀修块修块切片切片展片展片捞片捞片1.切片刀：切片刀：钻石刀、玻璃刀钻石刀、玻璃刀12mm25/38mm46.5mm制作玻璃刀：制作玻璃刀：2.修块修块：除去样品周围包埋介质和不感兴趣部位，保留有用信息便于切割，提供尽也许大有效观测面。要点：上、下边必须平行要点：上、下边必须平行形状：顶端面为梯形锥体（金字塔形）形状：顶端面为梯形锥体（金字塔形）取材取材 固定固定 脱水脱水 包埋包埋 切片切片 染色染色 镜检镜检第20页第20页3.切片切片=厚度厚度热膨胀推动式切片机示意图热膨胀推动式切片机示意图装刀、加水：尤其注意刀高和倾角，液面高度；装刀、加水：尤其注意刀高和倾角，液面高度；切片、捞片：切片带用睫毛笔搜集，铜网沾取；切片、捞片：切片带用睫毛笔搜集，铜网沾取；切片厚度判断：切片表面反射光和切片下表面反射光 产生干涉颜色为依据，不同厚度切片展现不同颜色。干涉颜色干涉颜色 暗灰色暗灰色 灰色灰色 银白色银白色 金黄色金黄色 紫色紫色切片厚度切片厚度 40nm下列下列 4050nm 5070nm 7090nm 90nm以上以上取材取材 固定固定 脱水脱水 包埋包埋 切片切片 染色染色 镜检镜检第21页第21页六、染色六、染色1.染色原理：使用重金属盐类与样品中一些成份结合或染色原理：使用重金属盐类与样品中一些成份结合或 被吸附，以增长电子散射量从而达到提升反差目的被吸附，以增长电子散射量从而达到提升反差目的。电子染电子染色色2.电子染色剂电子染色剂：含有特异性含有特异性 惯用染色剂为铀和铅盐惯用染色剂为铀和铅盐醋酸铀醋酸铀：能提升核酸、蛋白质和结缔组织反差，：能提升核酸、蛋白质和结缔组织反差，对膜系统染色较差。对膜系统染色较差。配制：配制：13%50%或或70%乙醇溶液，避光保留。乙醇溶液，避光保留。铅盐铅盐：对膜系统、糖元、核蛋白、脂类有较好染色作用。惯用对膜系统、糖元、核蛋白、脂类有较好染色作用。惯用 硝酸铅和柠檬酸钠水溶液配成柠檬酸铅。易产生沉淀污染样品。硝酸铅和柠檬酸钠水溶液配成柠檬酸铅。易产生沉淀污染样品。配制配制：硝酸铅硝酸铅 1.33g 柠檬酸钠柠檬酸钠 1.76g 双蒸馏水双蒸馏水 30mlpH 1112pH4.2用力振荡用力振荡30min，呈乳状悬，呈乳状悬液，加入液，加入8ml 1NNaOH，溶，溶液透明后加水至液透明后加水至50ml取材取材 固定固定 脱水脱水 包埋包埋 切片切片 染色染色 镜检镜检第22页第22页3.染色办法染色办法(1)单染色：只用一个染色液（铀）染色办法。单染色：只用一个染色液（铀）染色办法。(2)双染色：双染色：铀铀铅铅染色法染色法(3)块染色块染色：铅铅铀铀铅铅染色可提升反差染色可提升反差石蜡层石蜡层铀染铀染2030分分钟钟铅染色铅染色1530分钟分钟水洗水洗303次次材料固定后、脱水前，整块用材料固定后、脱水前，整块用50%乙醇乙醇醋酸铀醋酸铀饱和溶液，饱和溶液，4染色染色212小时，常规切片镜检。小时，常规切片镜检。取材取材 固定固定 脱水脱水 包埋包埋 切片切片 染色染色 镜检镜检第23页第23页4.示踪性染色示踪性染色多用于免疫电镜技术和多用于免疫电镜技术和(酶酶)细胞化学技术细胞化学技术取材取材 固定固定 脱水脱水 包埋包埋 切片切片 染色染色 镜检镜检(1)概念：用各种大小离子、分子等颗粒作为示踪物，概念：用各种大小离子、分子等颗粒作为示踪物，显示细胞间连接部位与方式，研究细胞通透屏障，测量通显示细胞间连接部位与方式，研究细胞通透屏障，测量通透孔道大小，追踪组织液生理通路。