肿瘤基因及其调控机制专家讲座.pptx

肿瘤基因及其调控机制肿瘤基因及其调控机制肿瘤基因及其调控机制第1页第一节第一节 癌基因癌基因一、癌基因基本概念一、癌基因基本概念 逆转录病毒研究对于说明人类癌症发生机理含有主要意义。逆转录病毒基因组中除了病毒本身复制所必需基因，如编码病毒关键蛋白（gag）、外壳糖蛋白（env）及逆转录酶（pol）等基因外，还包含一个能引发细胞恶性转化基因。这种基因就是现在为人们 所熟知癌基因（oncogene，onc）。肿瘤基因及其调控机制第2页 因为最初是在病毒中发觉，所以称之为病毒癌基因（v-onc）。以后发觉，在许多动物正常细胞中都存在着与 v-onc 相对应DNA序列，称之为原癌基因（protooncogene）或细胞癌基因（c-onc)肿瘤基因及其调控机制第3页 现有资料表明：细胞癌基因与病毒癌基因基本上是同源，但用DNA测序技术可查明，在二者之间能够有一个或几个碱基正确差异。所以现在认为，细胞癌基因是病毒癌基因前体，而病毒癌基因则是细胞癌基因转导翻版；肿瘤基因及其调控机制第4页 细胞癌基因在长久进化过程中极为保守，在无脊椎动物（假如蝇）基因组中就能够找到与哺乳动物细胞癌基因基本上同源序列。所以实际上在正常情况下，细胞癌基因不但对机体无害，而且可能在发育过程中，以至于对生命维持起着重大作用：肿瘤基因及其调控机制第5页 细胞癌基因在正常细胞中能够有低水平表示，而在癌组织中与其相对应活化癌基因表示水平却比它高多。肿瘤基因及其调控机制第6页二、癌基因分类二、癌基因分类 较早期分类是依据癌基因产物在细胞内定位，将其区分为胞质癌基因和核癌基因两大类。伴随癌基因数量增加，这一分类显得不够完善。近年来，人们趋向于用癌基因蛋白结构与功效及其在细胞内定位来进行分类。肿瘤基因及其调控机制第7页 按照这一标准癌基因可分为五大类：生长因子类生长因子类 酪氨酸激酶类酪氨酸激酶类 丝氨酸苏氨酸激酶类丝氨酸苏氨酸激酶类 GTP结合蛋白（结合蛋白（G蛋白）类蛋白）类 核结合蛋白类核结合蛋白类肿瘤基因及其调控机制第8页 Demezuk（1991）对癌基因作了全方面综述，列出了87种癌基因，并进行了分类。鉴于近年来又有一些新癌基因和抑癌基因出现，对此作了一些增补。现以其资料为基础，对五举癌基因分别介绍以下：肿瘤基因及其调控机制第9页 1.生长因子类：生长因子类：属于这异类有sis,int-2等五个癌基因。特点是其产物与一些生长因子极为相同：比如，猴肉瘤病毒v-sis癌基因蛋白产物p28与血小板生长因子（PDGF）链几乎完全相同。所以sis蛋白可模拟PDGF同其受体结合，刺激细胞过分增殖。肿瘤基因及其调控机制第10页 受病毒感染细胞可向周围分泌生长因子，后者又反过来向分泌它细胞连续发放增殖信号，最终造成细胞癌变。这种癌变过程中独特现象称为“自分泌”（autocrine)。小鼠乳腺瘤病毒（MMLV）int-2癌基因产物gp27-34类似于成纤维细胞生长因子（FGF），其过分表示可诱发小鼠乳腺新月形癌。肿瘤基因及其调控机制第11页2.酪氨酸激酶类：酪氨酸激酶类：属于这一类癌基因较多，现在较明确有21 种。依据其功效差异，还可分成两个亚类：细胞表面生长因子受体细胞表面生长因子受体 膜结合酪氨酸激酶膜结合酪氨酸激酶肿瘤基因及其调控机制第12页 细胞表面生长因子受体：细胞表面生长因子受体：包含erbB-l，erbB-2/HER/neu等7个癌基因。禽成红细胞瘤（AEV）病毒癌基因erbB-l蛋白产物pl70与上皮细胞生长因子受体（EGFR）氨基酸序列高度同源。所以，它可模拟EGFR进行工作。即使在没有外源性刺激时，也能不停地使胞内靶蛋白发生酪氨酸激酶反应，从而连续地向细胞核发放增殖信号，造成细胞过分增殖。肿瘤基因及其调控机制第13页 ErbB-2蛋白产物pl85也与EGFR类似。猫肉瘤病毒癌基因fims蛋白产物gp105165 则与集落刺激因子（CSF-l）受体相同。肿瘤基因及其调控机制第14页 膜结合酪氨酸激酶：膜结合酪氨酸激酶：包含src-l，abl等14个癌基因。Rous肉瘤病毒（RSV）癌基因src-l蛋白产物 pp60是第一个被人们分离，并研究得最多癌蛋白，分子量为 60 kD，长 526个氨基酸残基，分布在质膜内侧。pp60是专一地使蛋白质分于中酪氨酸残基发生磷酸化蛋白激酶，称为酪氨酸专一性蛋白激酶（用P-tyr表示）。