3D细胞培养.pptx

3D细胞培养学生：董浩学生：董浩导师：李红民老师导师：李红民老师l简要介绍简要介绍l与与2D细胞培养异同细胞培养异同l实现方法实现方法 一、简要介绍一、简要介绍1.细胞培养细胞培养 从动物活体体内取出组织，模拟体内生从动物活体体内取出组织，模拟体内生理环境，在体外孵育培养，使之生存并增理环境，在体外孵育培养，使之生存并增殖。可分为：细胞培养、组织培养、器官殖。可分为：细胞培养、组织培养、器官培养。培养。2.培养细胞的特性培养细胞的特性 1）.贴附贴附 大多数哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一大多数哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物，体外时，这些底物可以是其他细胞、定的底物，体外时，这些底物可以是其他细胞、胶原、玻璃、或塑料等。胶原、玻璃、或塑料等。生长方式：生长方式：贴附生长型贴附生长型 悬浮生长型：血细胞、癌肿细胞悬浮生长型：血细胞、癌肿细胞 CHO（中国仓鼠卵巢）（中国仓鼠卵巢）l在活体体内时各自具有其特殊的形态，在活体体内时各自具有其特殊的形态，l在体外培养时细胞常在形态上表现得比较单在体外培养时细胞常在形态上表现得比较单一化，失去其在体内原有的某些特征。一化，失去其在体内原有的某些特征。体外培养贴壁细胞形态体外培养贴壁细胞形态 上皮样细胞上皮样细胞 成纤维样细胞成纤维样细胞 l 形态上类似上皮细胞，扁平的多角形，细胞质中央处有圆形的细胞核，细胞间紧密衔接相连成片 人胚肾人胚肾-293Hela细胞细胞l 形态上类似成纤维细胞，具有长短不等的数个细胞突起，多呈梭形、不规则三角形或扇形，核为卵圆形位于靠近胞质的中央，一般不靠近相连成片而是放射状 BHKCHO肺癌肺癌 2).运动的接触抑制运动的接触抑制 正常的细胞存在不停顿的活动或移动，其外周细胞膜呈现一些特征性褶皱样活动，当两个细胞移动而互相靠近时，其中之一或两个将停止移动并向另一方向离开，在接触区域细胞膜的褶皱样活动停止，此即接触抑制，保证了细胞将不会重叠，只能形成单层。3).增殖的密度抑制增殖的密度抑制 细胞增殖形成单层时，随着细胞密度的增加，细胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也减少，同时培养液中的营养物逐渐消耗掉，形成的单层细胞将停止分裂。转化细胞转化细胞或恶性肿瘤细胞与正常细胞不同，转化细胞转化细胞或恶性肿瘤细胞与正常细胞不同，他们的接触抑制和密度抑制常常会降低。他们的接触抑制和密度抑制常常会降低。2.3D细胞培养细胞培养 细胞在生物体内时常悬浮于液体和胶体中，并且被其它细胞所围绕，形成一个复杂的微小纤维、缺口和孔洞构成的网络。其中，氧气、激素和营养物质可以运输传递，且废物可以过滤送走。并且细胞能够对化学信号或其它刺激产生反应而移动。借助于各种填充基质借助于各种填充基质（聚苯乙烯、纤维蛋 白、琼脂糖凝胶、人工基底膜、胶原蛋白等 纳米材料）在细胞培养过程中，为细胞提供在细胞培养过程中，为细胞提供 一个更加接近体内生存条件的三维环境一个更加接近体内生存条件的三维环境。可以在更为接近体内环境接近体内环境的前提下研究细细 胞间交互作用、细胞迁移、肿瘤和癌细胞与正胞间交互作用、细胞迁移、肿瘤和癌细胞与正 常细胞之间的交互作用，以及用于以细胞为基常细胞之间的交互作用，以及用于以细胞为基 础的药物检测等应用础的药物检测等应用。二、与二、与2D细胞培养异同细胞培养异同 1、基因表达变化基因表达变化l Brown University GRACE et al.l 成神经肿瘤细胞成神经肿瘤细胞 SH-SY5Yl 胶原蛋白胶原蛋白 人工基底膜人工基底膜 6孔板孔板l RNA 基因芯片基因芯片 14,564 genes 1,766l RT-PCRlIn 3D cultures：upregulated：919 known,12 unknown downregulated：823 known,12 unknown encoding proteins involved in cytoskeleton,ECM,RNA metabolism,protein metabolism,signal transduction,and other functionsFold changes 1.5-fold or greater.RT-PCR:GAPDH(三磷酸甘油醛脱氢酶三磷酸甘油醛脱氢酶)mRNA.The gene expression changes reflected influences of culture dimension.2.