透孔道大小，追踪组织液生理通路。（2）惯用示踪剂：硝酸镧（）惯用示踪剂：硝酸镧（2nm），辽红（），辽红（0.76nm），），无机胶体金，草酸钙以及酶类，铁蛋白等。无机胶体金，草酸钙以及酶类，铁蛋白等。(3)染色办法：染色办法：通常将示踪剂加入进所有处理液中。通常将示踪剂加入进所有处理液中。1%2%硝酸镧或硝酸镧或0.05%0.8%辽红辽红与戊二醛固定与戊二醛固定含相同浓度含相同浓度示踪剂示踪剂1%锇酸锇酸含示踪剂含示踪剂缓冲液漂洗缓冲液漂洗常规脱水常规脱水包埋聚合包埋聚合超薄切片超薄切片直接镜检直接镜检第24页第24页硝酸镧标识葱根尖细胞硝酸镧标识葱根尖细胞镧颗粒沉积在细胞间隙镧颗粒沉积在细胞间隙第25页第25页免疫电镜技术免疫电镜技术：将免疫学中抗原将免疫学中抗原-抗体反应特异性与组织化学形态可见性，抗体反应特异性与组织化学形态可见性，利用电镜高分辨率和放大能力，在超微结构和分子水平上利用电镜高分辨率和放大能力，在超微结构和分子水平上研究细胞形态和功效。研究细胞形态和功效。能够进行细胞内抗体能够进行细胞内抗体-抗原定性、定位研究。抗原定性、定位研究。如：免疫铁蛋白、酶（辣根过氧化酶）、胶体金如：免疫铁蛋白、酶（辣根过氧化酶）、胶体金 对铁蛋白抗体、酶标识抗体、胶体金标识抗体定位对铁蛋白抗体、酶标识抗体、胶体金标识抗体定位电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术：尽也许保留细胞超微结构同时，在原位将生物化学反应在电镜下显示出来，从而将结构与功效研究结合起来。如：酶在细胞内定位如：酶在细胞内定位 核酸（核酸（DNA、RNA）脂肪、碳水化合物定位）脂肪、碳水化合物定位 各种无机离子（钙离子）定位等各种无机离子（钙离子）定位等第26页第26页胶体金标识叶绿体胶体金标识叶绿体第27页第27页第28页第28页超薄切片制作小结超薄切片制作小结一、制作环节应掌握一、制作环节应掌握“六要一防六要一防”取材要准确取材要准确 固定要及时固定要及时 漂洗要充足漂洗要充足 脱水要彻底脱水要彻底浸透要完全浸透要完全 切片要均匀切片要均匀 染色防污染染色防污染二、不同材料制作特点：动物组织：取材快速，固定及时；动物组织：取材快速，固定及时；植物材料：调整处理时间，确保渗入彻底；植物材料：调整处理时间，确保渗入彻底；游离细胞：注意搜集，以防样品丢失；游离细胞：注意搜集，以防样品丢失；孢粉、花粉以及藻类：预包埋搜集，完全浸透。孢粉、花粉以及藻类：预包埋搜集，完全浸透。第29页第29页三三.处理时间处理时间脱水脱水过渡过渡浸透浸透聚合聚合包埋包埋切片切片染色染色取材取材前固定前固定漂洗漂洗后固定后固定漂洗漂洗 准确准确防损伤防损伤24h3次次/15min12h8 级级/15min34h2次次/15min3级级/48h铀染：铀染：1530min铅染：铅染：1015min500700微黄色微黄色黑色或黑色或深褐色深褐色预防污染预防污染04室温室温第30页第30页第三节第三节 负染色技术负染色技术一负染色及其原理：一负染色及其原理：1.负染色：即阴性染色负染色：即阴性染色利用高电子密度、并且在电镜下不显示结构重金属利用高电子密度、并且在电镜下不显示结构重金属盐类在样品四周堆积而盐类在样品四周堆积而增强样品外围电子密度增强样品外围电子密度，从而，从而烘托烘托出样品形态和大小出样品形态和大小。载网和膜载网和膜样品样品染色液染色液2.