肿瘤基因及其调控机制第15页 在正常细胞中，P-tyr仅占总蛋白磷酸化13000（其余由丝氨酸专一性蛋白激酶磷酸化，占90，还有10由苏氨酸专一性蛋白激酶磷酸化），而在被RSV转化细胞中，P-tyr升高了 10倍。本亚类中其它癌基因产物也含有 P-tyr活性。前述 erbB-l等生长因于受体均含有P-tyr活性，因而推测本亚类癌基因也可能参加细胞生长调控。肿瘤基因及其调控机制第16页 已知有一个含酪氨酸粘着斑蛋白（vinculin）是 pp60 P-tyr蛋白激酶底物之一。它位于质膜内侧吸附斑中，而组成细胞骨架微丝结构肌动蛋白束恰好固定在吸附斑上。在正常细胞中，粘着斑蛋白磷酸化仅占该蛋白磷酸化1，而在转化细胞中则上升至20 。同时发觉在RSV转化细胞株中吸附斑大量降低，其肌动蛋白束结构遭到严重破坏。肿瘤基因及其调控机制第17页 Pp60 P-tyr另一个与细胞骨架相关靶蛋白是p36，它结合在含有微管蛋白，肌动蛋白和肌球蛋白细胞骨架上，它酪氨酸被 pp60 P-tyr磷酸化后也可造成细胞骨架破坏。由此可见，RSV病毒转化细胞中src癌基因过分表示，是造成细胞骨架微丝、微管系统破坏主要原因。肿瘤基因及其调控机制第18页 3.丝氨酸苏氨酸激酶类丝氨酸苏氨酸激酶类：关于这类癌基因只列举了raf-1,mos和pim-1三种，它们蛋白产物都是定位于胞质丝氨酸苏氨酸专一蛋白激酶，与第二信使CAMP调整系统有亲密关系。已知有一个CAMP依赖性蛋白激酶就是丝氨酸专一性蛋白激酶，含有传递CAMP信号及调整基因表示作用。肿瘤基因及其调控机制第19页 4.GTP结合蛋白类结合蛋白类 这类包含ras族H-ras，K-ras，N-ras三个癌基因，以及在垂体及卵巢肿瘤中发觉gsp癌基因。ras族癌基因是当前研究得最多癌基因。从人体肿瘤分离到活化癌基因都属于ras族，其基因产物p21ras蛋白分子量约21kD，长188189个氨基酸残基，分布于质膜内侧。含有GTP依赖GTPase活性，其一级结构和生化特征和“G蛋白”十分相同。肿瘤基因及其调控机制第20页 G蛋白是媒介多肽激素受体信号与细胞内效应器腺苷环化酶之间偶联因子，经过激活或抑制腺苷环化酶活性直接或间接地调整cAMP浓度，进而调控细胞生长。ras族原癌基因可能象G蛋白一样参加腺苷环化酶信号系统调控。ras族癌基因在12，13或61位氨基酸残基点突变将使 p21ras失去水解活性，并使细胞过分增殖。肿瘤基因及其调控机制第21页 5.核蛋白类：核蛋白类：属于这一举癌基因有myc,myb,fos等12个。其中研究得最为详尽是 c-myc。c-myc最早发觉于禽粒细胞瘤病毒（AMV）中，并广泛分布于从酵母到人基因组中。它含有 3个外显子，编码一个含439个氨基酸，分子量为62kD蛋白质。该蛋白定位于细胞核内，属DNA结合蛋白，可同单链或双链DNA结合。肿瘤基因及其调控机制第22页 c-myc 表示含有组织专一性，细胞周期特异性和发育阶段特异性。在正常组织中 c-myc 可有低水平表示，而在大多数实体肿瘤中，其表示显著增高。在癌前病变和一些良性肿瘤中，也可见到表示增高。普通认为，c-myc 扩增是造成原癌基因活化主要路径。肿瘤基因及其调控机制第23页 以上资料表明，c-myc蛋白可能是一个调控细胞增值和分化调控蛋白，它能够识别和结合到基因组中特定识别序列，并活化那些与细胞增殖和分化相关基因。c-myb 也有类似性质，主要在造血细胞分化一些特定阶段表示，而在一些造血系统肿瘤中其表示可增高。肿瘤基因及其调控机制第24页 近年来陆续发觉了一些新癌基因，它们在癌变过程中起着主要作用：int-2 jun met PCNA Ki-67核抗原核抗原 mdm2 肿瘤基因及其调控机制第25页 int-2 定位于 7q31，编码分子量为 27kD蛋白，该蛋白部分结构与成纤维细胞生长因子含有同源性。它含有刺激表皮细胞生长作用，但需要与其它基因协同才能完成细胞恶性转化。Int-2基因扩增率在乳腺癌中达19，但扩增倍数不高。普通认为，该基因高表示与肿瘤转移，复发和预后不良相关。肿瘤基因及其调控机制第26页 jun 定位于lp3132，编码分子量39kD蛋白。蛋白定位于核内。Jun与随即发觉junB，junD都是核转录因子，与c-fos形成转录调整复合物，其蛋白产物FOSJun能与其它反式因子如视甲醛受体（RAR）、糖皮质激素等相互竞争，对转录起调整作用。肿瘤基因及其调控机制第27页 met 定位于7p31，其转录产物有各种，分别为9.0,7.0,6.0,5.0和3.2kb mRNA。