沙门氏菌快速检测技术分析.doc

沙门氏菌迅速检测技术研究进展摘 要：沙门氏菌是食品中最常见致病菌，是导致食物中毒重要病原菌之一，严重危害人类健康安全和食品安全。老式细菌学检测耗时繁琐，不能满足当今发展需求。本文简要简介了近年来沙门氏菌迅速检测技术研究进展，并分析多种检测措施优缺陷，以期寻找一种迅速、简便、特异、敏捷，能检测绝大多数血清型沙门氏菌措施。关键词：沙门氏菌；迅速检测、免疫学技术、分子生物学技术Research Progress on the Rapid Detection of SalmonellaZhao Hui(College of Food Science and Engineering , Northwest A&F University , Yangling, Shaanxi 712100, China)Abstract：Salmonella is the most common pathogenic bacteria in food, which can cause bromatoxism and bring about hazard on human , The traditional bacteriology detections have not bee satisfied the requirement of development because of time -consuming. This review briefly introduced research progress of the rapid detection of Salmonella in recent years and analyzed the advantages and disadvantages of various detection methods，hoping to find a fast，simple，specific and sensitive method that could detect the majority serotypes of SalmonellaKeywords: salmonella；rapid detection；immunological techniques；molecular biological techniques伴随国民经济发展，食品、海产品中存在卫生隐患问题愈发严重，在世界各地食物中毒中，沙门氏菌引起中毒病例占首位或第 2 位，在中国，每年由沙门氏菌引起食物中毒事件占到所有食物中毒事件40% -60%1。沙门氏菌是常见重要食源性致病菌，它们广泛分布在河口、海水及沉积物、水产养殖等区域，寄生在海洋生物体中，通过污染动物源性食品感染人类，导致食物中毒，严重危害人体健康。目前我国食品中致病菌检查普遍采用老式细菌学检查措施和血清学措施，这些措施一般都复杂繁琐、耗时费力，大体需要 4 d6 d 才能出检查成果，难以应对突发事件发生。因此，建立某些迅速、简便、精确度高检测措施一直是沙门氏菌检测研究关键问题。伴随生物技术进步，在食源性致病菌检测领域出现了许多比老式措施更快捷、敏感性更好新技术，如免疫学检测技术和分子生物学检测技术等。本文总结了某些食品中沙门氏菌迅速检测措施，从以老式措施为基础发展到以免疫学为基础或以分子生物学为基础迅速检测措施，以期加紧检测工作进行2。1 免疫学检测技术在所有食品中沙门氏菌检测技术手段中，免疫学检测技术占有重要地位，重要是由于其价格低廉，不需要特定试验仪器，轻易在基层推广开来。免疫学技术以抗原和抗体特异性结合反应为基础，通过病原体刺激机体产生免疫球蛋白（抗体），再辅以免疫放大技术来进行检测。抗原和抗体结合反应可在很短时间内完毕，同步由于敏感标识技术及示踪技术应用，使得沙门氏菌可在较短时间内超微量而特异地检出。目前已建立沙门氏菌免疫学检测措施重要有如下几种：1.1免疫荧光技术(IFT)免疫荧光技术是根据抗原抗体反应原理, 先将已知抗原或抗体标识上荧光素,制成荧光抗体, 再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检测组织或细胞内对应抗原(或抗体) 在组织或细胞内形成抗原抗体复合物上具有标识荧光素, 运用荧光显微镜观测标本, 荧光素受外来激发光照射而发生明亮荧光（黄色或橘红色），可以看见荧光所在组织细胞，从而确定抗原或抗体性质、定位，以及运用定量技术测定含量。