原理：电子束通过原子序数高物质时，与其电子和原原理：电子束通过原子序数高物质时，与其电子和原 子核碰撞几率较高，容易发生散射而形成负反差。子核碰撞几率较高，容易发生散射而形成负反差。任何物体若被密度比本身大任何物体若被密度比本身大2倍以上物质所包围或倍以上物质所包围或 浸没时，电镜下反差得到加强而形成负反差。浸没时，电镜下反差得到加强而形成负反差。第31页第31页第32页第32页二二.负染色样品制备负染色样品制备含有一定浓度和纯度含有一定浓度和纯度悬浮液悬浮液（一）直接取样法：（一）直接取样法：用于含杂质少而含有一定浓度样品用于含杂质少而含有一定浓度样品1.生长在固体培养基上微生物：用接种环刮下配成生长在固体培养基上微生物：用接种环刮下配成 双蒸馏水悬浮液即可滴样或沾样。双蒸馏水悬浮液即可滴样或沾样。2.放线菌孢子：双蒸馏水从菌体上洗下成悬液即可滴样放线菌孢子：双蒸馏水从菌体上洗下成悬液即可滴样。3.皮肤疱疹（水痘等）用毛细管穿刺取样，直接滴膜皮肤疱疹（水痘等）用毛细管穿刺取样，直接滴膜。4.植物染病体：切碎后双蒸馏水悬浮半晌即可沾样。植物染病体：切碎后双蒸馏水悬浮半晌即可沾样。需保持活体植物，刺破表皮处滴加蒸馏水，需保持活体植物，刺破表皮处滴加蒸馏水，待病毒游离出来即可沾样。待病毒游离出来即可沾样。第33页第33页负染色样品制备（二）样品提纯法：用于杂质较大材料二）样品提纯法：用于杂质较大材料1.离心提纯法离心提纯法：用于血清、粪便、尿样、痰液、用于血清、粪便、尿样、痰液、活组织、植物研磨破碎悬浮液活组织、植物研磨破碎悬浮液低速离心：低速离心：25003000rpm,10min,弃沉淀（细胞碎片）弃沉淀（细胞碎片）高速离心：高速离心：15000rpm,60min,取沉淀适当稀释即可沾样取沉淀适当稀释即可沾样。2.透析提纯法：透析提纯法：除去盐类杂质除去盐类杂质样品滴在漂浮在水面膜是甲醛蒸汽固定1520分钟静置透析3二十四小时捞网染色3.琼脂过滤提纯法琼脂过滤提纯法：琼脂板琼脂板样品样品膜膜琼脂过滤琼脂过滤20分钟分钟蒸馏水漂浮剥离蒸馏水漂浮剥离捞膜染色捞膜染色第34页第34页(三三)病毒样品浓缩办法病毒样品浓缩办法1.红血球吸附法红血球吸附法：用于多数黏液病毒和副黏液病毒浓缩用于多数黏液病毒和副黏液病毒浓缩病毒悬液与等量红血球混合静置病毒悬液与等量红血球混合静置5分钟使病毒粒子吸附于红血球上；分钟使病毒粒子吸附于红血球上；低速离心（低速离心（1000转下列）转下列）15分钟，弃上清；分钟，弃上清；加入少许生理盐水，低温（加入少许生理盐水，低温（4）静置）静置34小时使病毒释放于溶液中；小时使病毒释放于溶液中；取该悬浮液即可滴膜负染。取该悬浮液即可滴膜负染。吸附吸附离心离心分离悬浮分离悬浮滴染滴染2.细胞低渗释放法细胞低渗释放法将培养细胞刮下低速离心，弃上清；将培养细胞刮下低速离心，弃上清；在沉淀中加入在沉淀中加入4倍体积蒸馏水，使细胞因低渗膨胀破倍体积蒸馏水，使细胞因低渗膨胀破 裂而释放出病毒，再快速冻融多次；裂而释放出病毒，再快速冻融多次；再低速离心，取上清液滴膜负染。再低速离心，取上清液滴膜负染。3.抗体抗体病毒凝结法：形成病毒凝结法：形成“病毒病毒抗体抗体”复合物离心浓缩，复合物离心浓缩，取沉淀制成悬浮液样品即可负染色。如：风疹病毒、取沉淀制成悬浮液样品即可负染色。如：风疹病毒、肝炎病毒。肝炎病毒。4.植物染病体：低温保留植物染病体：低温保留研磨破碎研磨破碎离心离心上清液负染色上清液负染色第35页第35页四四.