蛋白产物主要有两种，分别为 ppl40-145met肝细胞生长因子受体和 pp65tpr-met活化融合蛋白。最初确定其为转化基因是在以MNNG处理人骨肉瘤细胞系中，因为l号染色体tpr序列插入到7号染色体 met基因形成tpr-met重排而使其活化。肿瘤基因及其调控机制第28页 其主要功效为促进肝细胞生长及诱发细胞转化。c-met基因活化与各种肿瘤发生相关，其活化机理主要为扩增和重排。现已证实，9.0 kb c-met mRNA及其蛋白产物在胃癌和肝癌等肿瘤中表示高出正常组织许多倍，而且表示程度与预后相关。肿瘤基因及其调控机制第29页 PCNA 增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是一个在细胞增殖周期中合成和表示36kD蛋白质，主要在G1后期及S早期在核仁中合成并在细胞核内聚集，所以进入细胞周期正常细胞和肿瘤细胞都含有PCNA。采取PCNA单抗定位研究PCNA，能够作为判断细胞增殖情况和预后一个伎俩。肿瘤基因及其调控机制第30页 Ki-67核抗原核抗原 Ki-67存在于增殖细胞核内，在G1中期开始表示，S期和 G2期增多，M期到达高峰，G0期细胞阴性，所以Ki-67在调整细胞增殖中起主要作用。用免疫组化法证实，癌组织中阳性细胞数显著高于正常细胞和良性肿瘤，所以对判别良恶性病变有一定实际意义。Ki-67表示水平高低与肿瘤预后之间也有亲密关系。肿瘤基因及其调控机制第31页 mdm2 mdm2基因最初是从一个含有双微体（DM）自发转化 BALB3T3细胞系中克隆出来一个高度扩增基因，定位于12ql314上，该基因全长由2372个碱基对组成，编码区全长1473个碱基，编码一个长度为491个氨基酸践基蛋白质，分子量为90kD。肿瘤基因及其调控机制第32页 动物试验己证实，mdm2可使细胞转化并含有成瘤性。在一些恶性软组织肿瘤，骨和脑肿瘤中发觉了mdm2扩增，说明其可能与这些肿瘤发生相关。mdm2癌基因不但可经过扩增而直接致癌，而且可作用于抑癌基因p53使正常p53失活而间接致癌。肿瘤基因及其调控机制第33页三三、癌基因活化机理、癌基因活化机理 细胞癌基因存在于正常细胞中，但在正常情况下并不表现出致癌性，只有在各种外因和内因作用下使细胞癌基因活化，才能造成肿瘤发生，癌基因活化机理可能各种多样，但主要有以下6种：肿瘤基因及其调控机制第34页1.转导（转导（transduction）2.点突变（点突变（point mutation）3.插入突变（插入突变（insertional mutation)4.易位易位(translocation)5基因扩增（基因扩增（gene amplification）6.基因甲基化改变基因甲基化改变 肿瘤基因及其调控机制第35页 1.转导（转导（transduction）在漫长生物进化过程中，现在逆转录病毒祖先在感染正常细胞同时，经过复杂遗传学重组和突变，将正常细胞细胞癌基因整合到其基因组中，并使之改变成活化病毒癌基因。带有病毒癌基因逆转录病毒在感染适当动物时，可使之发生肿瘤。肿瘤基因及其调控机制第36页 2.点突变（点突变（point mutation）美国 Weinberg，Wigler和 Cooper等试验室于 1983 年分别从不一样膀胱癌细胞系中分离DNA，用以转染NIH3T3细胞系，可使之发生恶性转化。从转化细胞中已分离到活化癌基因分子克隆，并证实其与Harvey鼠肉瘤病毒癌基因 （v-Ha-ras）非常相同。肿瘤基因及其调控机制第37页 在人类正常细胞中也发觉了其对应物(c-Ha-ras),Barbacid与Weinberg研究组分别发觉，膀胱癌中活化癌基因与其对应正常癌基因之间只有一个碱基正确差异，即(c-Ha-ras)基因第一个外显子(exon)所编码多肽链氨基端第 12位密码子上发生了有突变，其鸟瞟呤被胸腺嘧啶所取代，使其编码甘氨酸被氨酸所取代。这一单个碱基正确点突变，看来就是正常细胞癌基因变成活化癌基因关键。肿瘤基因及其调控机制第38页 3.插入突变（插入突变（insertional mutation)逆转录病毒中慢病毒本身不含有癌基因，但能以前病毒形式插入到宿主细胞癌基因邻近而将其激活。肿瘤基因及其调控机制第39页 在这方面最经典例子是禽白血细胞增多症病毒（AW）。新生雏鸡在感染ALV后612月才产生肿瘤，在癌前期观察到法氏囊中大量细胞受到病毒感染，而且ALVDNA插入到不一样细胞基因组不一样位点。