生技11发酵实验方案.doc

生技11、专升本13发酵实验方案
实验一 中草药栀子活性成分京尼平苷转化菌筛选（细菌）
1. 原理：
利用京尼平苷经β-葡萄糖苷酶水解后产生京尼平与谷氨酸反应生成蓝色。通过平板颜色变化来判断是否存在产β-葡萄糖苷酶的菌株。
2. 材料与仪器：
2.1. 主要仪器设备：
超净工作台、电热恒温培养箱、电子天平、250ml三角瓶、培养皿、移液管、移液枪、移液枪盒、蓝盖瓶、涂布棒、接种环（针）、1000ml烧杯、100ml烧杯、玻璃棒、离心管、高压灭菌锅、镊子
2.2. 原料与药品：
栀子、谷氨酸、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠
培养基：
分离筛选培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 鉴定培养基：牛肉膏蛋白胨培养基+栀子+谷氨酸
3. 实验方法：
3.1. β-葡萄糖苷酶的菌株筛选
3.1.1. 富集培养（初筛）（牛肉膏蛋白胨培养基）：
3.1.1.1. 实验准备：
3.1.1.1.1. 收集产酶菌株可能存在的样品：
中药港采集新鲜土样、栀子在土里培养发霉的土样
3.1.1.1.2. 仪器灭菌：
将培养皿、移液管、涂布棒、移液枪头、蒸馏水等灭菌
3.1.1.1.3. 煮栀子浸提液：
称量已粉碎栀子，加适量水煮一个小时，纱布过滤收集滤液，重复煮三到四次煮，将几次煮的滤液混合，滤液收集体积与栀子称量的量为10:1。
3.1.1.1.4. 配制牛肉膏蛋白胨培养基
按培养基配方称好，琼脂，加热溶化，分装，121摄氏度高压灭菌20min，倒平板。
3.1.1.1.5. 用梯度稀释法来分离产生菌：
取所采的土样5g，加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，振荡5min，制成土壤悬液，此时的稀释度为10-1。另取7支试离心管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度，每支离心管内加入9mL无菌水。用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液，加入到10-2离心管中混匀，再从此试管中吸取1mL加入到10-2离心管中，依此类推直至10-7离心管。分别从10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8七个稀释度的离心管中吸取100uL悬液，均匀涂布于分离培养基平板上，于30℃培养。24h后观察现象。
3.1.2. 复筛
3.1.2.1、鉴定培养基复筛
称取谷氨酸（培养基的1%，在超净工作台灭菌20min）加入到牛肉膏蛋白胨培养基中充分溶解，吸取栀子浸提液（培养基的10%）到培养基中摇匀，倒平板。
将上述富集培养的菌种涂布或划线或点种到鉴定培养基上，培养24h后观察变色圈。
3.1.2.2、分离纯化
将有透明圈的菌株挑出分离纯化
实验二、菌种的保藏和活化
一、目的和要求
　　1、了解各种保藏方法的优缺点及其适用的目标微生物。
　　2、学习并掌握几种常用的微生物菌种保藏方
二、实验原理
保藏微生物菌种的目的不仅要保存菌株的生命本身，而且还必须要尽可能地使菌株的遗传性状保持不变，同时保证其在整个保存过程中不被他种微生物污染。因此，选择一种能够长期有效且稳定的保藏微生物菌种的方法事关重要。使微生物的代谢作用降至最低程度，从而使其处于不活泼的状态，即休眠状态。就微生物本身而言，保藏就是要利用它们处于休眠状态的孢子或芽孢而进行；而从环境条件来说，就是要选用低温、干燥和缺氧等三个条。
三、实验材料
纯化好的目的菌种、40﹪甘油、EP管
四、实验步骤
1、甘油管制备：用量筒准确量取40mL试剂级丙三醇，再加蒸馏水60mL，摇匀，即为40%甘油溶液。将配置好的甘油溶液放于25mL的三角瓶中塞好棉塞，用纱布，牛皮纸包扎好，再把1-5mL的冻存管用纱布牛皮纸包扎好，在0.1±0.05Mpa，120±2℃湿热灭菌1-1.5小时，间歇灭菌3-5次，灭菌后置34±0.5℃恒温室培养24-48小时，经抽样5%做无菌试验，绝对无菌方可使用。
2、菌种保藏：取第三代纯化的菌种平板，用无菌水将目的菌洗下，用移液枪将其移入带有玻璃珠的三角瓶中振荡15min，将其倾入漏斗三角瓶上过滤，目的菌和40﹪甘油以1:1的比例放入EP管中，放入-20℃冰箱中保藏。
五、菌种复活
从冰箱中取出EP管进行解冻，解冻后在超净工作台中将保藏菌种接种于倒好培养基的平板中，首先每个EP管中取100ml菌液接种于平板中，每个管接一个平板，然后将接种好的平板于30℃的培养箱中进行培养，最后观察菌种的生长情况。
实验三 β-葡萄糖苷酶产生菌的诱变
一、菌悬液的制备
无菌状态下，将10mL 的0.9%无菌生理盐水移入牛肉膏蛋白胨培养基斜面菌种中洗脱菌种，然后经过4层纱布过滤取滤液，倒入预先灭菌的具有玻璃珠、磁力棒和90mL生理盐水的锥形瓶中，于磁力搅拌器上搅拌10min，使菌种完全分散，制成不同菌浓度的菌悬浊液，备用。
二、紫外诱变选育高产菌株