负染色负染色剂剂密度比生物样品大四倍以上重金属盐类密度比生物样品大四倍以上重金属盐类(一一)负染色剂特性负染色剂特性:含有较高电子密度和散射能力；含有较高电子密度和散射能力；较高熔点；较高溶解度，不易析出沉淀；分子小易较高熔点；较高溶解度，不易析出沉淀；分子小易 渗入；化学稳定而不与样品发生化学反应渗入；化学稳定而不与样品发生化学反应。(二二)惯用负染色剂及其特点惯用负染色剂及其特点 1.磷钨酸磷钨酸(PTA)、磷钨酸钾、磷钨酸钾(KPT)、磷钨酸钠、磷钨酸钠(NaPT)特点：特点：颗粒细，反差好，图象背景洁净颗粒细，反差好，图象背景洁净;溶液：溶液：13%水溶液水溶液(pH6.07.2),稳定便于长期保留稳定便于长期保留;应用：应用：多数病毒样品，对黄瓜花叶病毒、弹状病毒、苜蓿花叶多数病毒样品，对黄瓜花叶病毒、弹状病毒、苜蓿花叶 病毒等产生破坏作用。病毒等产生破坏作用。2.醋酸铀醋酸铀：特点：特点：图象结构细节好，反差较强，破坏作用小；易污染样品；图象结构细节好，反差较强，破坏作用小；易污染样品；溶液：溶液：0.51%水溶液水溶液(pH4.24.5),见光不稳定，保留期短。见光不稳定，保留期短。第36页第36页（二）惯用负染色剂（二）惯用负染色剂3.甲酸铀：甲酸铀：适合用于含有螺旋对称结构病毒颗粒，能显示出病毒适合用于含有螺旋对称结构病毒颗粒，能显示出病毒蛋白质亚基结构。惯用蛋白质亚基结构。惯用0.51%水溶液，极不稳定，水溶液，极不稳定，不宜保留，须现配现用不宜保留，须现配现用。4.钼铵酸：钼铵酸：适于有界膜生物样品，反差较弱，性能稳定，破坏性适于有界膜生物样品，反差较弱，性能稳定，破坏性小，惯用小，惯用12%水溶液，用盐酸或氨水调至水溶液，用盐酸或氨水调至pH4.09.0，可长期保留，可长期保留。5.硅钨酸：类似于磷钨酸，惯用硅钨酸：类似于磷钨酸，惯用12%水溶液，中性水溶液，中性 偏碱。偏碱。第37页第37页滤纸滤纸滤纸滤纸五五.负染色操作办法负染色操作办法1.滴染法滴染法样品样品2.漂浮法漂浮法染色液染色液染色液染色液3.喷雾法喷雾法：样品与染色液混合，喷洒在载网膜上样品与染色液混合，喷洒在载网膜上。长处：样品分布均匀；长处：样品分布均匀；缺点：样品和染色液消耗量大，易造成病毒扩散缺点：样品和染色液消耗量大，易造成病毒扩散。样品吸附样品吸附23分钟分钟滤纸吸取滤纸吸取多出样品多出样品滴染色液滴染色液吸去染液吸去染液干燥后干燥后镜镜 检检2分钟分钟水膜未干第38页第38页六六.影响负染色效果原因影响负染色效果原因1.染色时机染色时机：水膜刚消失水膜刚消失样品样品未完全干燥未完全干燥时染色效果最好时染色效果最好2.样品纯度：样品纯度：3.样品浓度样品浓度：4.酸碱度：染色液酸碱度应当与样品酸碱度靠近酸碱度：染色液酸碱度应当与样品酸碱度靠近。5.必须做对照染色：以排除假象必须做对照染色：以排除假象样品中杂质会影响观测效果样品中杂质会影响观测效果浓度小找样困难，浓度大则易造成样品堆积浓度小找样困难，浓度大则易造成样品堆积成团，影响观测效果成团，影响观测效果。磷钨酸普通磷钨酸普通pH值值6.07.0；醋酸铀、钾酸铀；醋酸铀、钾酸铀pH值为值为4.05.2较好。较好。个别样品个别看待个别样品个别看待。第39页第39页七、负染色技术应用：七、负染色技术应用：微粒样品快速鉴定：类病毒、病毒粒子，生物大分子（蛋白质分子或结晶、核酸分子展层技术）。第40页第40页第41页第41页第42页第42页SARS呼肠病毒呼肠病毒第43页第43页