肿瘤基因及其调控机制第40页 不过，在肿瘤细胞中前病毒DNA却存在于全部细胞基因组同一位点，说明它们是由ALVDNA插入基因组适当位点一个细胞所形成克隆。在肿瘤细胞中ALVDNA可发生部分缺失，但最少项保留一部分。肿瘤基因及其调控机制第41页 Hayward等深入证实，在大多数肿瘤中 ALV前病毒插入到细胞癌基因5端，并处于相同转录方向。ALV前病毒长末端序列（LTR）经常缺失或失活，所以可能其 3端 LTR为转录提供强有力开启子，从而产生大量与前病毒DNA相连c-myc序列。肿瘤基因及其调控机制第42页 在有些情况下，前病毒虽插入到c-myc5端，但处于相反转录方向，或插入到3端而处于相同转录方向。这两种情况也可加强cmvc转录，但其作用机理尚不太清楚。肿瘤基因及其调控机制第43页 同时CooPer等发觉，从这类肿瘤中提取DNA可转化NIH3T3细胞，但奇怪是，从中分离到转化基因既不是ALVDNA，也不是活化c-myc，而是位于另一位点片段，称之为Blym，它编码一个分子量约为7kD多肽。由此可见，在诱发肿瘤中最少包括两个癌基因活化。肿瘤基因及其调控机制第44页 4.易位易位(translocation)在人类巴基特淋巴瘤细胞系中，发觉第8号染色体长臂远端片段易位至第2，22和14号染色体一定部位。肿瘤基因及其调控机制第45页 现有资料证实，这些部位分别含有免疫球蛋白轻链Ig,Ig 和以及重链 IgH基因。因为这些部位经常进行着活跃转录，能够提供强有力开启子，而易位第8号染色体片段已证实含有细胞癌基因c-myc,能够被相邻开启子活化。肿瘤基因及其调控机制第46页 还有资料指出易位c-myc3端与免疫球蛋白基因3端相连。这一情况类似于上述ALV前病毒插入，即c-myc插入到开启子下游，但处于相反转录方向。肿瘤基因及其调控机制第47页 5基因扩增（基因扩增（gene amplification）在人慢粒白血病细胞系（HL-60）中，发觉了 c-myc扩增，表现为双微体（dounle minutes，DMs）和均染区（Homogeneous staning region,HSR）形成，可经过原位杂交法加以证实。肿瘤基因及其调控机制第48页 6.基因甲基化改变基因甲基化改变 在肿瘤细胞中可发觉癌基因和抑癌基因甲基化改变，表现为癌基因低甲基化或去甲基化，或抑癌基因异常甲基化。有报道在胃癌细胞中发觉了c-Ha-ras癌基因低甲基化，而低甲基化可造成c-Ha-ras癌基因过分表示。肿瘤基因及其调控机制第49页第二节第二节 抑癌基因抑癌基因 抑癌基因 (antioncogene)过去常称之为肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene）。关于抑癌基因存在概念由来以久，人们最初从肿瘤细胞染色体特定部位缺失推测它存在。肿瘤基因及其调控机制第50页 细胞遗传学发展在这方面提供了深入证据。当用正常细胞同肿瘤细胞杂交，或将某一条正常细胞染色体导人肿瘤细胞中时，观察到肿瘤细胞恶性表型受到抑制，从而推测在正常细胞染色体上存在着抑癌基因。肿瘤基因及其调控机制第51页 但最终确定其存在，必须分离到抑癌基因，并对其结构与功效进行详细分析。1986l987年国际上有3个试验室成功地分离到第一个抑癌基因Rb基因cDNA克隆从而使抑癌基因研究进入了分子生物课时代。肿瘤基因及其调控机制第52页 近年来又陆续发觉了一些新抑癌基因。当前对抑癌基因尚无明确分类，但近年来因为抑癌基因数量增多，而其中一些基因在功效上与传统抑癌基因有很大不一样，为便于了解起见，现将其分成两大类：肿瘤基因及其调控机制第53页表现为丧失功效抑癌基因（传统抑癌基因）Rb基因基因 FAP 相关抑癌基因相关抑癌基因 p53基因基因 p21Cipl基因基因 p73基因基因 p27Kipl NF1基因基因 FHIT基因基因 WT1基因基因 PTEN ErbA基因基因 Kreyl基因基因 DPC4基因基因 INK4基因基因肿瘤基因及其调控机制第54页 参加DNA修复抑癌基因（新发觉抑癌基因）错配修复基因错配修复基因 BRCA1基因基因 ATM基因基因肿瘤基因及其调控机制第55页 一一、表现为丧失功效抑癌基因、表现为丧失功效抑癌基因1.Rb基因基因 视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)是婴幼儿眼恶性肿瘤中最常见一个。