免疫荧光技术重要有直接法和间接法。直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧光标识抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观测成果。直接法还可以清晰地观测抗原并用于定位标识观测。赵文学3等直接将沙门氏菌固定在载玻片上,再用荧光标识抗体染色,通过荧光显微镜观测染色效果,建立了沙门氏菌直接免疫荧光检测技术,该技术染色程序简朴、操作以便,具有一定应用价值。间接免疫荧光法在实践中用途较广，是在检样上滴加已知细菌特异性抗体，待作用后经洗涤，再加入荧光标识第二抗体，一抗与结合有荧光色素二抗结合，所发出荧光可由免疫荧光显微进行检测。黄愈玲4等人进行了间接免疫荧光技术迅速检测沙门氏菌研究,试验成果表明沙门氏菌经免疫荧光染色后,其形态构造与革兰氏染色沙门氏菌相似，检测样品经丙酮固定化和一抗二抗分别作用30min后,用FITC标识物对其染色,通过荧光显微镜观测染色成果,检测成果与常规检测措施一致。此检测措施具有操作简便、精确、敏捷、迅速等长处,有较强应用价值。1.2酶联免疫吸附技术（ELISA）酶联免疫吸附技术是建立在免疫酶基础上一种新型免疫测定技术，具有特异性强、敏感性高等长处，可以在短时间内精确地将有害微生物检测出来。其基本原理是把抗原（抗体）预先结合在某种固相载体表面，然后加入受检样品和酶标抗原（抗体），使其与结合在固相载体上抗原（抗体）发生反应，形成抗原抗体复合物，经洗涤清除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物被固相载体上酶催化变为有色产物，颜色反应深浅与样品中对应抗体或抗原量呈正有关5。故可根据呈色深浅进行定性分析或通过酶标仪进行定量测定。由于酶催化效率很高，间接地放大了免疫反应成果，使测定措施到达很高敏感度。20 世纪 80 年代, 建立了抗沙门氏菌多种 O 抗原、H 抗原单抗技术,取代常规因子血清进行血清学鉴定。沙门氏菌研究者获得了4株具有沙门氏菌广谱结合特性单克隆抗体,其中2株反应互补, 对已检菌株覆盖率到达99%,而对其他受试肠杆菌均无交叉反应。文其乙6等在前人基础上应用沙门氏菌属特异性单克隆抗体 CB8和de7 建立了检测沙门氏菌直接 ELISA措施, 并形成了迅速检测试剂盒, 此外, 还应用直接 ELISA 措施对500 份蛋品检测, 成果表明该措施可靠, 且阳性率比国标措施高。田银芳等应用直接 ELISA 法对350份奶样进行沙门氏菌检测, 与常规措施相比,该法敏捷度和特异性分别为100%和 99.7%；杨爱萍等也成功地用单抗酶联试剂盒检测鲜牛奶、熟食制品等样品中沙门氏菌7。此外Wilanee8等人通过碳纳米管技术结合ELISA措施检测鼠伤寒沙门氏菌,一般ELISA检测措施敏捷度为106-107CFU/rnL,为了提高检测敏捷度,采用SWCNTs标识抗体结合HRP进行检测,敏捷度提高到103-104CFU/rnL,敏捷度提高了1000多倍9。大量试验成果表明，单抗直接法敏捷度高、特异性强，可防止人为原因导致假阴性，且能在短时间内迅速筛去大量阴性样品，检测周期短，且不需昂贵仪器，易于操作，便于推广。1.3免疫磁珠分离技术(IMS)伴随科学技术不停发展,抗体制备技术获得了重大突破,增进了免疫磁珠出现和发展。免疫磁珠分离技术是一种免疫学富集分离技术,它是以高度均一磁性微球为固相载体,免疫配基通过功能基团偶联到磁珠表面形成免疫磁球,通过抗体抗原特异性免疫学反应,在磁场力作用下,发生动力学移动,从混合溶液中富集分离目沙门氏菌10。该措施具有特异性强、分离样品快、仪器设备操作简朴等特点。IMS 法与一般细菌培养分离措施相比，可以极大地提高环境样品与食品中病原性副溶血性弧菌检出率。不过，IMS目前还存在一定局限，例如价格昂贵，且易出现交叉反应等状况，因此需要其他技术手段辅助检测。2分子生物学技术分子生物学检测技术具有高敏捷度、高特异性、迅速精确等长处,成为生物技术革命新产物,已经广泛应用于食源性致病菌迅速检测。迅速检测沙门氏菌分子生物学技术重要包括:聚合酶链反应、核酸探针、基因芯片和LAMP等先进技术。