细胞形态学变化细胞形态学变化l Brown University GRACE et al.l 成神经肿瘤细胞成神经肿瘤细胞 SH-SY5Yl 胶原蛋白胶原蛋白 人工基底膜人工基底膜 6孔板孔板l 细胞体、轴突形态改变细胞体、轴突形态改变细胞体：细胞体：3D呈圆形，呈圆形，2D则更为扁平、多角、伸展，聚集则更为扁平、多角、伸展，聚集成细胞簇。成细胞簇。轴突：轴突：collagen I：3D比比2D长，长，p0.001，Matrigel：2D比比3D长，不显著，长，不显著，p=0.06也即，轴突在也即，轴突在2D中，中，Matrigel比比Collagen I 更长，更长，3D中相反。中相反。在在3D中，中，collagen I 常常一条长轴突，常常一条长轴突，matrigel几个短轴突几个短轴突 3.细胞移动模式变化细胞移动模式变化 美国约翰美国约翰霍普金斯大学工程师们霍普金斯大学工程师们 细胞在二维环境中生长时，细胞下侧总与表细胞在二维环境中生长时，细胞下侧总与表面接触，某些蛋白质有助于形成很多尺寸大、存面接触，某些蛋白质有助于形成很多尺寸大、存在时间长的灶性黏附，这些黏附可以持续数秒到在时间长的灶性黏附，这些黏附可以持续数秒到数分钟。细胞通常形成一个范围更广、被称为生数分钟。细胞通常形成一个范围更广、被称为生长瓣的扇状凸起，帮助细胞向前移动。长瓣的扇状凸起，帮助细胞向前移动。而细胞在三维环境中移动时，只与包围细胞而细胞在三维环境中移动时，只与包围细胞的胶原蛋白网络有轻微接触，接触部位极小，用的胶原蛋白网络有轻微接触，接触部位极小，用于调节细胞移动性的灶性黏附蛋白质的作用变得于调节细胞移动性的灶性黏附蛋白质的作用变得 不同，其外形更像纺锤状，在两端都有凸起；并不同，其外形更像纺锤状，在两端都有凸起；并且二维环境中形成的灶性黏附几乎不存在，即使且二维环境中形成的灶性黏附几乎不存在，即使存在，尺寸也会很小、存在时间非常短，不能用存在，尺寸也会很小、存在时间非常短，不能用显微镜解析。显微镜解析。由于失去黏附性和细胞移动增强是癌症的特由于失去黏附性和细胞移动增强是癌症的特征，因此，基于三维介质条件对细胞移动特征的征，因此，基于三维介质条件对细胞移动特征的研究有助于找到一个能显着降低癌细胞侵染的可研究有助于找到一个能显着降低癌细胞侵染的可能药物靶点。为更准确、更有效地开发防治癌细能药物靶点。为更准确、更有效地开发防治癌细胞扩散的抗癌药物提供信息。胞扩散的抗癌药物提供信息。三、3D细胞培养的方法 将聚苯乙烯、纤维蛋白、琼脂糖凝胶、人工基底膜、胶原蛋白等纳米材料与细胞、培养液混合形成凝胶。细胞即可在三维凝胶网络中生长。基于磁悬浮的三D细胞培养技术 M13噬菌体颗粒 纳米金 凝胶 MIO（Fe3O4,磁铁矿）细胞摄取、外加磁场、人胶质细胞 孵育孵育 洗脱洗脱 悬浮悬浮 成形成形四、应用 麻省理工学院研究人员 在3D支架上培养一种健康的成体小鼠干细胞，这种支架可以引诱干细胞以特定的方式来分化成身体组织所需的细胞类型，能够帮助研究人员获得更精确的体内细胞生长和行为的影像之外，还能够提供组织细胞培养和再生组织更有益的微小环境。直接将这种支架移植到身体中，并不会造成任何副作用。l美国约翰霍普金斯大学研究人员发现 通过3D细胞培养，可以弥补基于2D细胞培养的药物研究结果和临床研究结果存在差异的不足，有助于抗癌药物的筛选。美国俄亥俄州立大学研究人员 用3D细胞培养技术来培养包括人胚胎干细胞和结肠癌细胞在内的许多不同类型的人源细胞，来筛选抗癌药物 3D培养细胞的药物反应更加接近体内的情况，因此，在此基础上的药物筛选也更加可靠。3D InsertTM_PCL 上海复蒙基因生物科技有限公司 聚已内酯（PCL）聚合物 l 目前的技术发展趋势就是从目前的技术发展趋势就是从2D的的培养皿进化到可以代表组织和器官中培养皿进化到可以代表组织和器官中自然细胞的自然细胞的3D培养系统。培养系统。