大量研究资料证实，位于人类细胞第13号染色体长臂13ql4区域视网膜母细胞瘤易感基因（retinoblastoma susceptibility gene，Rb）缺失或失活，是造成肿瘤发生主要原因。肿瘤基因及其调控机制第56页 肿瘤基因及其调控机制第57页 Rb基因在遗传学上是隐性，即必须两个等位基因同时缺失形成所谓缺失纯合子，或一个等位基因缺失而另一基因突变而失活，才能造成基因功效丧失。肿瘤基因及其调控机制第58页 等位基因缺失或失活可由以下情况引发：染色体丢失（染色体丢失（13-）染色体部分缺失（染色体部分缺失（13q-）等位基因突变（等位基因突变（13qRB I3qrb）肿瘤基因及其调控机制第59页所以，肿瘤细胞基因型有以下几个可能性：13qrb13qrb 13qrb 13q-13qrb 13-13q-13q-13-13-肿瘤基因及其调控机制第60页 相关脂酶 D（esterase D，ED）研究究揭示了一个饶有兴趣现象。一些视网膜母细胞瘤患者红细胞脂酶D活性只有正常人二分之一，而在瘤细胞中则其活性为0。肿瘤基因及其调控机制第61页 这一现象提醒，脂酶D基因与Rb基因紧密连锁，Rb基因缺失造成脂酶D活性对应下降。肿瘤基因及其调控机制第62页 同时提醒，在体细胞中可能只有一个等位基因缺失，而另一个则是正常，其基因型可能是 13q-l3RB。体细胞中正常等位基因如发生突变而失活，则可造成肿瘤发生，其基因型变成13q-l3rb。肿瘤基因及其调控机制第63页 脂酶D研究不但为说明肿瘤发生机理提供了有力依据，更主要是，脂酶D基因与Rb基因紧密连锁，为Rb基因分离铺平了道路。Lee等于1987年首次成功地分离到了Rb基因cDNA分子克隆：肿瘤基因及其调控机制第64页 以脂酶D基因组DNA分子克隆为起点，将其两侧远端 DNA片段作为探针，用染色体步移（Chromosome walking）方法从人胚视网膜和胎盘cDNA文库中筛选 Rb相关基因。肿瘤基因及其调控机制第65页 经过重复筛选，取得了一个与脂酶 D相邻，编码 46kb mRNA基因，定名为视网膜母细胞瘤易感基因，简称Rb基因。肿瘤基因及其调控机制第66页 检验了6例视网膜母细胞瘤病人，发觉其中2例基因完全不表示，其它4例则表示下降，而且表示mRNA分子长度降低至4.0kb左右，对进行序列分析结果表明，它编码一个含816氨基酸残基蛋白，经计算机检索未发觉与该基因同源序列。肿瘤基因及其调控机制第67页 以后各国学者对Rb基因结构与功效进行了大量研究：现已明确，Rb基因基因组DNA总长为200kb，有27个外显子，转录为 4.7kb mRNA，编码含 928氨基酸残基蛋白质，其分子量为110114kD。肿瘤基因及其调控机制第68页 常见三种蛋白产物分子量分别为 110kD 未磷酸化形式 112kD 磷酸化形式 114kD 肿瘤基因及其调控机制第69页 其磷酸化程度在细胞周期中发生周期性改变：G0 期、G1期 蛋白未磷酸化 S期、G2期 大多数蛋白已磷酸化 肿瘤基因及其调控机制第70页 Rb蛋白磷酸化程度与细胞周期调整因子cde2cde28活性呈正相关。未磷酸化型Rb蛋白可能是抑制细胞增殖活性型。肿瘤基因及其调控机制第71页 Rb基因可与一些肿瘤病毒转化蛋白形成稳定复合物，其中包含SV40抗原，腺病毒EIA蛋白和人乳头瘤病毒E6/E7蛋白，故可能对肿瘤病毒转化起抑制作用。肿瘤基因及其调控机制第72页 Rb蛋白还能够对细胞内转录因子、生长因子起调控作用：肿瘤基因及其调控机制第73页 研究资料表明，在正常细胞内可能存在着Rb蛋白靶蛋白。比如，细胞内谷胱甘肽S转移酶能同Rb基因LT/EIA结合，这种结协议Rb蛋白生长抑制功效相关。一旦Rb蛋白同SV40或腺病毒基因组对应部位结合，或在位点发生了点突变，就可能丧失其生理功效。肿瘤基因及其调控机制第74页 转录因子E2F也能与Rb蛋白形成复合物，故Rb蛋白可经过一样机理来调整E2F因子转录活性。肿瘤基因及其调控机制第75页 另外，Rb基因可抑制细胞内癌基因表示。比如，用Rb基因转染NIH/3T3细胞可抑制c-fos癌基因在G1晚期表示。肿瘤基因及其调控机制第76页 Rb蛋白还可经过同c-myc，N-myc，erbB-2neu等癌基因产物相结合来调整细 胞增殖和分化。肿瘤基因及其调控机制第77页 2P53基因基因 在过去十几年里，人们对p53基因认识经历了一个漫长历程:最初是经过在鼠类细胞中p53蛋白与DNA肿瘤病毒抗原结合而发觉。