2.1聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应技术是在体外合适条件下，以DNA 为模板，以一对人工合成寡核苷酸为引物在耐热 DNA 聚合酶作用下特异性扩增目 DNA 片段技术。近年来应用 PCR 技术检测食源性致病菌技术有诸多，如常规 PCR11、多重 PCR12、实时荧光定量 PCR13等。2.1.1多重PCR多重PCR14可以在同一PCR反应体系里加入多对引物,使一次PCR反应能完毕多种样品检测,提高检测效率、减少检测成本、缩短检测周期,多重PCR在病原菌检测方面得到广泛应用。相对于老式检测措施，多重PCR 检测技术可以极大地缩短检测时间，且操作简朴、特异性和敏感度较高。邵碧英15等运用多重PCR技术对沙门氏菌进行检测,试验成果表明多重PCR措施比单一PCR愈加精确、稳定、高效、经济。采用多重PCR技术检测沙门氏菌,检出限为4.51045.5104cfu/ml,特异性为100%。不过多重PCR只能进行定性检测,对定量检测需求推进了RT-PCR技术出现。多重 PCR 技术在实际检查工作还存在某些问题：如提获得到 DNA 片段也许不完整，多组引物之间互相干扰，高浓度模板对低浓度模板产生竞争性克制以及样品中也许具有 PCR 克制物质等。2.1.2实时荧光定量 PCR（RT-PCR）荧光定量 PCR16,17不一样于其他 PCR 地方在于，它不仅实现了对 DNA 定量检测， 并且具有较高敏感性、特异性、可靠性和时效性，自动化程度高、无污染性，可以同步完毕多样品扩增及定量，合适于大批样品检测。RT-PCR18技术在PCR反应体系中加入荧光基团,通过度析荧光强度实现定量检测,并根据荧光信号积累状况实时监测PCR整个扩增进程19。RT-PCR技术在PCR扩增过程中即可检测目菌存在,不用对扩增产物进行检测,省略常规PCR技术电泳环节,防止了因电泳带来误差,提高了检测精确性,并且节省检测时间。RT-PCR与PCR技术相比,除了能进行定量检测、实时监控外,其敏捷性、特异性、反复性、检测效率都优于PCR技术,并且RT-PCR技术整个过程都由电脑控制,操作以便,一次可以处理多种样品。王荣成20杨柳21采用RT-PCR技术进行沙门氏菌检测,验证了其可行性。不过PCR检测比较昂贵,特异性引物和探针选用会影响到检测成果精确性,因此对试验人员专业技能和试验操作技能规定高,限制了其在基层应用。2.2环介导等温扩增（LAMP）环介导恒温核酸扩增法25是在PCR基础上创立一种理想手段，该技术检测克服了老式PCR固有检测时间长、轻易污染及检测成本高等缺陷，同步比老式培养检测措施快捷以便，大大节省了工作人员时间。此外，这种检测措施对检测人员技术规定较低，实际操作很简便，不需要特殊试剂和仪器设备，有助于建立成本低廉迅速筛选体系26。该措施合用于现场检测和大量样品高通量检测，在食品卫生质量检查等领域具有广阔应用前景。黄金海等27根据沙门氏菌 invA 基因核苷酸序列设计一组引物，应用环介导等温扩增技术，分别对7种不一样血清型沙门氏菌和4种非沙门氏菌进行扩增，同步建立沙门氏菌人工污染食品模型，比较了 LAMP 法与活菌计数检测敏感性与沙门氏菌培养物相比，食品中沙门氏菌检测具有更大难度直接用 LAMP 检测食品中沙门氏菌面临一种问题是不能将活菌和死菌区别开来由于检测敏捷性高，虽然是样品中存在死亡沙门氏菌 DNA 也会产生阳性成果，因此建立可以辨别死菌和活菌措施对沙门氏菌检测较为重要因此在 LAMP 检测之前，需要选择性增菌，以减少来自样品中死亡沙门氏菌 DNA 影响，从而增长了检测措施对样品生物安全评估可信度，同步也提高了食品中沙门氏菌检出率应用建立 LAMP 措施，液体样品中沙门氏菌检出下限为336mL-1，而常规PCR 检出线一般在 103105mL-1活菌水平。应用建立 LAMP 措施，经增菌培养程序后，可检出含菌量为8.25g-1阳性肉品应用LAMP措施对沙门氏菌进行检测，从检测成果来看，措施特异、敏感，可有效检测样品中沙门氏菌；检查周期短，每一批样品从样品准备到检出只需要2h，假如将增菌时间计算在内，也仅需要 15h；操作简朴，检测成本低，不需要昂贵检测设备，检测成果肉眼可见，可适应国境口岸以便快捷需要，在基层检测中易于推广，具有较高实用价值因此所建立检测沙门氏菌措施具有较高特异性与敏捷性，操作简朴、迅速，可用于沙门氏菌污染食品迅速检测。2.3基因芯片基因芯片又称DNA28芯片、生物芯片。