采用功率为15W,照射距离为20 cm,分别对相同浓度和体积的菌悬液进行辐射处理,照射时间分别为40、80、120、160、200、240、280、320、360、400、440、480 s,将处理过的菌悬液作梯度稀释,涂布于平板培养基上,培养后计算致死率。以致死率在80% ～90%的诱变剂量处理菌悬液,处理后涂布于筛选平板培养基（改良牛肉膏蛋白胨培养基，含10%栀子液及谷氨酸）上培养,根据变色圈的大小选育出产量高的菌株。
致死率= (对照菌落数- 处理菌落数) / 对照菌落数×100%。
三、超声波诱变选育高产菌株
采用20 kHz、200 W的超声波条件,分别对相同浓度和体积的菌悬液进行辐射处理10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 s,将处理过的菌悬液作梯度稀释,涂布于平板培养基上,培养后计算致死率。以致死率在80%～90%的诱变剂量处理菌悬液,处理后涂布于筛选平板培养基上培养, 根据变色圈的大小选育出产量高的菌株。
四、微波诱变选育高产菌株
采用脉冲频率为2450MHz，功率为800W的微波炉，分别对相同浓度和体积的单孢子悬液进行辐射处理。每次照射30s 后使平皿冷却，再进行照射，并将照射时间累计。设定不同的辐射时间为不同的微波处理剂量，相同条件非辐射菌悬液平板培养，计算致死率：
致死率=（对照菌落数- 处理菌落数）/ 对照菌落数×100%
根据致死率，以致死率超过90%的诱变剂量处理菌悬液，辐射后涂布涂布于筛选平板培养基上培养, 根据变色圈的大小选育出产量高的菌株。
注意：
1、 诱变的同时要做对照，即不照射紫外或其他射线，在同等条件下培养。
2、 紫外诱变要在没有关照的情况下进行，诱变后的培养也在黑暗的情况下培养（可用黑色塑料袋包好后，置于培养箱培养）。
实验四、发酵条件的优化
实验目的：掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。
( 一 ) 培养基成分
1、 斜面培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基
2、种子培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基液体培养基
3、发酵培养基牛肉膏蛋白胨固体培养基液体培养基
(二) 实验方法
1、菌种的复活：将菌种在无菌条件下接入斜面培养基中，30℃下恒温培养24小时 .
2、种子培养：将斜面菌株接种到种子培养基中,30℃摇床培养24小时.
3液体发酵：将培养后的种子培养基 中的菌体按 1 0 %接种量接人到发酵培养基 (25 0 m L 三角瓶装2 5m L培养液,12 1 ℃ 灭 菌 2 0分 钟 ),3 0 ℃,摇床18 0转／分,培小72时,取出发 酵液,4000rpm/ mi n 离心 1 0分钟,收集上清液,测转化率。
5液体发酵培养基的优化
（1） 不同碳源对转化率的影响：分别以麸皮，玉米粉，蔗糖，淀粉，麦芽糖为碳源，发酵培养，测酶活，选着最佳碳源，在以不同浓度优化.
（2） 不同氮源对转化率的影响：分别以硫酸铵，蛋白胨，酵母膏，硝酸钠，尿素为氮源，发酵培养，测酶活，选着最佳氮源，再以不同浓度优化.
（3） 磷酸盐对转化率的影响：分别在发酵培养基中加入0，0.1%、0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%的磷酸钾进行优化
（4） 发酵起始PH优化;将起始PH分别调至4，5,6,7,8进行发酵，选着最适PH值。
（5） 正交试验确定最佳转化率条件.
6发酵条件的优化
（1） 发酵温度的优化：发酵温度分别控制在26℃,28℃,30℃,32℃，34℃下培养，选着最适发酵培养温度。
（2） 摇床转速的优化;在最适温度下，分别以140ｒ/miｎ,160ｒ/miｎ,180ｒ/miｎ,200ｒ/miｎ,220ｒ/miｎ下发酵培养，选着最佳转速。
（3） 接种量的优化：接种量分别为5%，10%，15%，发酵培养，选着最佳接种量.
（4） 培养时间的优化：分别培养3,4，5,6,7,8,9天，测转化率，选着最佳发酵时间.
（5） 装液量的优化：分别装25ｍｌ,40ｍｌ,55ｍｌ,70ｍｌ,85ｍｌ,100ｍｌ培养基，进行发酵培养，选择最佳装液.
京尼平的测定方法
一、试剂配制：
(一) 精氨酸（0.2mg/ml）：称取20毫克精氨酸溶解后定溶于100容量瓶，冰箱保存备用。
二、操作步骤;
1、用无菌水冲洗斜面孢子，并用接种环不断刮斜面以使孢子悬浮充分。将其接种到加有一定量栀子浸提液（如：终浓度2%、5%）的发酵培养基中，30℃，150r/min震荡培养3d。同时以不接种的栀子浸提液发酵培养基，30℃，150r/min震荡培养3d做为空白对照（注意：若做不同栀子量的培养基水平时，要记得有针对的空白对照。如2%和5%有各自对应的空白对照。）。
2、取出发酵液，40000rpm/min高速离心10分钟，收集上清液即为京尼平样品溶液。
3、移取稀释至适当倍数的京尼平样品液2.0ml于试管中，加入2.0ml精氨酸溶液，用蒸馏水定容至10ml，在100℃水浴中反应显色10min，取出冷水冷却。未接种的空白液做同样的操作。
（稀释方法：若京尼平样品液颜色较深，则需要进行稀释。如稀释10倍：吸取1ml京尼平样品液于试管中，再加入9ml的空白对照液，吹打均匀即可。）
4、在590nm波长处以空白液调零后测定吸光值A，对照标准曲线计算京尼平的含量。
实验五 小型发酵罐上罐实验