肿瘤基因及其调控机制第78页 随即克隆到了p53基因，并证实它能转化鼠类细胞，而且发觉在恶性转化哺乳动物细胞中，p53基因表示增高。这些资料提醒，p53作用类似于myc或ras，所以可能是一个癌基因。肿瘤基因及其调控机制第79页 伴随研究深入，发觉了一些矛盾现象。在对大肠癌、肺癌、乳腺癌等实体瘤进行大量细胞遗传学研究时发觉，第17号染色体短臂经常丢失。按照Knudson关于抑癌基因作用模式推测，丢失染色体片段中可能存在着抑癌基因。肿瘤基因及其调控机制第80页 因为己知p53基因定位于17p13.1，所以有 可能成为等位基因丢失靶基因所以对肿瘤细胞中残留等位基因进行了序列分析，发觉绝大多数残留p53等位基因己经经历了点突变。这种等位突变模式表明，p33基因很可能象 Rb基因那样，是一个抑癌基因。肿瘤基因及其调控机制第81页 深入研究表明，能够使鼠类细胞发恶性转化基因实质上是突变型p53基因，而野生型p53基因不但不诱发转化，相反地能抑制转化。肿瘤基因及其调控机制第82页 依据现有资料，基因全长1620 kb，由11个外显子组成产生长25kbmRNA，编码含393个氨基酸残基蛋白，分子量为53 kD。肿瘤基因及其调控机制第83页 蛋白有5个高度保守区，分别位于第1319、117142、171192、236258及270282密码子区域。基因突变大多数发生于外显子，与上述保守区基本相符。肿瘤基因及其调控机制第84页检验等位基因缺失或突变可采取以下几个方法：限制性 DNA片段长度多态性分析 单链 DNA构型多态性分析 直接 DNA测序肿瘤基因及其调控机制第85页 限制性限制性 DNA片段长度多态性（片段长度多态性（restriction DNA fragment length polymorphism,RFLP）分析：）分析：提取 DNA，用适当限制性内切酶酶解，再用电泳分离。正常细胞两个等位基因是杂合，因而显示不一样带型。假如有一个等位基因缺失，就会显示单一带型，这种现象称为杂合性丢失（loss of heterozygosity,LOH）；肿瘤基因及其调控机制第86页 单链单链 DNA构型多态性（构型多态性（single Strand conformation polymorphism,SSCP）分析）分析：正常细胞在变性后，经聚丙烯酸胺凝胶电泳，展现一定带型。如其中某一个单链发生了突变，就可使单链构型发生改变，结果使其电泳速度发生改变，造成额外电泳带出现；l 肿瘤基因及其调控机制第87页 直接直接 DNA测序：测序：因为突变经常发生于第 58外显子，故可设计这 4个外显子上下游引物进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增，然后分别进行 DNA测序（DNA sequencing）。用这一技术不但能够测定等位基因缺失或突变性质，还可对其进行准确定位。肿瘤基因及其调控机制第88页 正常野生型p53（wtp53）基因转录产物不稳定，半衰期仅20分钟，而突变型p53（mp53）半衰期则延长至1.47小时，所以如用原位杂交或免疫组化方法来检测，则不能检测到wtp53。而只能检测到mp53mRNA和蛋白。肿瘤基因及其调控机制第89页 只有wtp53蛋白才含有抑癌活性，mp53蛋白则不但丧失了抑癌活性，而且还能与wtp53蛋白结合使其丧失抑癌功效。所以当一个p53等位基因发生突变时，就足以使细胞展现恶性表型。肿瘤基因及其调控机制第90页 这一点与必须两个等位基因同时失活不一样，说明p53基因突变遗传型是显性。这一特殊遗传学现象称之为显性负效应（dominant negative effect）。肿瘤基因及其调控机制第91页wtp53基因功效是多方面，主要有以下几面：转录因子活性 wtp53信号区功效 肿瘤基因及其调控机制第92页 转录因子活性转录因子活性 p53蛋白是一个转录因子，可经过转录活化区与通用转录因子（multisubunit transcription factor,TF11D）结合并相互作用。肿瘤基因及其调控机制第93页 TF11D是TATA结合蛋白（TATA binding protein.TBP）和 TBP相关因子（TBP associated factor,TAF）结合而成复合物。与TF11D中TAF结合，TF11D再经过TBP与其下游基因开启子中TATA box结合而发挥作用。肿瘤基因及其调控机制第94页 wtp53转录活性受腺病毒EIB蛋白及癌基因产物MDM2蛋白抑制。