基因芯片检测原理是杂交测序措施,即通过与一组已知序列核酸探针29杂交进行核酸序列测定措施,将多种基因寡核苷酸点样于芯片表面,微生物样品DNA经PCR扩增后标识探针,然后再与芯片上寡核苷酸点进行杂交,最终通过扫描仪定量来确定检测样品与否存在目菌30。该措施具有精确度高、敏捷度高、特异性强和迅速等特点,在包括沙门氏菌在内多种致病菌检测中具有很好应用前景。3小结伴随生物学技术发展，新食品检测技术层出不穷。这些技术与老式检测措施相比较而言，具有迅速、简便、特异性强等特点。沙门氏菌老式检测措施对于需要检测大量样本食品、卫生以及兽医部门试验室是一种沉重承担，迅速检测措施除带来检查工作自身革新外，更重要是由此而产生社会效益，如减少食品库存费用、污染等问题得以尽快处理。目前沙门氏菌迅速检测研究重要集中在 PCR、核酸杂交、免疫荧光、酶联免疫 ELISA 等措施上，但单纯每一种措施均存在诸多缺陷。如酶联免疫吸附法能防止假阴性，但敏捷度和特异性又不及PCR；常规PCR措施虽然符合迅速简便等规定，不过它易污染，假阳性高。因此，要使迅速检查技术广泛应用，扩大其检查合用范围，克服假阳性和假阴性反应，考虑生产实际应用也许性和潜在公共卫生等问题，实现互相间联用技术是十分必要。应当指出是，迅速检测措施应用并不意味着完全抛弃分离培养措施。在某些状况下，尤其是波及某些需要最终止果样品时，分离培养措施还是必不可少。总之，伴随免疫学和分子生物学发展，相信对于食品中沙门氏菌检测技术将向着快捷、特异性强、敏捷度高、经济实惠措施不停发展。参照文献1刘喆. 沙门氏菌检测技术进展J.中国动物传染病学报，20( 2) :81-86.2夏慧丽.食品中3种致病菌迅速检测措施研究进展.食品研究与开发J.,33(8):222-224.3赵文学,徐燕.直接免疫荧光法用于污水中沙门氏菌迅速检查探讨J.中国医学检查杂志,1985,2(3):31-32.4黄愈玲,李少彤,龚玉效.间接免疫荧光检测技术检测沙门菌试验研究J.热带医学杂志,10(8):935-937.5邝良德,朱晓霞,谢晓红.沙门氏菌迅速检测技术概述.湖北农业科学.,50(2):226-228.6文其乙,焦新安.直接 ELISA 检测沙门氏菌措施建立及其应用研究J.中国兽医学报.1995,15（2）:105111.7叶宇鑫.沙门氏菌分子生物学迅速检测措施研究D.广州：华南理工大学.8Wilanee Chunglok, Dyah Kinasih Wuragil, Sukunya Oaew, et al. Immunoassay based on carbon nanotubes-elthaneedn ELISA for Salmonella enterieaserovar TyPhimuriumJ. Biosensors and Bioeleetronics,(26):3584-3589.9Chunglok W, Wuragil D K, Oaew S, et al. Immunoassay based on carbon nanotubes enhanced ELISA for Salmonella enterica serovar Typhimurium J.Biosensors and Bioelectronics, ,26(8): 3584-3589.10牛瑞江. .沙门氏菌富集及ELISA检测措施研究D.南昌:南昌大学.11 Chen Z，Liao Y，Ke X，et al Comparison of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，conventional PCR and real-time PCR assays for Japanese encephalitis virus JMol Biol Rep，38: 4063 -407012XU Y G, CUI L C, TIAN C Y, et al. A multiplex polymerase chain reaction coupled with high-performance liquid chromatography assay for simultaneous detection of six foodborne pathogensJ. Food Control, , 25: 