MDM2经过与wtp53转录活性区相互作用而起到抑制mp53活性作用。肿瘤基因及其调控机制第95页 wtp53信号区功效信号区功效 此区34个氨基酸中有12个脯氨酸，含5个脯-X-X-脯重复序列，产生一个SH-3区结合部位。wtp53基因基因借助于 SH-3区结合活性，把它同信息传递通道直接联络起来，激活一些靶基因如 p21WAFIcip1转录活性。肿瘤基因及其调控机制第96页 WAF1蛋白产物p21是细胞周期调整因子，可有效抑制细胞周期蛋白依赖性激酶活性，从而阻断细胞周期演进。肿瘤基因及其调控机制第97页 总之，wtp53正是经过其转录活性和信号传递功效而发挥其抑癌功效，主要表现为调整细胞周期和诱导细胞凋亡(将在其它章节中详细加以叙述)。肿瘤基因及其调控机制第98页 3.p73基因基因 p73基因发觉极为偶然。Kaghad等于1997年在利用针对IRS-l结合区寡核苷酸探针与COS细胞cDNA文库进行杂交分析中，检出一假阳性克隆它与IRS-l结合区无任何同源性，却与p53基因大部分保守序列均同源。依据此序列编码蛋白分子量，将其命名为p73基因。肿瘤基因及其调控机制第99页 利用荧光原位杂交技术将基因定位于lp36区。此区域因为在神经母细胞瘤及其它各种肿瘤细胞中常发生缺失因而被认为可能存在着某种抑癌基因。肿瘤基因及其调控机制第100页 p73基因由13个外显子和 12个内含子组成，其表示产物p73蛋白与 p53蛋白有同源性：p73蛋白和 p53蛋白一样含有4个主要功效区，其氨基端转录激活结构域与p53 29同源，中部 DNA结合结构域与 p53 63同源，p53 6个突变热点p73也完全保守，寡聚结构域有38同源，而羧基端则未检出显著同源。肿瘤基因及其调控机制第101页 迄今共发觉6种p73基因转录剪切变异体，它们分别为:p73 p73 p73 p73 p73 p73 肿瘤基因及其调控机制第102页 p73 由 636个氨基酸残基组成，是全长 p73蛋白，p73 则由 499个氨基酸残基组成，这是因为 p73基因转录时将外显子 13剪切而缺失了96个氨基酸残基，并造成开放读框改变。p73 除了最终 5个氨基酸残基为其所特有外，其余均与 p73 对应序列完全相同。肿瘤基因及其调控机制第103页 即使哺乳动物 p53蛋白与 p73蛋白羧基端没有显著同源性，不过人 p73 蛋白羧基端与最近在无脊椎动物中发觉p53蛋白同源，说明p53基因可能是从更为原始“p73样”基因进化而来。肿瘤基因及其调控机制第104页 利用酵母菌杂交系统研究蛋白各种剪切变异体之间相互作用时，发觉p73蛋白形成同源二聚体能力很强，类似于 p53，而 p73 则很弱。P73 和 p73 蛋白与 p53之间有较弱异型间相互作用。肿瘤基因及其调控机制第105页 这些结果表明，p73蛋白各种剪切变异体能形成同型或异型相互作用，而且提醒这些作用有可能发生于体内，方便协调整个p53-p73系统功效。肿瘤基因及其调控机制第106页 p73基因在染色体上定位特殊性以及其蛋白产物与p53蛋白在结构上相同性，均提醒它可能是一个抑癌基因，而且可能与p53蛋白在功效上有相同性：肿瘤基因及其调控机制第107页 试验证实，p73过表示时能抑制细胞生长和诱导细胞凋亡，而其突变体则无此功效。p73还能激活部分p53靶基因，但对绝大多数p53靶基因其作用则显著弱于 p53基因。肿瘤基因及其调控机制第108页 比如 p73和 p73对 p21诱导水平分别比 p53低了6倍和 3倍。但有趣是，对一些靶基因如 14-3-3 a和 PIG7诱导水平却远远高于 p53。所以，即使p53和 p73均能诱导细胞凋亡，但二者造成调亡信号路径可能有所不一样。肿瘤基因及其调控机制第109页 另外，不一样型 p73蛋白生物功效强弱不一样，其中以p73功效最强。肿瘤基因及其调控机制第110页 伴随对p73作用分子机理研究深入，发觉了一些矛盾现象：在各种肿瘤中均检测不到p73突变，甚至在一些癌细胞中发觉了p73高表示；肿瘤基因及其调控机制第111页 p73-/-小鼠中见不到肿瘤易患现象，但却有严重发育异常，尤其是脑和免疫系统。反之，p53-/-小鼠易患肿瘤，却无显著发有异常，这提醒有一更原始基因能够替换p53而完成小鼠某阶段发育，而这个基因是否就是p73呢？肿瘤基因及其调控机制第112页 三种经典病毒癌蛋白（SV40大 T抗原、腺病毒 EIB55kD和 HPV E6）均能作用于 p53并使之失活，从而使宿主细胞发生恶性转化，却不能与p73蛋白相结合。肿瘤基因及其调控机制第113页 以上现象说明，p73抑癌和失活分子机理还有待于深入研究说明。肿瘤基因及其调控机制第114页4与家族性腺瘤样息肉病与家族性腺瘤样息肉病 (familial adenomatous polyposis,FAP）相关抑癌基因相关抑癌基因 FAP过去通常称之为家族性结肠息肉病（familial polyposis coli,FPC），是一个常染色体显性遗传病。肿瘤基因及其调控机制第115页近年来对 FAP与抑癌基因之间关系研究得较多:APC(adenomatous polyposis coli)基因基因 MCC（mutated colorectal cancer）基因）基因 DCC（deleted in colorectal carcinoma）基因）基因肿瘤基因及其调控机制第116页lAPC(adenomatous polyposis coli)基因基因 是 FAP易感基因，定位于第 5号染色体长臂（5q21），由 15个外显子及 14个内含于组成，其mRNA全长为 8535bp，编码 2842个氨基酸残基蛋白，分子量为 500kD，与酵母菌中调整 ras族癌基因基因中一个小片段有同源性。肿瘤基因及其调控机制第117页 其基因产物定位于细胞质，APC不但同FAP相关，而且同散发性结肠癌、肺癌等肿瘤相关。肿瘤基因及其调控机制第118页l MCC（mutated colorectal cancer）基因）基因 也是 FAP易感基因，定位于第5号染色体长臂（5q21），由 17个外显子 16个内含子组成，其 mRNA全长为4181bp，编码 829个氨基酸残基蛋白，分子量为 93 kD。肿瘤基因及其调控机制第119页 在染色体上与APC相邻，同 G蛋白偶联乙酰胆碱蕈毒碱受体一小片段有很高同源性。MCC不但同FAP及结肠癌相关，还同小细胞肺癌及非小细胞肺癌等相关。肿瘤基因及其调控机制第120页lDCC（deleted in colorectal carcinoma）基因）基因 定位于18号染色体长臂（18q21.3），基因全长约 370 kb其 mRNA长 1012 kb，编码含 750个氨基酸残基蛋白，分子量为 190 kD。其序列同神经细胞粘附分子有同源性。肿瘤基因及其调控机制第121页 DCC蛋白与细胞同细胞及细胞同基质之间相互关系相关。在结肠癌中可见到DCC基因丢失。肿瘤基因及其调控机制第122页 5.NF1基因基因 NF1（neurofibromatosis type l）基因是多发性神经纤维瘤易感基因，定位于第17号染色体长臂（17q11.2）。肿瘤基因及其调控机制第123页 基因全长约6okb，转录成1113kb mRNA，编码2485个氨基酸残基蛋白。NF1蛋白同ras族癌基因编码GTP酶活性蛋白有一定同源性。肿瘤基因及其调控机制第124页 NF1蛋白可能为抗增殖蛋白，表现为对 ras p21蛋白负调整和阻止 ras介导有丝分 裂信号。NF1失活足以产生良性神经纤维瘤，但在恶变时可能还有别基因参加。肿瘤基因及其调控机制第125页 6.WT1基因基因 WT1（Wilms tumors type 1）为Wilms瘤(肾恶性胚胎瘤)易感基因，定位于第 17号染色作短臂（17p13），基因全长约 59 kb，转录成 3kb mRNA，编码 345个氨基酸残基蛋白。肿瘤基因及其调控机制第126页 该蛋白含 4个锌指纹族，显示与特异性 DNA结合特征，能同上皮细胞生长因子受体 EGFR-l开启子区域 CGCCCCCGC序列结合，从而抑制其转录活性。肿瘤基因及其调控机制第127页 表示有发育阶段特异性及组织特异性：l在胚胎肾上皮、睾丸和卵巢，及一些造血细胞中有表示但在成人细胞中不表示。l在纯合性缺失 Wilms瘤中无 WT1 mRNA表示，但在绝大多数 Wilms瘤中呈高表示。肿瘤基因及其调控机制第128页 推测其突变基因可能也象突变型p53那样，表现出显性负效应。突变基因可过分表示，并对野生型等位基因起抑制作用。肿瘤基因及其调控机制第129页 7.ErbA基因基因 同 P53基因一样，erbA基因以前一直被认为是癌基因。用含 erb A和 erbB基因禽成红细胞增多症病毒（AEV）感染红细胞系造血细胞，可产生红白血病。肿瘤基因及其调控机制第130页 近年来研究表明，野生型erbA基因是一个抑癌基因编码正常甲状腺素受体可抑制细胞增