778-783.13 Fittipaldi M，Codony F，Adrados B，et al. Viable Real-Time PCR in Environmental Samples ：Can All Data Be Interpreted Directly J.Microbial Ecology，61（1）：7-12.14WANG Yuexia, SUO Biao. A new 7-plex PCR assay for simultaneous detection of shiga toxin-producing Escherichia coli O157 and Salmonella enteritidis in meat productsJ. J Verbrauchersch Lebensm, , 6(4): 441-447.15邵碧英, 陈彬, 汤敏英, 吴谦, 张体银, , 沙门氏菌多重PCR检测措施建立,食品科学, 28(10): 489-492.16RODRIGUES R, TELLES J N, ESSERE K. Development of a one step real time RT-PCR assay to detect and quantify Dugbe virus J. Journal of Virological Methods, , 176(1/2): 74-77.17LE V P, LEE K N, NGUYEN T. Development of one-step multiplex RT-PCR method for simultaneous detection and differentiation of foot-and-mouth disease virus serotypes O, A, and Asia 1 circulating in VietnamJ. Journal of Virological Methods, , 175(1): 101-108.18栗建永,赵琢,贾晓川. 食源性致病菌检测分析技术研究进展.食品研究与开发J.,34(18):110-112.19周丽民,雷永良,王小光,等. 实时荧光定量 PCR 技术在致病菌检测中应用J.标识免疫分析与临床,19(5):296-299.20王荣香,倪凯翔.荧光定量PCR迅速检测粪便中沙门氏菌措施建立及应用J1.放射免疫学杂志,23(3):356一359.21杨柳,苏明权,马越云,等.荧光定量RT-PCR检测沙门氏菌措施建立J.中国试验诊断学,15(l):17一23.25 Kim DW，Kilgore PE，Kim EJ，et al The enhanced pneumococcal LAMP assay: A clinical tool for the diagnosis of meningitis due to Streptococcus pneumoniae JPLoS One，7: e42954. doi: 10. 1371 / journal. pone004295426梁艳华.环介导等温扩增在食品致病菌检测中研究进展J.医学动物防制,29(4):391-393.27黄金海，孙跃辉，陈瑞. 食品中沙门氏菌 LAMP 迅速检测措施建立. 天 津 大 学 学 报J.,45(5):469-472.28 CALL D R, CHANDLER D P, BROCKMAN F. Fabrication of DNA microarrays using unmodified oligonucleotide probesJ. Biotechniques : 30(2), , 368-379.29McGUINNESS S, BARRY T, OGRADY J. Development and preliminary validation of a real-time RT-PCR based method targeting tmRNA for the rapid and specific detection of Salmonella J. Food Research International, , 45(2): 989-992.30郑大明,张静.基因芯片技术在食品微生物检测和研究中应用J.食品科学, 25(8): 188-190.